芪參地黃顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立

王藝璇，孫 堯，王 健，成光宇，張洪銘，解生旭，鄭明善*

（1.延邊大學(xué)生物教研室，吉林 延吉 136200；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，長(zhǎng)春 130117；3.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院植化室，長(zhǎng)春 130012）

“芪參地黃顆粒”為擬研制開發(fā)的治療重癥肌無力的中藥復(fù)方新藥，由我院王健教授提出，他本人擔(dān)任吉林省高?！皠?chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃”團(tuán)隊(duì)帶頭人，長(zhǎng)白山學(xué)者特聘教授等。王健教授將學(xué)術(shù)與臨床經(jīng)驗(yàn)相結(jié)合，別具一格的以“稟賦”和“虛損”立論指出痿證的病機(jī)關(guān)鍵，提出了病機(jī)關(guān)鍵為“脾腎虧虛，腦髓不足”，治療方法為“健脾益氣補(bǔ)髓法”。制劑由黃芪、黨參等十七味中藥材組成。方中黃芪、黨參為君藥，具有益氣壯陽(yáng)、健脾潤(rùn)肺的功效，共奏扶正補(bǔ)脾益氣之功；白術(shù)、枸杞子、巴戟天、黃精、山藥助君藥補(bǔ)氣健脾補(bǔ)血生津，生地黃、狗脊、炙甘草祛風(fēng)除濕，以上八者共為臣藥；當(dāng)歸具有養(yǎng)血和營(yíng)，協(xié)君藥補(bǔ)氣養(yǎng)血，地龍、鉤藤二藥合用增強(qiáng)熄風(fēng)通絡(luò)之功，陳皮調(diào)中、燥濕、痰濕使藥物補(bǔ)而不滯，五者共為佐藥；柴胡、升麻、葛根三者相配伍，協(xié)助君藥以升提下陷之中氣，擔(dān)任佐使。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用TLC 法對(duì)QSDH 中黃芪、黨參、枸杞子、狗脊、當(dāng)歸、陳皮、葛根進(jìn)行鑒別，并用HPLC 法測(cè)定黃芪甲苷的含量來控制QSDH 的質(zhì)量，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

LC-2010C型高效液相色譜儀（日本島津公司）；KQ -300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；分析天平萬分之一FA2004N 天平 YUEPING 上海越平科學(xué)儀器（蘇州制造有限公司）；十萬分之一 METTLER TOLEDO AG245 瑞士；GOODLOOK-100型薄層色譜成像系統(tǒng)（上?？普苌萍加邢薰荆籑illi -Q（MERC KMILLIPORE）；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD，Alltech）。對(duì)照品：黃芪甲苷（批號(hào)：110781-20166，97.4%）、橙皮苷（批號(hào)：110721-201617，96.1%）、葛根素（批號(hào)：110752-201816，95.4%）以上對(duì)照品均來自于中國(guó)食品藥品檢定研究院。芪參地黃顆粒（批號(hào)：20191201/20191202/20191203），吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院的制劑室提供；HPLC 定量分析中使用的乙腈、水均為色譜級(jí)，TLC 定性實(shí)驗(yàn)中使用到的化學(xué)試劑均為分析級(jí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 黃芪鑒別 取QSDH 約3 g，緩緩加入20 mL量的甲醇，加熱并用冷凝管回流1 h，得到的濾液加于100～120 目的中性氧化鋁柱（5 g，內(nèi)徑為10～15 mm）上，用40%甲醇洗脫，用量為100 mL，將洗脫液收集，然后蒸干，用30 mL 的水使蒸干物溶解，拿20 mL 量的正丁醇（水飽和）搖晃2次，歸并正丁醇液再用水洗滌2 次（每次20 mL），留下正丁醇液蒸干，蒸發(fā)后的干物質(zhì)滴0.5 mL 甲醇使其溶解，成為供試品溶液。拿一些量的黃芪甲苷對(duì)照品，與甲醇混合制成1 mL/mg 溶液，作對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法試驗(yàn)[1]，在同一塊高效G 上點(diǎn)2 種溶液每種4 μL，用甲醇-三氯甲烷-水（8:13:2）的下層溶液展開，拿出，揮干后噴1%香草醛硫酸乙醇溶液，105℃下加熱，結(jié)果顯示斑點(diǎn)清晰可見。被測(cè)顆粒色譜中，白光下顯示和對(duì)照品色譜同位置上一樣的藍(lán)紫色斑點(diǎn)，見圖1。

