蒜頭果蛋白對HeLa細胞體外抗腫瘤活性及穩(wěn)定性研究

袁 燕，李艷紅，段先樂，唐永研

(1.云南民族大學 民族藥資源化學國家民委-教育部重點實驗室，云南 昆明 650504；2.云南省阜外心血管病醫(yī)院，云南 昆明 650102)

蒜頭果(MalaniaoleiferaChun et S. Lee ex S. Lee)是鐵青樹科、蒜頭果屬常綠喬木[1]，分布于中國廣西西部龍州、大新和右江流域各縣及云南東部廣南、富寧等地[2]，是廣西省和云南省特有的重點保護植物[3-4].蒜頭果是一種特殊的石山地區(qū)綠化樹種，本身就具有較高的價值，為滇東南和桂西石山綠化樹種[5].蒜頭果為單種屬稀有植物[6]，形態(tài)解剖特征既有原始性狀，又有進化特征，對于研究鐵青樹科的分類系統(tǒng)有一定的意義[7].蒜頭果種仁中含油率非常高，高達52%～67%[8]，其主要脂肪酸廿四碳-(15)-烯酸可制得麝香酮(十五內酯)[9-10]，具有非常高的經(jīng)濟開發(fā)價值[11].

由于蒜頭果是云南省和廣西省特有的瀕危植物，所以國外無資源也無相關研究.國內目前主要是從蒜頭果的育苗技術和保護、營林特性、種質資源和瀕危機制及蒜頭果油的開發(fā)利用等方面研究的比較多[12-15]，但從蒜頭果種子中分離純化蛋白質并進行抗腫瘤活性及作用機制等方面的研究尚未見報道.

本研究將蒜頭果種子去殼、搗碎、紗布過濾、離心、上清液用(NH4)2SO4沉淀并過疏水色譜層析柱，得到Malanin，采用MTT法測定其對HeLa細胞體外抗腫瘤活性并測定其與DDP聯(lián)合用藥的效果，探索Malanin的穩(wěn)定性及貯存方式，為該蛋白在腫瘤治療方面的開發(fā)利用打下基礎.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蒜頭果種子購于云南省種子公司；HeLa細胞由云南大學生命科學院提供；胰蛋白酶為華美產(chǎn)品；四甲基偶氮唑鹽[MTT]為Biom公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品；順鉑(DDP)為北京伊塔生物科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 主要儀器設備

蛋白純化系統(tǒng)(Amersham)；二氧化碳培養(yǎng)箱(SANYO)；倒置相差顯微鏡(OLYMPUS)；離心機(Eppendorf)；超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)；酶標儀(TECAN Sunrise).

1.3 實驗方法

1.3.1 蒜頭果蛋白樣品的制備

將蒜頭果種子去外殼和種皮，用高速組織搗碎機，4 ℃ 冷庫中抽提 2 h 后用4層紗布過濾，離心 30 min(8 000 r/min, 4 ℃)，棄沉淀.上清液用30%～100%硫酸銨分級沉淀，低溫離心 30 min (8 000 r/min, 4 ℃)，沉淀用 20 mmol/L pH 7.4 PBS(磷酸鹽)和 2.5 mol/L 硫酸銨緩沖液溶解和上樣，于GE AKTA Pure 100蛋白質純化系統(tǒng)上疏水色譜層析柱HiprepTM phenyl FF (High sub, 20 mL)，用0%～100% ddH2O(去離子水)按線性梯度洗脫，在 280 nm 下進行檢測，5 mL 每管自動收集[16].結果用15% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，收集目標樣品用真空冷凍干燥機凍成干粉后備用[17].

1.3.2 HeLa細胞培養(yǎng)

無菌條件下將胎牛血清加入至DMEM培養(yǎng)液(pH 7.2)中，使其終濃度為10%，混勻后備用.將HeLa細胞接種于DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)中，于二氧化碳培養(yǎng)箱(5% CO2、37 ℃)中培養(yǎng)，約2～3 d 傳代1次，取對數(shù)生長期的HeLa細胞用于后續(xù)實驗[18].

1.3.3 蒜頭果蛋白與HeLa細胞作用濃度初篩

將1.3.2培養(yǎng)的HeLa細胞用胰酶消化后，用計數(shù)板進行計數(shù)，按1.0×105個/mL細胞濃度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔 100 μL，在二氧化碳培養(yǎng)箱(5%CO2、37 ℃)中培養(yǎng) 1 d 后更換培養(yǎng)基.將 1 mg/mL 蒜頭果蛋白溶液按10倍逐步稀釋，得到6個不同濃度的蒜頭果蛋白樣品，將此樣品分別加入至96孔培養(yǎng)板中，每孔 20 μL，6個平行復孔，繼續(xù)培養(yǎng) 3 d 后于倒置顯微鏡下觀察結果[19]，預估蒜頭果蛋白與HeLa細胞作用的最佳濃度.

