核酸外切酶III輔助的熒光適體傳感器免標(biāo)記檢測(cè)卡那霉素*

卿太平， 許 錦， 蔣子欣， 張 鵬， 馮 波

(湘潭大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，湖南 湘潭 411105)

0 引言

卡那霉素是一種氨基糖苷類抗生素，從卡那霉素鏈霉菌中純化出來(lái)，主要分為鹽酸卡那霉素和硫酸卡那霉素.通過(guò)干擾蛋白質(zhì)合成而廣泛用于治療由革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌引起的嚴(yán)重感染[1-2].因卡那霉素的治療指標(biāo)狹窄，在動(dòng)物源性食品中過(guò)量使用該藥物可能對(duì)人造成耳毒性、腎毒性和抗生素耐藥性[3].卡那霉素的傳統(tǒng)分析檢測(cè)方法包括高效液相色譜(HPLC)[4-5]、毛細(xì)管電泳(CE)[6]、微生物法[7]、表面等離子體共振[8]、免疫分析法[9-10]等.這些檢測(cè)方法技術(shù)成熟且檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，但存在耗時(shí)長(zhǎng)、煩瑣、設(shè)備昂貴等不足，在實(shí)際應(yīng)用中具有局限性.因此，尋求一種簡(jiǎn)便、靈敏的卡那霉素檢測(cè)技術(shù)是非常必要的.

信號(hào)放大技術(shù)是檢測(cè)分析中用來(lái)提高靈敏度的常用方法，其主要是基于靶標(biāo)與不同信號(hào)探針的循環(huán)相互作用，在相同濃度靶標(biāo)作用下擴(kuò)增輸出信號(hào)[11-12].核酸酶能夠識(shí)別和切割特定的堿基序列或官能團(tuán)，催化水解核苷酸之間的磷酸二酯鍵[13].如脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)、核糖核酸酶H(RNase H)、核酸內(nèi)切酶IV、核酸外切酶III(Exo III)等常被作為切割酶以促進(jìn)靶標(biāo)循環(huán)[14].其中Exo III具有高效的酶催化活性，可作用于dsDNA，沿3′→5′方向逐步將dsDNA酶解成寡核苷酸.利用其特性，已經(jīng)開(kāi)展了許多研究.如Taghdisi等[15]研究設(shè)計(jì)了一種基于外切酶III、SYBR Gold和適配體互補(bǔ)鏈的熒光適配體，對(duì)鏈霉素進(jìn)行選擇性、靈敏性分析探究，檢出限低至54.5 nmol/L.通過(guò)檢測(cè)加標(biāo)牛奶和血清中的鏈霉素，不受樣品基質(zhì)的干擾，成功地評(píng)估了該策略的有效性和適用性.

在本論文中，以dsDNA為底物、核酸染料SYBR Gold(SG)為信號(hào)輸出單元，構(gòu)建一種核酸外切酶III輔助信號(hào)放大的熒光適體傳感器免標(biāo)記檢測(cè)卡那霉素，并考察其在實(shí)際廢水中的檢測(cè)能力，從而為抗生素污染控制提供一種技術(shù)參考.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)中所使用的寡核苷酸序列均由生物工程(上海)股份有限公司合成，并通過(guò)高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行純化，其序列如表1所示.核酸染料SYBR Gold(SG)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司.氯霉素、阿莫西林、青霉胺、阿奇霉素、卡那霉素購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司.廢水取自湘潭市污水處理廠，其他未提及的常用試劑皆為分析純且購(gòu)買于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，無(wú)須進(jìn)一步處理即可使用.

表1 寡核苷酸序列

1.2 緩沖溶液中卡那霉素檢測(cè)

將1 μL dsDNA溶液和2 μL 適量濃度卡那霉素溶液混合，在37 ℃下孵育60 min.隨后，加入2 μL Exo III，充分混合后繼續(xù)孵育30 min，再用PBS緩沖液和1 μL 核酸染料SG稀釋至200 μL.最后于495 nm處測(cè)量樣品的熒光強(qiáng)度(F-7000)，確定收集范圍為500～650 nm.其中激發(fā)和發(fā)射狹縫均設(shè)置為5 nm，電壓700 V PMT，掃描速度為1200 nm/min，響應(yīng)時(shí)間0.01 s.選擇Log[Kana]作為橫坐標(biāo)，信倍比((F0-F)/F0)作為縱坐標(biāo)，其中F0是不存在Kana時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)是Kana存在時(shí)的熒光強(qiáng)度.上述所有操作過(guò)程均盡量在避光條件下進(jìn)行.

