盛岡紋癭蜂(膜翅目： 癭蜂科)雌蟲(chóng)的超微形態(tài)*

薛 爽 張?jiān)?高姍姍 王景順 張坤朋

(1.安陽(yáng)工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院 安陽(yáng) 455000； 2.河南省太行山林業(yè)有害生物野外科學(xué)觀測(cè)研究站 安陽(yáng) 456550)

櫟樹(shù)癭蜂(Oak gall wasps)是在櫟樹(shù)(Quercusspp.)上形成蟲(chóng)癭危害的膜翅目(Hymenoptera)癭蜂科(Cynipidae)癭蜂族(Cynipini)昆蟲(chóng)的統(tǒng)稱。該類害蟲(chóng)在櫟樹(shù)的枝、根、葉、花和芽等處產(chǎn)生各種形狀的蟲(chóng)癭(Abeetal., 2007； 2014; Melikaetal., 2010)，癭蜂則棲息于封閉的蟲(chóng)癭內(nèi)取食，高效截獲寄主植物的營(yíng)養(yǎng)，導(dǎo)致葉片枯黃、畸形甚至提前脫落，對(duì)樹(shù)勢(shì)及生長(zhǎng)影響很大，在林業(yè)生產(chǎn)上常常造成嚴(yán)重危害。盛岡紋癭蜂(Andricusmoriokae)是槲櫟(Q.dentata)和短柄枹櫟(Q.serrata)上的一種重要害蟲(chóng)，雌蟲(chóng)產(chǎn)卵及幼蟲(chóng)的活動(dòng)致使葉片產(chǎn)生許多蟲(chóng)癭，截取櫟樹(shù)的營(yíng)養(yǎng)(Katsudaetal., 2003; Yukawaetal., 1996)。

昆蟲(chóng)的感器在昆蟲(chóng)取食、覓偶、交配、繁殖、棲息、防御等活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用(Shields, 2008)。不同昆蟲(chóng)的感器在感器類型、數(shù)量、形狀上也各不相同，感器的超微形態(tài)越來(lái)越多地應(yīng)用于昆蟲(chóng)分類鑒定(鄧順等, 2010; 李虎等, 2018; 黃蓬英等, 2010; 徐偉等, 2019; Maetal., 2019; Xueetal., 2016)。膜翅目相關(guān)研究主要有小蜂總科(Chalcidoidea)的觸角(Rohetal., 2019)、姬蜂總科(Ichneumonoidea)的觸角、口器、產(chǎn)卵器等(黃蓬英等, 2010; 張振飛等, 2007; Gaoetal., 2007; Wuetal., 2018)，癭蜂總科(Cynipoidea)的還未見(jiàn)有相關(guān)研究。

本研究采用掃描電子顯微鏡對(duì)癭蜂總科的造癭昆蟲(chóng)盛岡紋癭蜂有性世代雌蟲(chóng)的超微形態(tài)及其復(fù)眼、觸角、口器、足和產(chǎn)卵器上的感器的種類、數(shù)量和分布等進(jìn)行研究，以明確各部分的形態(tài)和感器的類型與結(jié)構(gòu)，為盛岡紋癭蜂的分類鑒定和進(jìn)一步的綜合防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 盛岡紋癭蜂成蟲(chóng)采集

盛岡紋癭蜂蟲(chóng)癭于2019-04—2020-04在河南省安陽(yáng)市林州市平板橋鎮(zhèn)(113.75E，36.11N)槲櫟上采集。從樹(shù)上取下有蟲(chóng)癭的枝條，帶回實(shí)驗(yàn)室，放置于尼龍養(yǎng)蟲(chóng)籠中(35 cm× 35 cm× 35 cm)，定期統(tǒng)計(jì)出癭的昆蟲(chóng)種類和數(shù)量。

1.2 樣品處理

將盛岡紋癭蜂成蟲(chóng)用乙醚麻醉，然后在Carnoy’s固定液(100%酒精∶冰醋酸 = 3∶1,V/V)固定12 h，轉(zhuǎn)移至75%酒精中保存。

