電針額區(qū)對(duì)血管性癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬回CA1區(qū)細(xì)胞凋亡的影響

馬莉，陳玉，伍思政，肖海燕，趙鑫宇，張雪松*

（1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040）

血管性癡呆（VD）是由腦卒中（缺血或者出血）引起的一種認(rèn)知功能障礙及情感障礙的綜合征［1］。隨著我國社會(huì)不斷進(jìn)步和發(fā)展，生活條件和醫(yī)療環(huán)境不斷改善，生活習(xí)慣不規(guī)律和人口老齡化也隨之越來越嚴(yán)重，癡呆類疾病也逐漸引起社會(huì)的關(guān)注。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國有關(guān)癡呆這一疾病的發(fā)病率逐年遞增，其中VD 位居發(fā)病率排名第二，就目前而言在這些癡呆類疾病中，VD是唯一可以通過積極治療可控制和改善的。VD患者識(shí)人不清、記憶力下降、情感表達(dá)異常，使患者家庭背負(fù)了沉重的負(fù)擔(dān)［2］。VD 的發(fā)病主要是因?yàn)殚L期或者反復(fù)的腦組織缺血、缺氧，神經(jīng)元賴以生存的環(huán)境遭到破壞，使神經(jīng)元變性、凋亡等［3］。因此，如何控制、改善或修復(fù)腦組織缺血、缺氧的狀態(tài)，解決這一問題的關(guān)鍵就是腦血管再通問題。腦組織有賴于腦血管中血液的滋養(yǎng)，當(dāng)出現(xiàn)腦卒中時(shí)（主要是腦缺血），會(huì)引起血管堵塞，所以在缺血區(qū)域改善供血或者建立新的側(cè)支循環(huán)是解決該問題的可行方法［4］。本研究探討電針對(duì)VD模型大鼠的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物情況詳見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基本情況

1.2 藥物與試劑

腦復(fù)康（湖南迪諾制藥有限公司，批號(hào)：H43020666）；大鼠血管內(nèi)皮生長因子（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)：2019-10）；細(xì)胞凋亡試劑盒（Roche Molecular Biochemicals，germany，批號(hào)：11684817910）。

1.3 造模與分組

VD 模型參照采用2-VO 法。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（0.9%NaCl，15只）、模型組（0.9%NaCl，15只）、西藥組（腦復(fù)康，15 只）和電針組（2 Hz 疏密波電針，15只），造模方法見參考文獻(xiàn)［5］。

1.4 給藥

電針組：將大鼠固定在大鼠臺(tái)上（采用俯臥位），根據(jù)于致順老師頭穴分區(qū)針刺這一理論，本實(shí)驗(yàn)選取的腧穴都在大鼠額區(qū)，分別是前庭和囟會(huì)穴以及其向左、右各1寸及2寸的穴位，用脈沖電療儀連接前庭和囟會(huì)穴（參照華興邦等［6］的《大鼠穴位圖譜的研制》），給予疏密波，將這波形的頻率調(diào)至2 Hz，20 min，1 次/d，連續(xù)治療30 d。其余3組大鼠只束縛在鼠臺(tái)上20 min。

西藥組：腦復(fù)康配置為濃度40 mg/mL，大鼠給藥時(shí)，劑量為6 mL/kg，1次/d，連續(xù)治療30 d。

假手術(shù)組：0.9% NaCl 進(jìn)行灌胃，給藥體積、頻次和時(shí)間同西藥組。

模型組：治療同假手術(shù)組。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 Morris 水迷宮檢測

該實(shí)驗(yàn)包括定位航行和空間探索試驗(yàn)。該測試所需要的時(shí)間為6 d，每天測驗(yàn)8 次，上午和下午進(jìn)行測驗(yàn)次數(shù)相同。

1.5.2 血清VEGF含量檢測

按照試劑盒說明進(jìn)行嚴(yán)格操作。

1.5.3 細(xì)胞凋亡檢測

將大鼠脫頸處死取腦組織，浸入10%福爾馬林溶液中。利用TUNEL 法，查看光鏡下大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡狀態(tài)并拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件分析系統(tǒng)對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算，所有數(shù)據(jù)以±s表示，P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮檢測結(jié)果比較

2.1.1 大鼠逃避潛伏期時(shí)間比較

與模型組比較，其余3 組均低于模型組（P＜0.05），電針組與西藥組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠逃避潛伏期時(shí)間比較（±s）

