祛痰止咳膠囊對慢性支氣管炎模型大鼠的治療作用機制研究

丁云錄，南敏輪，李會影，歐喜燕，李曉兵，赫玉芳

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，長春 130021；2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，長春 130012；3.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117）

慢性支氣管炎（chronic bronchitis，CB）根據(jù)臨床表現(xiàn)，可將其歸屬于中醫(yī)“咳嗽”“痰飲”及“喘證”等范疇。呼吸道疾病的發(fā)病過程中，呼吸道內(nèi)可能存在活躍的損傷及修復(fù)機制，PMN 產(chǎn)生的許多介質(zhì)在這一過程中起重要作用，是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要效應(yīng)細(xì)胞，在機體非特異性免疫防御中起重要作用[1-2]。本研究通過建立大鼠慢性支氣管炎模型，從PMN噬吞指數(shù)、血清 IL-8、TNF-α、NO 及肺組織SP 含量等方面探討祛痰止咳膠囊治療慢性支氣管炎的可能機制，進一步確證祛痰止咳膠囊的作用靶點及治療機制，為更好地應(yīng)用于臨床提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 動物 SPF 級SD 大鼠，雌雄各半，250～280 g，合格證號：SCXK-（吉）2018-0007，購于長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 藥品及試劑 祛痰止咳膠囊，性狀：本品由黨參、水半夏、芫花、甘遂、紫花杜鵑、白礬六味中藥組方，制成硬膠囊，內(nèi)容物為褐色顆粒的或粉末，味苦，批號：20180801，吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院植物化學(xué)研究所研制提供?？却瓕幤?.41 g×24片/盒，江西藥都仁和制藥有限公司產(chǎn)品，批號：20190310）。脂多糖（Sigma，批號：DH183-1）；SP、IL-8、TNF-α、NO 酶聯(lián)免疫試劑盒（美國RD公司，批號：E20190501A）；伊紅染色液、蘇木素染色液（珠海貝索生物科技有限公司）；組織固定液（廣州維格斯生物科技有限公司，批號：18121204）。主要儀器 BIO680 酶標(biāo)儀（Japan BIO RAD 公司產(chǎn)品）；FACS Aria II 流式細(xì)胞儀（美國BD 公司）；XT-2000i 全自動五分類血細(xì)胞分析儀（日本希森美康醫(yī)用電子有限公司）；Biofuge Stratos 臺式高速冷凍離心機（德國賀利氏公司）；JB-3A 恒溫磁力攪拌器（雷茲互感器上海有限公司）；IX71倒置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS）；ZT-14V2 生物組織脫水機、YB-6LF 石蠟包埋機、YT-7FB 攤片機、YR-21 染色機（湖北亞光）；leica2255 切片機、leicaEG 1150C 冷臺（德國徠卡）。

1.3 方法[3-6］

1.3.1 分組、造模及給藥 SPF 級健康8 周齡SD 大鼠，48 只，雌雄各半，購入后，分籠飼養(yǎng)，使其適應(yīng)環(huán)境1 周。隨機分為正常對照組、CB 模型組、陽性對照藥咳喘寧片組；祛痰止咳膠囊設(shè)高、中、低3 個給藥劑量組。共6 組，每組8 只。采用煙熏聯(lián)合氣管內(nèi)注射LPS 的方法復(fù)制CB 大鼠模型。制作CB 模型的5 組大鼠放置于有機玻璃煙熏箱中，用煙葉150 g，點燃對大鼠進行煙熏，每天上午、下午各1 次，每次30 min，持續(xù)30 d；正常對照組置于常規(guī)環(huán)境中飼養(yǎng)。慢性支氣管炎組大鼠于第1、15 天給予氣管內(nèi)注入LPS，每只200 μg（1 mg/mL），正常對照組給予氣管內(nèi)注入等體積生理鹽水。大鼠于造模第2天開始給藥，分別灌胃給予祛痰止咳膠囊高劑量（1.26 g/kg）、中劑量（0.63 g/kg）、低劑量（0.315 g/kg）及咳喘寧片（1.48 g/kg）藥品混懸液，正常對照組和模型組大鼠灌服蒸餾水，給藥體積均為10 mL/kg，連續(xù)灌胃30 d。實驗中密切觀察動物的一般狀態(tài)如體質(zhì)量、毛色、精神狀態(tài)等。

1.3.2 實驗取材 實驗第30 天，給藥后1 h，麻醉大鼠，采血，1 mL 肝素抗凝，備用；余全血以3000 rpm，離心15 min，取上清液、待測。夾閉右側(cè)主支氣管，導(dǎo)入微型導(dǎo)管于氣管隆突上約1 cm 處固定，采用生理鹽水灌洗3 次，灌洗速度與回抽速度保持在1～2 mL/min，回收的支氣管肺泡灌洗液，1500 rpm 離心5 min，取上清液備用。解剖胸腔，剪取肺組織以預(yù)冷4℃生理鹽水沖洗，濾紙吸濕，稱取約0.5 g，置于EP 管，待檢；另取一組織塊置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于病理檢測。