1.3 掃描電鏡觀察

將保存于75%酒精中的成蟲(chóng)進(jìn)行酒精梯度脫水，依次在80%、90%、95%酒精中各脫水15～20 min，100%酒精中脫水2次，每次30 min。脫水完成后進(jìn)行叔丁醇梯度置換，將樣品依次放入100%酒精和叔丁醇體積比(3∶1、1∶1、1∶3)的混合液中逐級(jí)置換，每次15 min。最后在純叔丁醇中置換30 min，后將樣品放入冷凍干燥儀的樣品槽中進(jìn)行真空冷凍干燥。注意樣品槽中叔丁醇要沒(méi)過(guò)樣品，干燥2～3 h，待其完全揮發(fā)后取出樣品。將干燥后的樣品使用雙面導(dǎo)電膠粘貼在樣品臺(tái)上，噴金后，在日立掃描電子顯微鏡S-3400 N型(Hitachi，Tokyo，Japan)15 kV 下觀察并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Imaris 7.2.3測(cè)量各種感器的長(zhǎng)度和直徑，并統(tǒng)計(jì)觸角各節(jié)各感器的數(shù)量，數(shù)據(jù)表示形式為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 盛岡紋癭蜂有性世代蟲(chóng)癭及雌蟲(chóng)整體形態(tài)

盛岡紋癭蜂幼蟲(chóng)在槲櫟的新生葉片上為害，于3月底4月初形成直徑1.44～6.26 mm的蟲(chóng)癭，使得葉片急劇皺縮，不能正常發(fā)育(圖1A)。

有性世代雌蟲(chóng)體色黑色，體長(zhǎng)2.08～2.52 mm，前翅長(zhǎng)約2.36 mm(圖1B)。盛岡紋癭蜂的頭部是其重要的感覺(jué)中心，復(fù)眼呈長(zhǎng)圓形，由多個(gè)小眼組成，較為突出(圖2A、B)； 口器為咀嚼式，下顎須和下唇須較為發(fā)達(dá)(圖2C、D)； 感覺(jué)器官觸角為絲狀，長(zhǎng)約1 400 μm，由柄節(jié)、梗節(jié)和由11個(gè)亞節(jié)組成的鞭節(jié)構(gòu)成(圖3A)。胸部著生較多微毛，具2對(duì)翅。腹部呈球形，產(chǎn)卵器較長(zhǎng)(圖1B)。

2.2 復(fù)眼的超微形態(tài)

盛岡紋癭蜂雌蟲(chóng)的復(fù)眼由多個(gè)小眼組成(圖2A)，每個(gè)小眼呈正六邊形，間隙間有錐形感器，著生于一臼狀窩中，長(zhǎng)約8 μm，基部直徑約1 μm，至端部逐漸變細(xì)(圖2B)。復(fù)眼上的錐形感器數(shù)量較少，14或15個(gè)。

2.3 口器及其感器的超微形態(tài)

盛岡紋癭蜂的口器為咀嚼式口器(圖2C、D)。上唇上著生有刺形感器、毛形感器、錐形感器和鱗形感器(圖2 D)； 錐形感器長(zhǎng)(5.36± 0.28) μm(n= 6)； 刺形感器長(zhǎng)(12.62± 0.82) μm(n= 8)； 鱗形感器基部較寬，端部分成3或4個(gè)小叉，末端較尖(圖2D)。下唇須3節(jié)，著生有數(shù)量較多的毛形感器，長(zhǎng)17～50 μm。下顎須5節(jié)，末端3節(jié)著生有許多刺形感器和毛形感器(圖2C、D)。

圖2 盛岡紋癭蜂(雌)頭部整體結(jié)構(gòu)Fig. 2 Head of A. moriokae (Female)A: 盛岡紋癭蜂的頭部側(cè)面觀Lateral view of the head; B: 復(fù)眼放大，示其上的錐形感器Magnification of the compound eye, to show a sensillum basiconicum among ommatidia; C: 口器腹面觀，示下顎須和下唇須Ventral view of the mouthpart, to show the maxillary palpus and labial palp; D: 口器上的刺形感器、錐形感器、毛形感器和鱗形感器Sensilla chaetica, sensilla basiconica, sensilla trichodea and sensilla squamiformia on the mouthpart.CE： 復(fù)眼Compound eye; MaxP： 下顎須Maxillary palpus; LP： 下唇須Labial palp; Om： 小眼Ommatidia; SB： 錐形感器Sensilla basiconica; SC： 刺形感器Sensilla chaetica; SSq： 鱗形感器Sensilla squamiformia; ST：毛形感器Sensilla trichodea. 下同The same below.

