益腎安膠囊活血化瘀作用研究

趙云麗，張若松，羅曉東，郭 楓，張翔華，尚建華

(1.中國科學(xué)院昆明植物研究所 植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國家重點實驗室，云南 昆明 650201；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049；3.云南大學(xué) 教育部自然資源藥物化學(xué)重點實驗室 云南省天然產(chǎn)物轉(zhuǎn)化與應(yīng)用重點實驗室，云南 昆明 650091；4 .昆明腎臟病研究所，云南 昆明 650031)

血液的高凝狀態(tài)在腎小球腎炎的發(fā)病環(huán)節(jié)中起著不可忽視的重要作用.近年來，用活血化瘀中藥治療慢性腎炎取得了一定療效.本研究采用大鼠寒凝血瘀癥和小鼠實驗性微循環(huán)障礙模型，考察與評價益腎安膠囊的活血化瘀作用，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù).

1 實驗材料

1.1 受試藥物

益腎安膠囊，0.35 g/粒，4粒/次，3次/d，由昆明腎臟病研究所提供, 批號070501；實驗采用膠囊內(nèi)容物，為棕褐色粉末，常溫密閉保存.阿魏酸哌嗪片，國藥準(zhǔn)字H43021825，50 mg/片，湖南千金湘江藥業(yè)股份有限公司出品.腎復(fù)康膠囊，國藥準(zhǔn)字Z22024866，0.30 g/粒，4～6粒/次，3次/d，通化茂祥制藥有限公司出品.

1.2 試劑

鹽酸腎上腺素注射液，國藥準(zhǔn)字H41021054，1 mg/mL，天津藥業(yè)集團新鄭股份有限公司，批號060901；戊巴比妥鈉，進口分裝，25 g/瓶，上海化學(xué)試劑采購供應(yīng)站經(jīng)銷.肝素鈉，效價 150 u/mg，北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司.枸櫞酸三鈉，分析純，500 g/瓶，天津市化學(xué)試劑三廠.血凝測定試劑盒：PT、TT、APTT、FIB，均購自上海太陽生物技術(shù)有限公司出品.二磷酸腺苷(ADP)，0.5 g/瓶，上海伯奧生物科技有限公司.烏拉坦(化學(xué)純)，北京化學(xué)試劑公司.

1.3 儀器

F5810-R臺式高速冷凍離心機，德國eppendorf公司；MVIS全自動血液流變儀，重慶天海；LBX-NJ血液凝聚儀，北京普利生儀器有限公司；C2000-4高性能血凝儀，北京普利生儀器有限公司；WX-6微循環(huán)顯微儀，重慶天海.

1.4 動物

3～4月齡SPF級SD大鼠70只，雌雄各半，體重250～350 g；3～4周齡SPF級ICR小鼠，雌雄兼用，體重18～21 g；由昆明醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供；生產(chǎn)許可證：SCXK(滇)2005-0008，發(fā)證機關(guān)：云南省科學(xué)技術(shù)廳.飼養(yǎng)于IVC動物實驗室，溫度20～25 ℃(日溫差≤3 ℃)，濕度40%～70%，照明 12 h∶12 h 明暗交替，照度150～300 lx，噪音≤60 dB；實驗動物使用許可證：SYXK(滇)2005-0001，發(fā)證機關(guān)：云南省科學(xué)技術(shù)廳.

2 實驗方法

2.1 對大鼠寒凝血瘀癥模型的影響

SD大鼠70只，雌雄各半，按性別和體重隨機分為7組：空白對照組；模型對照組；陽性對照阿魏酸哌嗪片 0.1 g/kg 組；中藥對照腎復(fù)康膠囊 1.28 g/kg 組(相當(dāng)于臨床用量的14.3倍)；益腎安膠囊0.5、1.0、2.0 g/kg；每組10只.各組動物每日按劑量灌胃給藥1次，連續(xù) 10 d，給藥容量均為 10 mL/kg，空白和模型對照組灌服等容量純水.