圖1 黃芪 TLC 鑒別

2.1.2 黨參鑒別 取QSDH約1 g，加25 mL量的甲醇，經(jīng)過30 min 的超聲處理，濾過，干燥，殘?jiān)?5 mL量的水溶解，過 D101型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑為1.5 cm，柱高為10 cm），拿50 mL 量的水洗脫，丟棄水液，再加50 mL50%濃度的乙醇洗脫，混合洗脫液，蒸發(fā)干，滴1 mL 的甲醇溶解，配成供試溶液。另取黨參對(duì)照藥材1 g，用上面方法配成對(duì)照藥材溶液。按照薄層色譜法試驗(yàn)[1]，在同一塊高效G 上點(diǎn)2 種溶液，每種5 μL，用甲醇-三氯甲烷-水（7:13:2）的下層溶液展開，拿出，放干，噴現(xiàn)配的1:1 的顯色劑2%三氯化鐵溶液-1%鐵氰化鉀溶液。被測(cè)顆粒色譜中，白光下顯示和對(duì)照品色譜同位置上一樣顏色的斑點(diǎn)，見圖2。

圖2 黨參 TLC 鑒別

2.1.3 枸杞子鑒別 取QSDH 約1 g，加35 mL 量的水，經(jīng)過15 min 加熱煮沸，放冷，濾過，加15 mL 量的乙酸乙酯振搖提取，留下乙酸乙酯液，濃縮成1 mL 作供試品溶液。另拿枸杞子對(duì)照藥材1 g，用上面方法配對(duì)照藥材標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照薄層色譜法試驗(yàn)[1]，在同一塊高效G 上點(diǎn)2 種溶液，每種5 μL，用乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸（3:2:1）展開，拿出，揮干，被測(cè)顆粒色譜中，紫外光燈（365 nm）下顯示和對(duì)照藥材色譜同位置上一樣顏色的熒光斑點(diǎn)，見圖 3。

圖3 枸杞子 TLC 鑒別

2.1.4 狗脊鑒別 取QSDH 約2 g，加50 mL 量的甲醇后經(jīng)超聲處理30 min，濾過，蒸干，滴1 mL 甲醇溶成供試品溶液。另取狗脊對(duì)照藥材粉末2 g，用上面方法配對(duì)照藥材溶液。按照薄層色譜法試驗(yàn)[1]，在同一塊高效G上點(diǎn)2種溶液，每種4 μL，做條狀，用乙酸乙酯-甲苯-三氯甲烷-甲酸（6:3:5:1）展開，拿出，揮干后噴現(xiàn)配的2%三氯化鐵溶液-1%鐵氰化鉀溶液（1:1），讓斑點(diǎn)顯現(xiàn)清楚。被測(cè)顆粒色譜中，白光下顯示和對(duì)照品色譜同位置上一樣顏色的斑點(diǎn)，見圖4。