表2 各組大鼠逃避潛伏期時(shí)間比較（±s）

注：與模型組比較，1）P ＜0.05；與西藥組比較，2）P ＞0.05。

組別模型組假手術(shù)組西藥組電針組n 15 15 15 15逃避潛伏期（s）53.90±4.31 39.46±2.391）42.47±3.261）40.25±1.221）2）

2.1.2 穿過平臺(tái)次數(shù)比較

與模型組比較，其余3 組均高于模型組（P＜0.05），電針組與西藥組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠穿過平臺(tái)次數(shù)比較（±s）

表3 各組大鼠穿過平臺(tái)次數(shù)比較（±s）

注：與模型組比較，1）P ＜0.05；與西藥組比較，2）P ＞0.05。

組別模型組假手術(shù)組西藥組電針組n 15 15 15 15穿越平臺(tái)次數(shù)（次）3.14±0.29 9.06±1.131）7.51±0.581）6.73±0.141）2）

2.2 各組大鼠血清VEGF含量比較

西藥組和電針組大鼠血清VEGF 含量明顯高于模型組，并且模型組高于假手術(shù)組（P＜0.05）；電針組與西藥組在血清VEGF 含量方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組大鼠血清中VEGF的含量比較（±s）

表4 各組大鼠血清中VEGF的含量比較（±s）

注：與模型組比較，1）P ＜0.05；與西藥組比較，2）P ＞0.05。

組別模型組假手術(shù)組西藥組電針組n 15 15 15 15 VEGF（pg/mL）132.53±17.21 94.66±10.071）165.80±14.191）169.41±12.521）2）

2.3 各組大鼠海馬回CA1 區(qū)錐體細(xì)胞結(jié)構(gòu)和凋亡細(xì)胞情況

錐體細(xì)胞結(jié)構(gòu)情況：假手術(shù)組可見這一結(jié)構(gòu)致密；模型組可見這一結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞核深染，結(jié)構(gòu)變得殘缺；西藥組其結(jié)構(gòu)排列比模型組稍許緊；電針組可見其結(jié)構(gòu)排列比模型組明顯致密。細(xì)胞凋亡情況：假手術(shù)組可見少量凋亡細(xì)胞；模型組可見大量凋亡細(xì)胞；西藥組和電針組可見凋亡細(xì)胞，相較于模型組而言，其數(shù)量相對(duì)較少，但高于假手術(shù)組。詳見圖1。

圖1 大鼠海馬回CA1區(qū)細(xì)胞凋亡情況（TUNEL，×400）

3 討論

VD 在中醫(yī)學(xué)中可歸屬“癡證”或者“呆病”范疇，病位在腦，腦為髓海，腦失所養(yǎng)，髓海不足，就會(huì)引發(fā)癡證的發(fā)生。引起腦失所養(yǎng)的病因有很多，比如老年腎精虧少，臟腑功能低下，髓海不足等［7］。VD 主要是因?yàn)轲鲅铚X竅，使氣血運(yùn)行不暢，腦竅無氣血滋養(yǎng)而發(fā)病。和早期老年性癡呆不同，VD 在早期是可以通過積極治療得到控制和改善的。臨床?？诜澜饎?、安理申等，這兩種藥物所代表的兩大類藥物其實(shí)都是治療阿爾茨海默病的代表藥物，還有神經(jīng)營養(yǎng)劑（腦復(fù)康）和抗精神病類藥物，這些對(duì)于血管性癡呆來說也有一定作用，但不明顯，而且長期服用，會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)［8］。中醫(yī)學(xué)對(duì)VD 的早期治療效果明顯［9］。

VD 發(fā)病究其根本原因和過程其實(shí)就是發(fā)生腦血管疾病之后，因?yàn)槟X組織缺血或者出血原因使腦血管破裂或腦血管堵塞，血液循環(huán)障礙，最終導(dǎo)致相應(yīng)神經(jīng)元受到破壞（尤其是海馬，其主要功能就是記憶，而且對(duì)缺血、缺氧十分靈敏），最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡的過程。當(dāng)腦組織一開始受到損傷時(shí)，其中心出血或者缺血區(qū)域的神經(jīng)細(xì)胞會(huì)發(fā)生變性或者凋亡，但周圍遠(yuǎn)離中心區(qū)域的部位神經(jīng)細(xì)胞要經(jīng)過1～2 d 后才出現(xiàn)退化，然后慢慢凋亡。這種逐漸自我凋亡過程是具有潛伏性的，而海馬CA1 區(qū)對(duì)這種逐漸自我凋亡過程的病理變化最為突出和明顯，尤其是海馬CA1 區(qū)的椎體細(xì)胞。當(dāng)腦血管疾病急性發(fā)作時(shí)，這種細(xì)胞凋亡程度會(huì)有高峰期，一般是1～5 d 內(nèi)，但是這種持續(xù)細(xì)胞凋亡的狀態(tài)會(huì)持續(xù)1 個(gè)月［10］。近年來研究表明，積極促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的建立，這就讓血液在新的通路得以通暢循環(huán)，使腦組織損傷得以控制和緩解，在很大程度上對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞起到了積極有效的保護(hù)作用［11］。