1.3.3 指標(biāo)檢測 1）炎癥因子檢測，取血清，采用ELISA 法，按試劑盒說明書檢測 IL-8，TNF-α，NO含量。2）PMN 噬吞指數(shù)的檢測，采用流式細(xì)胞術(shù)，取各組大鼠抗凝全血，用流式細(xì)胞儀檢測PMN 熒光強度的變化，計算PMN 吞噬率。3）支氣管肺泡灌洗液中AM、NEU 及LYM 百分比檢測，取制作好的支氣管肺泡灌洗液（BALF），用全自動五分類血液細(xì)胞分析儀檢測AM%、NEU%及LYM%。4）肺組織SP 測定，取大鼠肺組織0.5 g，冷生理鹽水漂洗，濾紙吸濕，稱質(zhì)量，剪碎，加入9 倍4℃生理鹽水1 mL，勻漿，3500 rpm 離心10 min，提取上清液，嚴(yán)格按試劑盒說明采用ELISA 法測定SP 含量。5）肺組織病理形態(tài)學(xué)檢測，取固定好的肺組織切塊，石蠟包埋、切片，常規(guī)HE 染色，觀察肺組織的病理形態(tài)學(xué)改變。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。所列數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較 實驗期間，正常對照組大鼠整體情況較好，無咳嗽、氣喘等癥狀，飲食正常，活動靈敏，皮毛光亮，精神狀態(tài)較好，體質(zhì)量增長正常。模型組造模后7 d，活動后出現(xiàn)咳嗽喘息、呼吸困難等癥狀，口鼻流出黏液性分泌物，反應(yīng)略遲鈍，精神不佳，飲食減少，皮毛萎黃無光，體質(zhì)量減輕。祛痰止咳膠囊各組大鼠經(jīng)給藥治療后上述癥狀均有不同程度減輕。

2.2 各組大鼠肺組織SP 含量與PMN 噬吞指數(shù)比較 見表1。

表1 各組大鼠肺組織SP 含量與PMN 噬吞指數(shù)比較（，n =8）

表1 各組大鼠肺組織SP 含量與PMN 噬吞指數(shù)比較（，n =8）

注：與模型對照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

2.3 各組大鼠血清中TNF-α、IL-8 和NO 含量比較 見表2。

表2 各組大鼠血清中TNF-α、IL-8 和NO 含量比較（，n =8）

表2 各組大鼠血清中TNF-α、IL-8 和NO 含量比較（，n =8）

注：與模型對照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

2.4 各組大鼠支氣管肺泡灌洗液AM、NEU 及LYM百分比比較 見表3。

表3 各組大鼠支氣管肺泡灌洗液AM、NEU 及LYM 百分比比較（，n =8） %

表3 各組大鼠支氣管肺泡灌洗液AM、NEU 及LYM 百分比比較（，n =8） %

注：與模型對照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

2.5 肺組織病理檢測結(jié)果 正常組大鼠肺內(nèi)支氣管與肺泡組織內(nèi)未見炎細(xì)胞浸潤，肺內(nèi)氣道上皮未見增生增厚；肺泡上皮未見充血，未見炎細(xì)胞滲出；未見肺泡融合與擴張。模型組大鼠肺內(nèi)氣道上皮可見增生增厚，肺內(nèi)支氣管周圍可見深染的淋巴細(xì)胞為主的炎細(xì)胞聚集浸潤，肺泡組織內(nèi)可見炎細(xì)胞滲出，間質(zhì)內(nèi)毛細(xì)血管可見充血，局部可見肺泡融合與擴張。祛痰止咳膠囊1.26、0.63、0.315 g/kg 3 個劑量組均可以不同程度的減輕肺內(nèi)炎癥反應(yīng)、減輕肺內(nèi)病理形態(tài)的改變、增加肺組織的通氣量和氣體交換的能力。見圖1。

圖1 肺組織病理檢測結(jié)果

3 討論

在炎癥反應(yīng)過程中，PMN 通過表面模式識別受體與相關(guān)分子模式作用而得到激活，然后其受體與表達(dá)在血管內(nèi)皮上的配體相互作用進行遷徙，通過吞噬作用和脫顆粒作用對病原體及損傷組織進行清除[7]。由此可知，當(dāng)機體中的相關(guān)炎癥因子處于上升時，機體可能產(chǎn)生一些炎癥反應(yīng)，如機體呼吸道支氣管內(nèi)出現(xiàn)炎性分泌物，上皮細(xì)胞增厚甚至脫落，繼而出現(xiàn)咳嗽、氣喘等癥狀。在生理濃度下，肺組織P 物質(zhì)（SP）可舒張肺血管，增強血管通透性及增加血流量，但高濃度下，SP 則使舒張的肺血管發(fā)生收縮反應(yīng)，SP 水平升高可引起氣道平滑肌收縮，氣道黏膜腺體分泌增強，導(dǎo)致炎性浸潤[8-9]。本實驗中祛痰止咳顆粒能明顯降低慢支大鼠PMN 吞噬指數(shù)、SP 含量，繼而減輕模型大鼠的炎癥反應(yīng)，達(dá)到緩解臨床癥狀的作用。祛痰止咳膠囊有效抑制炎癥因子TNF-α、IL-8 的釋放，提高NO含量，顯著改善大鼠慢性支氣管炎癥狀，從而抑制氣道炎性反應(yīng)，具有減輕CB 大鼠氣道炎癥的作用。

本研究結(jié)果表明，祛痰止咳膠囊可以改善大鼠慢性支氣管炎一般癥狀及肺組織病理情況；降低慢支大鼠PMN 吞噬指數(shù)、肺組織SP 含量，減少支氣管及肺組織中中性粒細(xì)胞、炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子浸潤，對控制氣道炎癥有較好的療效。