2.4 觸角的超微形態(tài)

盛岡紋癭蜂的觸角呈絲狀，長(zhǎng)約為1.37 mm，由柄節(jié)、梗節(jié)和鞭節(jié)組成(圖3A)。柄節(jié)著生在觸角基窩中，中間縊縮，端部膨大，整體呈紡錘狀(圖3B)。梗節(jié)粗壯(圖3C)。鞭節(jié)細(xì)長(zhǎng)，由11個(gè)亞節(jié)組成。觸角上分布著不同類型的感器(圖3、4， 表1)。

表1 盛岡紋癭蜂雌蟲(chóng)觸角各節(jié)感器的數(shù)量Tab.1 Number of sensilla on antennae of female A. moriokae

圖3 盛岡紋癭蜂(雌)觸角超微結(jié)構(gòu)ⅠFig. 3 Antennal ultramorphology of A. moriokae (Female)ⅠA: 觸角整體Antennae of A. moriokae; B. 柄節(jié)，基部著生刺形感器、錐形感器，末端著生大量毛形感器Sensilla chaetica and sensilla basiconica on the base of scape, and sensilla trichodea on the terminal of scape; C: 梗節(jié)，顯示毛形感器和基部的刺形感器Sensilla trichodea and sensilla chaetica on the base of pedicel; D: 柄節(jié)和梗節(jié)另一側(cè)，示其上的刺形感器和毛形感器 The other side of scape and pedicel, to show the sensilla chaetica and few sensilla trichodea; E: 第1鞭小節(jié)，密被毛形感器Sensilla trichodea on the F1. An： 觸角Antennae; Fla： 鞭節(jié)Flagella; F1—F11： 第1—11亞鞭節(jié)The first-eleventh flagellum; Ped： 梗節(jié)Pedicel; Sca： 柄節(jié)Scape. 下同The same below.

柄節(jié)基部具有刺形感器和錐形感器，縊縮處光滑，沒(méi)有感器分布(圖3B、D)； 端部膨大部位靠近復(fù)眼一側(cè)感器較少(圖3D)，而遠(yuǎn)離復(fù)眼一側(cè)密被毛形感器，長(zhǎng)(52 ± 2.83) μm(n= 13)(圖3B)。

梗節(jié)短，膨大近球形，長(zhǎng)約70 μm，基部具有刺形感器，中間有大量毛形感器，靠近復(fù)眼一側(cè)毛形感器數(shù)量相對(duì)較少(圖3C、D)。

鞭節(jié)由11個(gè)亞節(jié)組成，各節(jié)長(zhǎng)度之比為1.9∶1.7∶1.2∶1.4∶1.2∶1.3∶1.2∶1.2∶1.1∶1∶2.1，末節(jié)粗壯，端部漸收窄呈圓錐型。毛形感器在每一亞節(jié)上均有分布，長(zhǎng)22～54 μm。板形感器基部呈弧形，與觸角相連，在第3—11亞節(jié)均有分布，且數(shù)量逐漸增多； 長(zhǎng)度不等，除末節(jié)外，與所在的一亞節(jié)等長(zhǎng)或稍超出所在亞鞭節(jié)，寬約4 μm，與觸角伸長(zhǎng)方向平行(圖4A、B、D)。第7—11亞節(jié)還分布有腔錐形感器，每亞節(jié)1～3個(gè)(圖4B)，腔錐形感器的感覺(jué)椎近端部具多條縱棱，端部鈍圓(圖4C)。

圖4 盛岡紋癭蜂(雌)觸角超微形態(tài)ⅡFig. 4 Ultramorphology of antennal sensilla of A. moriokae (Female)ⅡA: 鞭節(jié)第3、4小節(jié)，顯示毛形感器和板形感器Sensilla trichodea and sensilla placodea on the third and fourth flagellomeres; B: 鞭節(jié)第9、10、11節(jié)，顯示大量的毛形感器，較多的板形感器及腔錐形感器(箭頭)Numerous sensilla trichodea, sensilla placodea, and sensilla coeloconica on the F9—F11； C: 腔錐感器放大Magnification of sensilla coeloconica; D: 第11節(jié)(遠(yuǎn)離復(fù)眼側(cè))，具錐形感器、刺形感器和板形感器 Sensilla coeloconica, sensilla chaetica and sensilla placodea on the F11(away from the compound eye side). SCo： 腔錐形感器Sensilla coeloconica; SP： 板形感器Sensilla placodea. 下同The same below.