1.3 特異性研究

為探究該方案是否具有對(duì)Kana檢測(cè)的特異性，本研究選取了氯霉素(Chloramphenicol)和阿莫西林(Amoxicillin)、青霉胺(Penicillamine)和阿奇霉素(Azithromycin)，抗生素的濃度均為200 μg/mL，采用與卡那霉素檢測(cè)相同的方法和條件進(jìn)行測(cè)定.

1.4 復(fù)雜樣品中的檢測(cè)

為驗(yàn)證該方法在實(shí)際應(yīng)用中的可行性，選取了廢水作為實(shí)際樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn).廢水樣品是從廢水處理廠(中國(guó)湘潭)收集.首先，將廢水離心3次(8 000 r/min，10 min)并過(guò)濾(0.22 μm膜濾器)以除去大顆粒，減少其他物質(zhì)的干擾.然后，加標(biāo)卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液以制備不同的卡那霉素濃度(0.1 ng/mL、1 ng/mL和10 ng/mL)用于分析測(cè)定.廢水樣品的檢測(cè)步驟與熒光測(cè)定相同.

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

核酸外切酶III(Exo III)可以催化從鈍或凹陷的3末端至5末端方向，使DNA雙鏈體中的單核苷酸被逐步去除，而無(wú)法催化從3末端突出的單鏈DNA，這一原理已廣泛用于生化分析中[16-17].基于此，設(shè)計(jì)了一種免標(biāo)記熒光適體傳感器，利用Exo III酶解dsDNA的特性降低背景信號(hào)，相對(duì)增大檢測(cè)信號(hào).如圖1所示，核酸染料SG能嵌入DNA鏈中，在495 nm激發(fā)波長(zhǎng)下有強(qiáng)烈的熒光信號(hào).當(dāng)靶標(biāo)Kana不存在時(shí)，Exo III會(huì)把雙鏈DNA酶解為寡核苷酸，因此不能與SG形成復(fù)合產(chǎn)物，在495 nm激發(fā)波長(zhǎng)下產(chǎn)生較弱熒光信號(hào).當(dāng)靶標(biāo)Kana存在時(shí)，靶標(biāo)會(huì)與適體鏈結(jié)合形成靶標(biāo)-適體復(fù)合物，并釋放出互補(bǔ)鏈，核酸染料SG均能嵌入其中，產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光信號(hào).以此通過(guò)檢測(cè)體系熒光強(qiáng)度的變化來(lái)分析卡那霉素的濃度.

圖1 基于核酸外切酶III構(gòu)建的熒光適體傳感器免標(biāo)記檢測(cè)卡那霉素Fig.1 Fluorescent aptamer sensor for label-free detection of kanamycin

2.2 可行性分析

為驗(yàn)證引入Exo III可降低背景信號(hào)和提高信倍比，檢測(cè)了空白組樣品加入Exo III前后的熒光信號(hào).如圖2所示，單獨(dú)的核酸染料SG幾乎無(wú)熒光信號(hào)(黑線)，在紫外透射儀照射下無(wú)亮度(①號(hào)離心管).當(dāng)核酸染料SG充分嵌入dsDNA中，產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光信號(hào)(紅線)，在紫外透射儀照射下亮度明顯(②號(hào)離心管).相比之下，引入Exo III后，樣品的熒光強(qiáng)度減弱了97.5%(藍(lán)線)，且發(fā)出微弱亮度(③號(hào)離心管).進(jìn)一步加入卡那霉素后，樣品的熒光信號(hào)增強(qiáng)(粉線)，信號(hào)變化率(F-F0)/F0=11.58，且④號(hào)離心管的亮度明顯變亮.該熒光光譜結(jié)果分析表明，基于Exo III構(gòu)建的熒光適體傳感器免標(biāo)記檢測(cè)卡那霉素是可行的.