圖4 狗脊 TLC 鑒別

2.1.5 當(dāng)歸鑒別 取QSDH 約15 g，加30 mL 量的水溶解，離心，用乙酸乙酯萃取，取上清液2 次，每次20 mL，歸并乙酸乙酯層，蒸干后加1 mL 甲醇溶成供試品溶液。另取當(dāng)歸對(duì)照藥材5 g，加20 mL 量的甲醇，在進(jìn)行30 min 的超聲，濾過，蒸發(fā)濾液，加20 mL 量的水溶解，用乙酸乙酯萃取3 次，10 mL/次，混合乙酸乙酯層，蒸發(fā)后滴1 mL 量的甲醇配成對(duì)照藥材溶液。按照薄層色譜法試驗(yàn)[1]，在同一塊高效G上點(diǎn)2種溶液，每種5 μL，用正己烷-乙酸乙酯（4:1）溶液展開，取出，晾干，被測(cè)顆粒色譜中，紫外光燈（365 nm）下顯示和對(duì)照藥材色譜同位置上一樣顏色的熒光斑點(diǎn)，見圖5。

圖5 當(dāng)歸 TLC 鑒別

2.1.6 陳皮鑒別 取QSDH 約5 g，加20 mL 量的甲醇，超聲處理30 min，取10 mL 量的上清液，濃成1 mL 供試品溶液。另取陳皮對(duì)照藥材2 g，用上面方法配對(duì)照藥材溶液。再取用甲醇飽和過的橙皮苷對(duì)照品作對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法試驗(yàn)[1]，在同一塊高效G 上點(diǎn)3 種溶液，每種1 μL，用丁酮-乙酸乙酯-甲酸-水（6:10:2:1）溶液展開，取出，晾干，用三氯化鋁試液，被測(cè)顆粒色譜中，紫外光燈（365 nm）下顯示和對(duì)照藥材色譜同位置上一樣顏色的熒光斑點(diǎn)，見圖 6。

圖6 陳皮 TLC 鑒別

2.1.7 葛根鑒別 取QSDH 約1 g，加入10 mL 甲醇，浸2 h，得到濾液，蒸干后滴0.5 mL 甲醇溶成供試品溶液。另取葛根對(duì)照藥材0.8 g，和上面方法配對(duì)照藥材溶液。再取葛根素對(duì)照品，加甲醇制成1 mL/mg 的溶液，作對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法試驗(yàn)[1]，在同一塊高效G 上點(diǎn)3 種溶液，每種10 μL，用甲醇-三氯甲烷-水（2.5:7:0.25）溶液展開，拿出，揮干，被測(cè)顆粒色譜中，紫外光燈（365 nm）下顯示和對(duì)照藥材色譜同位置上一樣顏色的熒光斑點(diǎn)，見圖7。

圖7 葛根 TLC 鑒別

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：島津VP-ODS（4.6×150 mm，5 m）；流動(dòng)相：乙腈-水（32:68 ）；流 速 ：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃。檢測(cè)器：ELSD，漂移管溫度 ：100 ℃，空氣流速：2.8 L/min。理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取黃芪甲苷對(duì)照品適量，精準(zhǔn)稱量，混合甲醇配成含0.253 mg/mL 的溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精準(zhǔn)稱量QSDH 約5 g，研細(xì)，混合50 mL 量的甲醇，稱定重量，超聲處理30 min，放涼，稱定重量，加甲醇補(bǔ)上減少的重量，濾過，蒸干，加20 mL 量的水，微熱把殘?jiān)芙?，拿水飽和的正丁醇搖勻提取3 次，每次20 mL，混合正丁醇液，用氨試液充分洗3 回，每回20 mL，丟棄氨試液，正丁醇液蒸干后加甲醇溶解，轉(zhuǎn)至2 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 按2.2.3 項(xiàng)下方法制成無黃芪的陰性樣品溶液。

2.2.5 專屬性考察 按2.2.1 項(xiàng)下方法測(cè)定，得對(duì)照品、供試品及陰性對(duì)照的色譜圖，見圖8。在這條件下，樣品色譜中待測(cè)成分峰前后無其他峰干擾，分離效果比較好。