2.5 胸部及足的超微形態(tài)

盛岡紋癭蜂的前胸背板兩側(cè)著生較多剛毛； 中胸側(cè)板光滑，邊緣具稀疏的剛毛(圖5A)。中胸背板發(fā)達(dá)突出，有明顯的2條盾縱溝，盾縱溝的外側(cè)稀疏分布著2列毛形感器(圖5B)。盛岡紋癭蜂足的基節(jié)外緣著生有毛形感器，轉(zhuǎn)節(jié)、腿節(jié)、脛節(jié)、跗節(jié)和前跗節(jié)密被毛形感器和刺形感器，中足和后足脛節(jié)的端部具有2個(gè)距，其前跗節(jié)具2個(gè)較粗壯的爪，爪上著生有1個(gè)錐形感器，長(zhǎng)(18.26 ± 2.80) μm(n= 9)，爪間有膜質(zhì)的中墊(圖5C、D)。

圖5 盛岡紋癭蜂(雌)胸部形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig. 5 Morphology of the thorax of A. moriokae (Female)A: 胸部側(cè)面觀，顯示近四方形的中胸側(cè)板，側(cè)上方的前胸背板Lateral view of the thorax, to show the quadrangled mesopleuron and lateral pronotum; B: 胸部背面觀，顯示具有2條盾縱溝(箭頭指向)的中胸背板Dorsal view of the thorax, to show the mesonotum with two complete notauli; C: 胸部后足密被毛形感器，箭頭指脛節(jié)端部的2個(gè)距Sensilla trichodea on the hind leg, with two tibial spur on the terminal of the tibia; D: 后足前跗節(jié)密被刺形感器和毛形感器，端部具2個(gè)爪，爪間有中墊，爪上具錐形感器Sensilla chaetica and sensilla trichodea on the pretarsus; hind tarsal claw and membranous arolium on the pretarsus.Cl： 爪Claw; MA： 膜質(zhì)中墊Membranous arolium; Mes： 中胸背板Mesonotum; Mspl： 中胸側(cè)板Mesopleuron; Pro： 前胸背板Pronotum; TS： 脛節(jié)距Tibial spur. 下同The same below.

2.6 盛岡紋癭蜂雌蟲(chóng)腹部及其感器的超微形態(tài)

盛岡紋癭蜂腹部光滑，基部和端部著生有少量剛毛，腹略長(zhǎng)于頭胸之和，6節(jié)，第1—3背板較寬(圖6A、B)。雌性生殖器稍突出，腹部最后一節(jié)腹板呈管狀延伸，與產(chǎn)卵鞘、產(chǎn)卵針相連(圖6A)。腹部第6側(cè)板、雌性生殖器和產(chǎn)卵器鞘上感器較多(圖6C—F)。

2.6.1 錐形感器(sensilla basiconica，SB) 頂端圓鈍，直立，長(zhǎng)3～5 μm，基部直徑0.5～1.0 μm，主要位于雌性外生殖器的內(nèi)側(cè)(圖6C)。

2.6.2 刺形感器(sensilla chaetica，SC) 頂端尖細(xì)，直立，長(zhǎng)9～12 μm，基部直徑0.5～1.0 μm，主要位于雌性外生殖器表面外緣，排成3列(圖6C)。

2.6.3 毛形感器(sensilla trichodea, ST) 呈細(xì)長(zhǎng)的毛形，長(zhǎng)35～62 μm，端部直立或稍彎曲，主要分布在腹部第6側(cè)板和產(chǎn)卵器鞘上，數(shù)量較多(圖6B、D和E)。

2.6.4 耳形感器(sensilla auricillica, SA) 表皮內(nèi)陷形成，呈一圓形腔，外緣直徑19～26 μm，腔口直徑7～10 μm，內(nèi)表面橢圓形，向內(nèi)凹陷，形成耳蝸式的結(jié)構(gòu)(圖6F)。