圖2 卡那霉素檢測(cè)的可行性驗(yàn)證Fig.2 Feasibility evaluation of Kana detection

2.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

為了提高適體傳感器的檢測(cè)性能，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化.分別考察了dsDNA濃度、緩沖液類型、SG濃度、Exo III濃度、靶標(biāo)孵育時(shí)間、酶切時(shí)間等因素對(duì)檢測(cè)體系的影響.如圖3(a)所示，隨著 dsDNA濃度的增加，背景信號(hào)和輸出信號(hào)熒光強(qiáng)度均逐漸增強(qiáng).通過(guò)信號(hào)變化率((F-F0)/F0)可得到dsDNA的最佳濃度為50 nmol/L.適體傳感器在各緩沖溶液中均能順利檢測(cè)出 Kana并產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光信號(hào)，其中PBS緩沖溶液的背景熒光強(qiáng)度相對(duì)最弱(圖3(b))，得到的信倍比最大，故選擇PBS緩沖液作為最佳檢測(cè)緩沖液.如圖3(c)所示，隨著SG濃度的增加，熒光強(qiáng)度增加緩慢.其信倍比隨著染料濃度先增大后減小，在SG濃度為0.5×?xí)r出現(xiàn)峰值.Exo III作用于dsDNA，將其酶解成碎小的片段，它的濃度關(guān)乎著背景信號(hào)強(qiáng)弱.選擇了5組濃度分別為2、4、6、8、10 U/mL進(jìn)行優(yōu)化.如圖3(d)所示，當(dāng)Exo III為6 U/mL時(shí)，酶切效果最好,信倍比最大.最后優(yōu)化了靶標(biāo)孵育時(shí)間和酶切時(shí)間.圖4(a)顯示，隨著靶標(biāo)孵育時(shí)間增加，空白組熒光強(qiáng)度基本不變，實(shí)驗(yàn)組前20 min先增加后保持不變，說(shuō)明20 min后靶標(biāo)與互補(bǔ)鏈競(jìng)爭(zhēng)基本結(jié)束并形成穩(wěn)定的靶標(biāo)-適體復(fù)合物.從圖4(b)可知，隨著酶切時(shí)間的增加，Exo III與dsDNA發(fā)生酶解反應(yīng)，空白組熒光強(qiáng)度不斷降低.當(dāng)時(shí)間達(dá)到30 min時(shí)，反應(yīng)基本完成，熒光強(qiáng)度和信倍比保持不變.綜上所述，得到的最佳實(shí)驗(yàn)條件為：dsDNA：50 nmol/L、PBS：10 mmol/L(pH 7.4)；SG：0.5×；Exo III：6 U/mL；靶標(biāo)孵育時(shí)間：20 min；酶切時(shí)間：30 min.

圖3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化，(a)dsDNA濃度、(b)緩沖液類型、(c)SG濃度、(d)Exo III濃度對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)熒光強(qiáng)度的影響Fig.3 Optimization of experimental conditions. Effect of dsDNA concentration (a), reaction buffer (b), SG (c) and Exo III (d) concentration on the fluorescent intensity of detection system

圖4 反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化，(a)靶標(biāo)孵育時(shí)間、(b)酶解時(shí)間對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Optimization of reaction time. Effect of incubation time (a) and hydrolysis time (b) on the fluorescent intensity of detection system

2.4 緩沖液中卡那霉素的檢測(cè)

在考察實(shí)驗(yàn)中各項(xiàng)因素的影響并確定檢測(cè)的最優(yōu)條件后，分析了該檢測(cè)體系對(duì)Kana檢測(cè)的靈敏度.如圖5(a)所示，當(dāng)卡那霉素濃度從0增加至1×106ng/mL時(shí)，溶液的熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)并達(dá)到飽和.同時(shí)，在0.01～50 ng/mL的卡那霉素濃度范圍內(nèi)，信倍比與卡那霉素濃度的對(duì)數(shù)保持良好的線性關(guān)系(圖5(b)).線性方程表示為y=0.83849x+2.01069(R2=0.993)，其中y表示信倍比(F-F0)/F0，x表示Log[ Kana濃度]，檢測(cè)限LOD= 8.12×10-3ng/mL(3σ).此外，該傳感器實(shí)現(xiàn)了比其他卡那霉素檢測(cè)策略更低的檢測(cè)限[18-22].