圖8 QSDH 高效液相色譜圖

2.2.6 方法學(xué)考察

2.2.6.1 線性關(guān)系的考察 取2.2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液，分別精密吸取4、8、16、32、64 μL，進(jìn)液相色譜儀，按2.2.1 項(xiàng)下方法測(cè)定。水平坐標(biāo)為黃芪甲苷進(jìn)樣量，垂直坐標(biāo)為峰面積的Lg 值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得黃芪甲苷的回歸方程為Y（LgA）=1.841X+5.2126，R=0.9997。結(jié)果表明，黃芪甲苷在1.012～16.192 μg 范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系比較好。

2.2.6.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取10 μL 2.2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)測(cè)定6 次，結(jié)果黃芪甲苷的RSD為0.25%，證明儀器精密度良好。

2.2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取20 μL 2.2.3 項(xiàng)下中同一份供試品溶液，進(jìn)樣時(shí)間0、2、4、6、8、24 h 測(cè)定，黃芪甲苷峰面積的RSD為0.30%，證明24 h 內(nèi)供試品溶液基本穩(wěn)定。

2.2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次芪參地黃顆粒適量，按2.2.3項(xiàng)下方法獨(dú)立制備供試品溶液6份并依法測(cè)定，黃芪甲苷含量的RSD為0.59%，證明此方法重復(fù)性良好。

2.2.6.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量芪參地黃顆粒6份（黃芪甲苷含量0.0605 mg/g），精密加入黃芪甲苷對(duì)照品溶液（0.14 mg/mL）1 mL，依法測(cè)定，計(jì)算回收率，黃芪甲苷平均回收率為 98.26%，RSD=0.73%。加樣回收率測(cè)定結(jié)果，見表1。

表1 加樣回收率測(cè)定結(jié)果

3 討論

黃芪薄層鑒別[2-3]曾用甲醇-三氯甲烷-水（7:13:2）下層溶液展開，但供試品色譜中斑點(diǎn)分離的效果不太好，展開系統(tǒng)極性較低，所以提高了展開系統(tǒng)極性，遂用三氯甲烷-甲醇-水（13:8:2）的下層溶液，且10%硫酸乙醇溶液顯色，斑點(diǎn)不清楚，改成用1%香草醛硫酸乙醇溶液在105℃加熱讓斑點(diǎn)顯色清晰；黨參薄層鑒別[4-5]曾以藥典法中對(duì)照品黨參炔苷，展開劑正丁醇-冰醋酸-水（7:1:0.5）10%硫酸乙醇溶液顯色，但供試品色譜中的熒光斑點(diǎn)與對(duì)照品對(duì)應(yīng)性較差，斑點(diǎn)顯現(xiàn)不清楚，最后改用三氯甲烷-甲醇-水（13:7:2）的下層溶液；當(dāng)歸薄層鑒別[6-7]曾按藥典法乙醚處理對(duì)照藥材和樣品，但供試品中無斑點(diǎn)。試用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，得到的樣品與對(duì)照藥材色譜同位置上，有一樣的熒光斑點(diǎn)，陰性樣品色譜中無一樣斑點(diǎn)；陳皮薄層鑒別[8-9]曾以甲醇-乙酸乙酯-水（17:100:13）為展開劑，展至約3 cm，取出，晾干后用甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（20:10:1:1）的上層溶液為展開劑，展開約8 cm（藥典法），噴顯色劑三氯化鋁試液，放紫外光燈（365 nm）下檢視，但疑似有陰性干擾，因此改用丁酮-乙酸乙酯-甲酸-水（6:10:2:1）為展開劑，噴顯色劑三氯化鋁試液，105℃加熱1 min 后在紫外光燈（365 nm）下檢視；同時(shí)枸杞子[10-11]、狗脊[12-14]、葛根[15-17]均經(jīng)過薄層方法學(xué)考察。

黃芪甲苷曾考察了不同的色譜柱、流速、柱溫、流動(dòng)相，不同的提取方法、溶劑種類、溶劑用量和提取時(shí)間，最終確定了準(zhǔn)確可靠，穩(wěn)定可行的方法，為后續(xù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供基礎(chǔ)。