2.6.5 火山形感器(sensilla volcanica, SV) 分布在腹部第5側(cè)板上，與耳形感器較近，位于一個(gè)卵圓形的凹陷內(nèi)，基部寬約1.2 μm，端部鈍圓，狀如火山，長(zhǎng)約0.5 μm(圖6F)。

圖6 盛岡紋癭蜂雌蟲(chóng)腹部Fig. 6 Abdomen of A. moriokae (Female)A: 腹部整體側(cè)面觀Lateral view of the abdomen; B: 腹部腹面觀 Ventral view of the abdomen; C: 雌性外生殖器上的錐形感器和刺形感器Sensilla basiconica(SB) and sensilla chaetica(SC) on the genital(Gen); D: 產(chǎn)卵器鞘上的毛形感器Sensilla trichodea(ST) on the ovipositor sheath(OS); E: 產(chǎn)卵器Ovipositor; F: 第6腹板上的耳形感器和火山形感器A sensillum auricillicum and sensilla volcanica on the ventral of the 6th abdomen. Gen: 雌性外生殖器Gential; OS: 產(chǎn)卵器鞘Ovipositor sheath; SA: 耳形感器Sensilla auricillica; SV: 火山形感器Sensilla volcanica.

3 討論

本研究利用掃描電鏡對(duì)盛岡紋癭蜂有性世代雌蟲(chóng)的復(fù)眼、口器、觸角、足和產(chǎn)卵器的超微形態(tài)進(jìn)行了觀察，初步明確了盛岡紋癭蜂雌蟲(chóng)各部分的感器類型和形態(tài)。盛岡紋癭蜂雌蟲(chóng)復(fù)眼的小眼之間有少量錐形感器； 口器上具刺形感器、錐形感器和毛形感器； 觸角上著生有毛形感器、刺形感器、錐形感器、板形感器和腔錐形感器5種類型，其中毛形感器遍布每一節(jié)觸角，分布最廣、數(shù)量最多； 產(chǎn)卵器上有刺形感器、毛形感器、錐形感器、耳形感器、火山形感器等。

在膜翅目昆蟲(chóng)中，寄生蜂的形態(tài)學(xué)研究較多，尤其小蜂總科研究較多(黃蓬英等, 2010; 張振飛等, 2007; Gaoetal., 2007; Wuetal., 2018; Rohetal., 2019)。小蜂的感器研究多數(shù)都集中在作為天敵的小蜂觸角上，關(guān)于植食性小蜂感器的研究相對(duì)較少，目前僅張振飛等(2007)報(bào)道了刺桐姬小蜂(Quadrastichuserythrinae)的感器，黃蓬英等(2010)報(bào)道了桉樹(shù)枝癭姬小蜂(Leptocybeinvasa)的感器。本研究則是造癭昆蟲(chóng)超微形態(tài)的首次研究。

植食性小蜂與天敵小蜂的食性不同，在尋找寄主進(jìn)行定位時(shí)，也有不同的感器起作用(黃蓬英等, 2010)。與刺桐姬小蜂雌成蟲(chóng)觸角感器相比，盛岡紋癭蜂和桉樹(shù)枝癭姬小蜂的毛形感器和板形感器數(shù)量都明顯較多，在觸角表面分布密度很大，這也可能是同屬于植食性的造癭昆蟲(chóng)與植食性小蜂共同的特點(diǎn)。毛形感器在刺桐姬小蜂上只有1種，在桉樹(shù)枝癭姬小蜂上則有2種，本研究中，盛岡紋癭蜂也只有1種類型的毛形感器。

毛形感器為中空、頂端無(wú)孔、可彎的結(jié)構(gòu)，一般為毛狀，基部有窩，是昆蟲(chóng)身體各部分最常見(jiàn)的感器類型，尤其在觸角上數(shù)量較多，多種昆蟲(chóng)還常具有不同的亞型(鄒德玉等, 2009; Wuetal., 2018; Rohetal., 2019)。前人研究發(fā)現(xiàn)膜翅目昆蟲(chóng)觸角上的毛形感器為機(jī)械感器(Barlinetal., 1981)。與甘藍(lán)夜蛾赤眼蜂(Trichogrammamaidis)產(chǎn)卵器鞘上具毛形感器一樣(Le Ralecetal., 1990)，盛岡紋癭蜂產(chǎn)卵器鞘上也有毛形感器，可能在寄主選擇過(guò)程中或產(chǎn)卵過(guò)程中發(fā)揮定位作用。