圖5 緩沖溶液中卡那霉素的檢測(cè).(a)該檢測(cè)系統(tǒng)在不同濃度卡那霉素下的熒光發(fā)射光譜； (b) 信倍比(F0-F)/F0與Kana濃度的關(guān)系曲線Fig.5 Detection of Kana in the buffer. Fluorescence spectra of the aptasensor at various Kana concentrations (a); The linear calibration of (F-F0)/F0) versus the Kana concentration (b)

2.5 特異性分析

為了評(píng)估該策略的特異性，考察了該適體傳感器對(duì)卡那霉素(Kanamycin)及其他4種抗生素氯霉素(Chloramphenicol)、阿莫西林(Amoxicillin)、青霉胺(Penicillamine)、阿奇霉素(Azithromycin)的熒光響應(yīng).如圖6(a)所示，只有在卡那霉素存在的情況下，熒光強(qiáng)度才會(huì)得到明顯的提高，而其他抗生素存在的溶液熒光強(qiáng)度均很弱.另外，在紫外透射儀下可明顯觀察到卡那霉素溶液的離心管熒光最亮(如圖6(b)所示).因此，其他抗生素對(duì)卡那霉素的檢測(cè)沒(méi)有干擾，體現(xiàn)了良好的選擇性.

圖6 卡那霉素的特異性測(cè)定.(a) 氯霉素、阿莫西林、青霉胺、阿奇霉素、卡那霉素存在時(shí)的熒光光譜圖； (b)其他抗生素存在時(shí)的信倍比和紫外透射儀下照片F(xiàn)ig.6 Selectivity of this strategy for Kana detection. (a) Fluorescence spectra of the detection system in the absence and presence of antibiotics; (b) The signal change ratio (F-F0)/F0 of solutions that contain Kana or other interfering substances. The illustration shows the associated fluorescence emission under UV light.

2.6 復(fù)雜樣品中卡那霉素的檢測(cè)

結(jié)合該適體傳感器具有良好的靈敏性和高特異性的特點(diǎn)，對(duì)該檢測(cè)方法在實(shí)際樣品中的應(yīng)用進(jìn)行了評(píng)估.在廢水樣品中加標(biāo)不同濃度的卡那霉素溶液使其終濃度分別為0.1 ng/mL、1 ng/mL和10 ng/mL用于分析測(cè)定，并計(jì)算回收率.如表2所示，平均回收率介于96.05%至105.04%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.83%～9.87%.結(jié)果說(shuō)明該檢測(cè)方案對(duì)實(shí)際樣品中的卡那霉素呈現(xiàn)出較好的檢測(cè)性能，能有效用于實(shí)際應(yīng)用.

表2 實(shí)際樣品中卡那霉素的測(cè)定

3 小結(jié)

基于核酸外切酶III對(duì)dsDNA的特異性切割能力和核酸染料嵌入DNA后的熒光增強(qiáng)作用，構(gòu)建了一種免標(biāo)記適體傳感器用于卡那霉素檢測(cè).完全互補(bǔ)的雙鏈結(jié)構(gòu)能夠被核酸外切酶III水解成寡核苷酸，SYBR Gold無(wú)法嵌入，從而表現(xiàn)出低的背景信號(hào).為獲得傳感器最佳的檢測(cè)性能，優(yōu)化了包括dsDNA濃度、緩沖溶液類型、SYBR Gold濃度、Exo III濃度、靶標(biāo)孵育時(shí)間、酶切時(shí)間等多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件.在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，卡那霉素濃度在0.01～50 ng/mL范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，其檢測(cè)限為8.12×10-3ng/mL，廢水樣品中的加標(biāo)回收率為96.05%～105.04%.與其他卡那霉素檢測(cè)方法相比，該策略適體鏈不需要復(fù)雜的設(shè)計(jì)，無(wú)須修飾昂貴的熒光基團(tuán)，能有效降低檢測(cè)成本；同時(shí)，該方法操作簡(jiǎn)便，響應(yīng)快，成本低，具有良好的特異性、穩(wěn)定性、重復(fù)性.在廢水樣品中也能檢測(cè)成功表明該策略可用于環(huán)境中卡那霉素檢測(cè)的實(shí)際應(yīng)用.