1.3.4 蒜頭果蛋白體外抑制HeLa細胞活性的測定

取1.3.2培養(yǎng)的HeLa細胞，用0.25%胰酶消化，計數(shù)板計數(shù)，以1.0×105個/mL細胞濃度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔 100 μL，在CO2培養(yǎng)箱(5%CO2、37 ℃)中培養(yǎng) 1 d，更換DMEM培養(yǎng)液后，每孔加入 20 μL 不同濃度的蒜頭果蛋白樣品，設6個平行復孔，繼續(xù)培養(yǎng) 72 h 后棄上清，加入 20 μL 新配制的MTT溶液(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)，4 h 后去上清，每孔加入DMSO (二甲基亞砜) 150 μL，置于微量攪拌器上振蕩 30 min，在 570 nm 波長下測定其OD值，用于定量反映細胞的活性狀態(tài)[20].用廣譜抗癌藥物順鉑(DDP)作為陽性對照[21]；以有細胞而不加蛋白的孔為陰性對照；以不加細胞和培養(yǎng)基，只加MTT和DMSO的孔為空白對照，計算抑制率.

(1)

以蒜頭果蛋白不同質量濃度的負對數(shù)(-lgρ)作為橫坐標，抑制率IC%為縱坐標，作線性回歸方程，計算蒜頭果蛋白和順鉑作用 72 h 的半數(shù)抑制質量濃度，即IC50值[22].

1.3.5 蒜頭果蛋白與順鉑聯(lián)合用藥的藥效測定

1.3.6 蒜頭果蛋白穩(wěn)定性研究

1) 蒜頭果蛋白在不同保存方式下的穩(wěn)定性

根據(jù)1.3.4的方法，測定 0.5 mg/mL 蒜頭果蛋白溶液在不同保存方式下與HeLa細胞作用 72 h 的IC50值，分析其對HeLa細胞體外生長的抑制率.

2) 蒜頭果蛋白在不同溫度處理下的穩(wěn)定性

分別將 0.5 mg/mL 蒜頭果蛋白溶液于20、30、40、50、60、70、80、90和 100 ℃ 的水浴鍋中溫浴 2 h，4 ℃ 表示 0.5 mg/mL 蒜頭果蛋白樣品貯于 4 ℃ 冰箱中，按1.3.4的方法計算在不同溫浴條件下蒜頭果蛋白溶液對HeLa細胞作用 72 h 的抑制率.

2 結果與分析

2.1 蒜頭果蛋白樣品的制備

蒜頭果蛋白純化的色譜層析如圖1所示，共得到4個組份(I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)，其中組份Ⅳ即為蒜頭果蛋白樣品，收集，備用.

圖1 蒜頭果蛋白分離純化色譜層析圖

2.2 蒜頭果蛋白與HeLa細胞定性分析

蒜頭果蛋白與HeLa細胞作用 72 h 后的細胞狀態(tài)如圖2所示.圖2 a(空白對照)中HeLa細胞貼著瓶壁呈單層緊密排列、胞體飽滿、互相交織呈簇狀生長；待蒜頭果蛋白與HeLa細胞作用 72 h 后，明顯發(fā)現(xiàn)HeLa細胞外型皺縮、圓化、體積變小、排列松散或聚集成團，部分細胞從壁上脫落懸浮在培養(yǎng)基中，繼而發(fā)生崩解，破裂成碎片(如圖2 b)，說明蒜頭果蛋白具有抑制HeLa細胞體外生長的作用.

圖2 HeLa細胞形態(tài)學觀察(20×)

2.3 蒜頭果蛋白對HeLa細胞體外抗腫瘤活性測定

MTT比色法測定結果表明，不同濃度的蒜頭果蛋白和順鉑對HeLa細胞均具有明顯的抑制作用，且隨著質量濃度的增大和作用時間的延長，蒜頭果蛋白和順鉑對HeLa細胞的抑制率明顯增大，具有劑量和時效依賴性.

以蒜頭果蛋白不同質量濃度的負對數(shù)(-lgρ)作為橫坐標，根據(jù)公式1計算的抑制率IC%為縱坐標，其線性回歸方程如圖3所示，計算得到蒜頭果蛋白Malanin和順鉑與HeLa細胞作用DDP 72 h 的半數(shù)抑制濃度(IC50值)分別為9.55×10-6、4.76×10-4g/L.由此可見，蒜頭果蛋白的IC50值明顯小于廣譜抗癌藥物順鉑，表明蒜頭果蛋白具有非常強的抗腫瘤活性.