刺形感器的外形一般剛直如刺，頂部鈍圓，直立于觸角表面，與毛形感器相似，但通常比毛形感器要短。一些昆蟲(chóng)觸角的刺形感器也會(huì)因長(zhǎng)、短、粗、細(xì)不同劃分為不同的亞型(余海忠, 2007; Shields, 2008)。本研究未對(duì)不同長(zhǎng)度的刺形感器劃分亞型。中柄節(jié)和梗節(jié)的刺形感器都分布于基部，而鞭節(jié)末節(jié)中也存在刺形感器但數(shù)量較少。

板形感器，又被稱為片狀感器(鄒德玉等, 2009)或帶狀感器(張振飛等, 2007)，本文術(shù)語(yǔ)沿用Wu 等(2018) 和Roh等(2019)。板形感器是一類特殊的感覺(jué)器官，一般有2種類型，一種較寬短，幾乎全部附著于觸角表面，另一種較細(xì)長(zhǎng)，只有基部的1/3到2/3附著于觸角表面(張振飛等, 2007; 黃蓬英等, 2010)。本研究中，盛岡紋癭蜂的板形感器只有一種類型，較寬短，幾乎全部附著在觸角表面上，與刺桐姬小蜂雌蟲(chóng)觸角上的板形感器形態(tài)相似，但是刺桐姬小蜂的板形感器只在觸角的腹面有分布(張振飛等, 2007)，而盛岡紋癭蜂在觸角的四周均有分布。板形感器表面有大量具壁小孔，可能是感知?dú)馕兜幕瘜W(xué)感器，且與寄主?；杂嘘P(guān)(鄒德玉等, 2009; Barlinetal., 1981)。

腔錐感器是一類具有感覺(jué)錐的孔狀結(jié)構(gòu)，是由表皮凹陷所形成。腔錐感器主要是感受外界環(huán)境的濕度，起味覺(jué)和嗅覺(jué)等作用(Meyh?feretal., 1997)。癭蜂觸角感器中腔錐感器主要分布在亞鞭節(jié)末的端部，這可能與接收化學(xué)信號(hào)、快速尋找食物有關(guān)。

關(guān)于癭蜂科昆蟲(chóng)，主要分為2種營(yíng)養(yǎng)類型： 一類為造癭昆蟲(chóng)吸取苗木汁液，危害草本和木本植物； 另一類是寄癭昆蟲(chóng)，寄住在其他類昆蟲(chóng)的蟲(chóng)癭之中，營(yíng)寄生生活。絕大多數(shù)癭蜂科昆蟲(chóng)都是造癭類，是農(nóng)林業(yè)的重要害蟲(chóng)，個(gè)別種類如栗癭蜂(Dryocosmuskuriphilus)還是檢疫性害蟲(chóng)(Aebietal., 2006)，對(duì)板栗(Castaneamollissima)生長(zhǎng)生產(chǎn)有嚴(yán)重威脅。造癭癭蜂的生物學(xué)習(xí)性研究較多(王景順等, 2017; 張?jiān)嫉? 2019)，而形態(tài)學(xué)研究尚處于空白。觸角和口器、產(chǎn)卵器等對(duì)于癭蜂尋找產(chǎn)卵地點(diǎn)和定位寄主植物，發(fā)揮著重要作用，因此研究其超微形態(tài)，探明感器結(jié)構(gòu)與功能，對(duì)防治和利用癭蜂具有重要意義。

4 結(jié)論

本文對(duì)盛岡紋癭蜂有性世代雌蟲(chóng)的復(fù)眼、口器、觸角、足和產(chǎn)卵器及其感器類型和分布進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了7種感器。但各種感器的具體功能尚不明確，尤其是分布于不同部位的同種感器的功能有何差異，尚不能得到確切的解答，還需結(jié)合電生理學(xué)試驗(yàn)和行為學(xué)觀察進(jìn)一步驗(yàn)證。