參照文獻方法[1-2]，各組動物第 9 d 給藥后 1 h，除空白對照外，其余各組均皮下注射鹽酸腎上腺素 0.8 mg/kg，2 d 后將動物浸入7～8 ℃ 的冰水中置留 5 min，間隔 2 h 再以相同劑量二次皮下注射腎上腺素.造模動物次日給藥后 1 h，以 40 mg/kg 劑量腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，頸動脈插管取血，分別注入肝素鈉和枸櫞酸鈉的抗凝管內(nèi)，置于旋渦震蕩器上混勻后，分別用于血液流變學(xué)、血小板活性及凝血指標(biāo)測定[3].

肝素抗凝管用MVIS血液流變儀測定全血粘度后，以 3 000 r/min 離心 10 min，取上清液測定血漿粘度.枸櫞酸鈉抗凝管以 1 000 r/min 離心 10 min 制備富血小板血漿(PRP)，剩余部分按 3 000 r/min 離心 10 min 制備貧血小板血漿(PPP)，用LBX-NJ血液凝聚儀按比濁法測定ADP-2Na誘導(dǎo)的血小板聚集率，ADP的終濃度為 3 μmol/L；用C2000-4高性能血凝儀按試劑盒方法分別測定TT、PT、APTT及FIB.

2.2 對小鼠微循環(huán)障礙模型的影響

參照文獻[4]稍作改進，取18～22 g 小鼠80只，雌雄各半，按性別和體重隨機分為8組：空白對照；模型對照；陽性對照阿魏酸哌嗪片 0.1 g/kg；中藥對照腎復(fù)康膠囊 0.9 g/kg；益腎安膠囊0.35、0.7、1.4、2.8 g/kg；每組10只.各組動物每日分別按劑量灌胃給藥一次，連續(xù) 3 d，容積均為 20 mL/kg，空白和模型對照組給予同體積的純水.末次給藥后 30 min，以12%的烏拉坦溶液按 10 mL/kg 的劑量腹腔注射麻醉動物，固定耳廓，置于放大100倍的微循環(huán)顯微儀下，以合適的毛細血管(動、靜脈平行，為第3級分支)為觀察對象，按 0.5 mg/kg 的劑量給小鼠腹腔注射鹽酸腎上腺素造成實驗性微循環(huán)障礙模型.分別采集造型前和造型后5、10、20、30 min 的圖像，測定以下3個指標(biāo)：①微動脈管徑(A3)；②微靜脈管徑(V3)；③毛細血管網(wǎng)計數(shù)，觀察并記錄各項指標(biāo)的變化情況.

2.3 統(tǒng)計學(xué)處理

3 實驗結(jié)果

3.1 益腎安調(diào)節(jié)寒凝血瘀癥模型大鼠全血粘度

由表1可見，模型組動物全血粘度明顯升高，與空白對照組相比差異有極顯著性意義(P<0.01)，表明實驗造模成功；與模型對照組相比，陽性對照阿魏酸哌嗪片和益腎安膠囊中、低劑量組，均可明顯降低血瘀癥大鼠不同切變率下的全血粘度(P<0.05/0.01)；陽性對照腎復(fù)康膠囊及益腎安膠囊高劑量組，對全血粘度亦有降低趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異.

表1 對血瘀癥大鼠全血粘度的影響

3.2 益腎安降低血漿粘度、RBC聚集指數(shù)和電泳時間

由表2可見，與空白對照組相比，模型組動物血漿粘度明顯升高(P<0.01)、RBC電泳時間明顯延長(P<0.01)、RBC聚集指數(shù)有增加趨勢(P>0.05)，表明實驗造模成功.與模型對照組相比，陽性對照阿魏酸哌嗪片和腎復(fù)康膠囊及益腎安膠囊中、低劑量組，對血漿粘度均有降低趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異；阿魏酸哌嗪片和益腎安膠囊三劑量組，對紅細胞聚集指數(shù)有降低趨勢(P>0.05)；益腎安膠囊中劑量組能明顯縮短紅細胞電泳時間(P<0.05)，但陽性對照阿魏酸哌嗪和腎復(fù)康膠囊僅有作用趨勢(P>0.05).