圖3 不同濃度蒜頭果蛋白和順鉑對HeLa細胞的抑制率

2.4 蒜頭果蛋白與順鉑聯(lián)合應用的藥效測定

蒜頭果蛋白(M)、順鉑(D)、蒜頭果蛋白和順鉑聯(lián)用(M+D)對HeLa細胞的抑制率曲線如圖4.結果表明，三者的抑制率曲線隨著時間的延長都逐漸升高，表現(xiàn)出很好抑制效果，說明均具有抑制HeLa細胞體外生長的作用.蒜頭果蛋白和順鉑聯(lián)用對HeLa細胞的抑制率曲線均高于蒜頭果蛋白和順鉑單獨與HeLa細胞作用的抑制率曲線，說明蒜頭果蛋白和順鉑聯(lián)合應用具有協(xié)同抑制HeLa細胞體外生長的作用，二者聯(lián)合應用的藥效會增加.

圖4 蒜頭果蛋白、順鉑和兩藥聯(lián)用與HeLa細胞作用不同時間的抑制率

此外，根據(jù)金氏公式計算得出等于0.95，大于0.85而小于1.15，表示二者聯(lián)用效應相加(+)，說明蒜頭果蛋白和順鉑聯(lián)合應用對HeLa細胞具有協(xié)同抑制效應.

2.4 蒜頭果蛋白穩(wěn)定性研究

2.4.1 不同保存方式的蒜頭果蛋白對HeLa細胞的穩(wěn)定性

用MTT比色法測定了蒜頭果蛋白樣品在不同保存方式下與HeLa細胞作用 72 h 的抑制率，其IC50值見表1.剛從層析柱上分離純化的蒜頭果蛋白溶液立即進行HeLa細胞活性測定，其IC50值最小(3.65×10-6mg/mL)，對HeLa細胞的抑制率最高，說明活性最好.如果將此樣品溶液用真空冷凍干燥機凍成干粉、置于 -20 ℃ 冰箱中保存6個月和12個月，測定此3個樣品對HeLa細胞的活性，發(fā)現(xiàn)其活性與剛從層析柱上分離純化的蒜頭果蛋白溶液相差不大，分別為3.98×10-6、3.99×10-6和4.12×10-6mg/mL，說明蒜頭果蛋白干粉于 -20 ℃ 冰箱中保存12個月后其活性仍然很好.但如果不凍成干粉，直接將此溶液于 -20 ℃ 冰箱中保存12個月，其活性則下降了2倍多；如將此溶液反復凍、融3次，其活性則急劇下降，比原溶液活性降低了近42倍.此結果表明，貯存蒜頭果蛋白樣品最好是將其真空冷凍干燥成干粉，并分裝成小瓶于 -20 ℃ 冰箱中保存，一定要避免反復凍融.

表1 蒜頭果蛋白在不同保存方式下對HeLa細胞IC50的比較

2.4.2 不同溫度下處理的蒜頭果蛋白對HeLa細胞的穩(wěn)定性

用水浴鍋在不同溫度下處理的蒜頭果蛋白溶液對HeLa細胞的抑制率如圖5.在 4 ℃ 冰箱中保存的蒜頭果蛋白溶液與HeLa細胞作用 72 h 的抑制率高達91.7%；在 50 ℃ 水浴中處理 2 h 后，對HeLa細胞的抑制率還有57.7%；只有溫度高達 80 ℃ 時，蒜頭果蛋白變性才比較徹底，幾乎完全失活，抑制率只有9.4%.說明蒜頭果蛋白的熱穩(wěn)定性較好，非常便于在冰箱中保存.

圖5 不同溫度處理的蒜頭果蛋白對HeLa細胞的抑制率

3 結語

蒜頭果蛋白是從云南省和廣西省特有植物—蒜頭果種子中分離純化出來的一種新的蛋白質，該蛋白的物理化學性質、結構及功能都在不斷的探索中.本文采用MTT法分析蒜頭果蛋白對HeLa細胞體外增殖的影響.結果表明，蒜頭果蛋白對HeLa細胞具有明顯的抑制作用，其IC50值非常小，為 9.55×10-6g/L，明顯比廣譜抗癌藥物順鉑(IC50值為 4.76×10-4g/L)的抗腫瘤活性強；且它與順鉑聯(lián)合應用具有協(xié)同抑制效應；其穩(wěn)定性也很好，非常便于冰箱中保存.本課題組進一步研究還發(fā)現(xiàn)，蒜頭果蛋白還能誘導HeLa細胞發(fā)生凋亡，可以俘獲S期的HeLa細胞，使DNA不能正常的復制，從而導致細胞的增殖、生長受到抑制.其體內抗腫瘤活性及抗癌作用機制還在進一步研究中.