有關(guān)頭穴叢刺這一理論主要來源于于致順教授臨床和理論知識(shí)的總結(jié)［12］。該理論大致內(nèi)容是在對(duì)頭部進(jìn)行針刺時(shí)，其針刺局部會(huì)產(chǎn)生一種“場”，這種“場”有著直接的滲透作用，可以作用于大腦皮層和腦組織（不同腦區(qū)域?qū)?yīng)不同疾病），達(dá)到緩解相對(duì)應(yīng)癥狀的作用［13］。本實(shí)驗(yàn)研究的是VD 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，而根據(jù)頭穴叢刺這一理論，其需要針刺的部位即是前額區(qū)域，在這一區(qū)域針刺可以緩解記憶和情感障礙的癥狀，因此筆者選取的腧穴是額區(qū)的前庭等穴位。對(duì)于頭穴叢刺治療VD 的文獻(xiàn)已經(jīng)很多，但是在頭穴叢刺基礎(chǔ)上加用電針的方法，這一研究文獻(xiàn)相對(duì)較少，而且電針2 Hz 疏密波在興奮這一方面具有很大優(yōu)勢，具有促進(jìn)血液循環(huán)，消除炎性水腫等特點(diǎn)［14］。有研究表明，在腦組織受到損傷時(shí)，運(yùn)用電針治療，可以讓已經(jīng)受損的神經(jīng)傳導(dǎo)通路再次得到建立［15］。

VEGF 又稱血管通透因子，當(dāng)腦組織出現(xiàn)血液循環(huán)障礙進(jìn)而神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，因其可以促進(jìn)血管再生，形成側(cè)支循環(huán)，并且有著非常高的生物活性，這就使得血液循環(huán)得以維序，血液循環(huán)的通暢與否關(guān)系著神經(jīng)細(xì)胞的生存環(huán)境，因此VEGF 對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有著保護(hù)作用，并且它還有著極高的特殊性［16］。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腦缺血時(shí)，其中心缺血區(qū)域VEGF 含量在第1 天或者第2 天會(huì)達(dá)到最高峰，有血管結(jié)構(gòu)從周圍缺血部位向中心缺血部位延伸，7 d 后中心缺血區(qū)域VEGF 含量逐漸降低，但周圍缺血區(qū)域VEGF 含量增加，因此，當(dāng)腦缺血時(shí)，如何采取治療措施，促進(jìn)中心缺血區(qū)域VEGF 含量增加或者不持續(xù)降低以及讓周圍缺血區(qū)域VEGF 含量保持增加不降低，是目前面臨的巨大問題［17］。本實(shí)驗(yàn)表明，假手術(shù)組在血清VEGF 的含量方面明顯低于模型組，電針組（2 Hz 疏密波電針額區(qū)）和西藥組（腦復(fù)康）的血清VEGF 含量明顯高于模型組，這就說明VEGF 在VD 發(fā)病時(shí)，其含量會(huì)增加，促進(jìn)血管再生進(jìn)行自我修復(fù)，但是如果不進(jìn)行有效早期積極治療，其增加的量相對(duì)較低，自我修復(fù)的速度會(huì)相對(duì)緩慢。在水迷宮實(shí)驗(yàn)和海馬回CA1 區(qū)細(xì)胞凋亡方面，不管是電針組（電針額區(qū)），還是西藥組（腦復(fù)康），又或者是假手術(shù)組，都比模型組有優(yōu)勢。電針組（電針額區(qū)）與西藥組（腦復(fù)康）在上述觀察指標(biāo)方面比較無差異，說明在VD 治療結(jié)果上，兩者療效相當(dāng)。

綜上所述，電針額區(qū)（2 Hz疏密波電針額區(qū)）對(duì)VD的作用機(jī)制之一可能是通過調(diào)節(jié)血清VEGF，促進(jìn)腦血管再生，血液循環(huán)障礙情況得以緩解，神經(jīng)細(xì)胞的生存環(huán)境得到改善，抑制減緩細(xì)胞凋亡，神經(jīng)傳導(dǎo)通路建立，最終改善臨床癥狀。