表2 對血瘀癥大鼠血漿粘度、RBC聚集指數(shù)和電泳時間的影響

3.3 益腎安下調(diào)血小板聚集率

由表3可見，模型組動物血小板聚集率明顯增高，與空白對照組相比差異有極顯著性意義(P<0.01)，表明寒凝血瘀狀態(tài)可致血小板聚集性增加；與模型對照組相比，中藥對照腎復(fù)康膠囊和益腎安膠囊高劑量組，可明顯降低高凝狀態(tài)下的血小板聚集率(P<0.05/0.01)；腎安膠囊中、低劑量和陽性對照阿魏酸哌嗪組僅有降低趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異.

3.4 益腎安改善凝血指標(biāo)

由表4可見，與空白對照組相比，模型組PT、APTT、TT有縮短趨勢(P>0.05)，F(xiàn)IB明顯增加(P<0.01)；與模型對照組相比，中藥對照腎復(fù)康膠囊和益腎安膠囊中、高劑量組，對APTT和TT有延長趨勢(P>0.05)；陽性對照阿魏酸哌嗪和益腎安膠囊低劑量組對FIB有降低趨勢(P>0.05)；其余給藥組對其他指標(biāo)無明顯影響.

表3 對寒凝血瘀癥大鼠血小扳聚集率的影響

表4 對血瘀癥大鼠凝血指標(biāo)的影響

3.5 益腎安增加微循環(huán)障礙小鼠血液循環(huán)

由表5～7可見，小鼠腹腔注射 0.5 mg/kg.bw 鹽酸腎上腺素，可使耳廓微動脈和微靜脈管徑明顯收縮(P<0.01)、毛細血管網(wǎng)開放數(shù)呈減少趨勢(P>0.05)，表明實驗性微循環(huán)障礙造模成功；陽性對照阿魏酸哌嗪片和腎復(fù)康膠囊、益腎安膠囊4個劑量組，均可明顯對抗腎上腺素所致微循環(huán)障礙模型動物的微動脈和微靜脈收縮(P<0.05/0.01)；除中藥對照腎復(fù)康膠囊能明顯增加模型動物的毛細血管網(wǎng)開放數(shù)(P<0.05)外，阿魏酸哌嗪片和益腎安膠囊各劑量組僅有作用趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異.

表5 對微循環(huán)障礙小鼠耳廓微動脈管徑的影響

表6 對微循環(huán)障礙小鼠耳廓微靜脈管徑的影響

表7 對微循環(huán)障礙小鼠耳廓毛細血管網(wǎng)開放數(shù)的影響

4 結(jié)語

中醫(yī)認(rèn)為慢性腎小球腎炎時，各種致病因素極易導(dǎo)致痰濕、瘀血阻滯腎絡(luò)，腎絡(luò)不通，腎臟衰敗[5].腎絡(luò)瘀阻是貫穿慢性腎炎始終的基本病機，同時也是導(dǎo)致慢性腎炎發(fā)展和加重的根本病機.慢性腎炎病程長，“久病必瘀”“ 久病入絡(luò)為瘀血”[6].瘀血既是病理產(chǎn)物，又是致病因素.腎病可以導(dǎo)致瘀血形成，瘀血可以使腎病加重或纏綿難愈.

現(xiàn)代研究表明，在慢性腎小球腎炎的整個發(fā)病過程中，機體內(nèi)普遍存在著凝血機制的紊亂而處于高凝狀態(tài)、微循環(huán)障礙、血液流變學(xué)異常等，且對病變持續(xù)發(fā)展和腎功能進行性衰退具有重要意義.血液黏度增高可進一步促使血管內(nèi)血栓形成，引起全身或局部循環(huán)和微循環(huán)障礙，加重對腎小球的損害[7].

益腎安膠囊以0.5、1.0、2.0 g/kg 的劑量連續(xù)灌胃給藥 10 d，中、低劑量組能明顯降低寒凝血瘀癥大鼠的全血粘度，高劑量組可明顯抑制由ADP誘導(dǎo)的血小板聚集；以0.35、0.7、1.4、2.8 g/kg 的劑量連續(xù)灌胃給藥 3 d，均能明顯對抗腎上腺素致微循環(huán)障礙模型小鼠的微動脈和微靜脈血管的收縮，對毛細血管開放數(shù)有增加趨勢.提示，益腎安膠囊可通過降低血液粘度、抑制血小板集聚、改善微循環(huán)的途徑，降低血液的高凝狀態(tài)，達到活血化瘀的目的.