苦木主要生物堿成分的分離及腸道微生物的轉(zhuǎn)化研究

陳封政，龍 潔，孫國峰，田 沖，李書華※

(1.樂山師范學(xué)院 a.化學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院 b.樂山特色農(nóng)產(chǎn)品藥用成分研發(fā)工程中心，四川 樂山 614000；2.固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000)

0 引言

苦木Picrasmaquassioides(D.Don)Benn.為苦木科苦木屬植物苦木的干燥枝和葉，是我國民間的常用中草藥，具有消炎、抗菌、解毒等功效[1]，其主要功效成分為三萜、生物堿和苦木內(nèi)酯等[2]?？嗄臼窍桌懫闹饕纤幉模瑔畏剿幙嗄咀⑸湟菏蛰d于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》，主治感冒、上呼吸道感染、腸炎和細(xì)菌性痢疾等[3]。目前，研究人員已經(jīng)從苦木中分離鑒定出18個(gè)生物堿成分[4],其主要成分為苦木酮(4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮)[5-6]，含量約為干藥材的千分之三[7-8]，該生物堿具有抗炎和治療腸炎的作用[9-10]，與藥材的主治功能一致，是該藥材的特征成分，但是尚無苦木酮在體外或體內(nèi)的代謝研究。藥物在腸道菌群的作用下發(fā)生生物轉(zhuǎn)化，直接對(duì)藥物在體內(nèi)的生物利用度以及藥物對(duì)疾病的治療產(chǎn)生重要影響[11-12]。為了研究苦木特征成分在胃腸道內(nèi)的變化，我們對(duì)苦木的生物堿成分進(jìn)行了分離鑒定，對(duì)藥材中主要特征生物堿成分的含量進(jìn)行了測定，并研究了特征成分在仿生胃液、腸液中的穩(wěn)定性與變化情況，為藥材苦木的深入研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

苦木(Picrasmaquassioides(D.Don)Benn.)，購買于安徽亳州中藥材市場，經(jīng)樂山師范學(xué)院成英副教授鑒定為苦木科植物苦木的干燥枝和葉，標(biāo)本保存于樂山師范學(xué)院樂山特色農(nóng)產(chǎn)品藥用成分研發(fā)工程中心(20170901)。

1.2 儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠，RE-2000A)，高速多功能粉碎機(jī)(上海塞耐機(jī)械有限公司，JY-1000A)，循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限公司，SHZ-D(Ⅲ))，電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司，F(xiàn)A2004)，烘箱(上海朗軒實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，核磁共振譜儀(Bruker，AV 400)。

2 方法與結(jié)果

2.1 苦木生物堿成分的提取

稱取苦木藥材10 kg，粉碎，置于塑料桶中，加入95%乙醇，室溫浸泡4天，過濾，得到第一次浸泡液；再次將藥渣用95%乙醇室溫浸泡4天，過濾除去殘?jiān)?，合并兩次濾液，減壓濃縮，回收乙醇溶液，得到苦木的乙醇流動(dòng)狀浸膏。

將上述浸膏用2 L pH 1～2的鹽酸水充分分散，過濾，得到酸水溶液，用濃氨水將酸水的pH調(diào)至9～10，然后用等體積的乙酸乙酯萃取4次，合并4次乙酸乙酯萃取液，減壓濃縮，得到17 g總生物堿。

2.2 苦木生物堿成分的分離

用總生物堿17 g，拌樣上樣。以二氯甲烷∶甲醇(30∶1,20∶1,10∶1,5∶1，v/v)為洗脫劑，每個(gè)梯度洗脫液為柱體積的兩倍，以50 mL為一個(gè)收集流份，共收集得到23個(gè)組分。以薄層層析為檢測依據(jù)，將斑點(diǎn)清晰具有相同Rf值的合并為一組。其中1-8組分合并成一瓶，9-14組分合并成一瓶，15-23組分合并成一瓶。將1-8組分再次進(jìn)行硅膠柱層析，以二氯甲烷∶甲醇(50∶1,40∶1,30∶1,25∶1,20∶1,甲醇v/v)為洗脫液，西林瓶收集，以薄層層析為檢測依據(jù)，合并相同組分，濃縮后丙酮重結(jié)晶，得到化合物1。

2.3 苦木生物堿成分的鑒定

化合物1：黃色針狀結(jié)晶，易溶于氯仿，mp.(224-225)℃。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.09(1H，d，J=8Hz)，8.87(1H，d，J=4.0Hz)，8.57(1H，d，J=8.0Hz)，8.09(1H，d，J=8.0Hz)，7.71(1H，td，J=8.0，8.0 Hz)，7.54(1H，td，J=4.0，8.0 Hz)，4.49(3H，s，C4-OCH3)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ：116.77(C-1)，114.68(C-2)，145.96(C-4)，142.74(C-5)，158.08(C-6)，116.77(C-8)，130.75(C-9)，125.82(C-10)，122.77(C-11)，125.52(C-12)，138.75(C-13)，130.28(C-14)，126.07(C-15)，138.75(C-16)，61.07(C4-OCH3)。該化合物的核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道的苦木酮(4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮)一致，故該化合物被鑒定為苦木酮(4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮)，其結(jié)構(gòu)如圖1。

圖1 苦木酮結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of 4-methoxy-5-hydroxycanthin-6-dione

2.4 苦木主要生物堿成分的含量測定

2015版《中國藥典》在苦木藥材的質(zhì)量控制方面僅有理化鑒別、顯微鑒別和薄層鑒別，且薄層鑒別中沒有特征成分的鑒別，僅僅要求與對(duì)照藥材顯相同斑點(diǎn)，缺乏特征成分的含量測定，難以有效地控制藥材質(zhì)量。我們以自制的苦木酮為對(duì)照品，對(duì)藥材中的特征生物堿進(jìn)行了含量測定。色譜條件：Innoval ODS-2(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(B)-0.1%磷酸水溶液(A)，0-10 min 10% B - 33% B，10 min-20 min 33% B-40% B，20 min-25 min 40% B-10% B；紫外檢測波長：254 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：25 ℃。在此色譜條件下，得到苦木酮和苦木乙醇提物的色譜圖(見圖2)。

配制濃度為8 μg·mL-1、16 μg·mL-1、32 μg·mL-1、48 μg·mL-1、64 μg·mL-1、80 μg·mL-1的苦木酮對(duì)照品溶液。在上述色譜條件下，進(jìn)樣20 μL，測定峰面積值，以對(duì)照品峰面積值以及進(jìn)樣濃度X(μg·mL-1)制作線性曲線，結(jié)果在濃度范圍(8～80)μg·mL-1內(nèi)，苦木酮回歸方程為：Y=6.190×104X+7.831×104，R2=0.9994。

圖2 苦木酮(A)和苦木乙醇提物(B)的HPLC色譜

從圖2可以看出：苦木乙醇提取物的液相色譜圖中苦木酮的峰高及峰面積均是最大的，苦木酮是苦木的主要成分。我們測定了三批相同產(chǎn)地不同批次苦木的苦木酮，結(jié)果如表1。從表1我們可以看出，本次試驗(yàn)所用三批藥材中苦木酮的含量約為萬分之七，為吳沖[7]等研究報(bào)道苦木中苦木酮含量的20%左右。

表1 苦木中苦木酮的含量測定

2.5 苦木主要生物堿成分的人源腸內(nèi)菌的轉(zhuǎn)化研究

2.5.1 仿生人工胃液中穩(wěn)定性研究

參照文獻(xiàn)[14]配置人工胃液：0.1 M稀鹽酸16.4 mL，加水約800 mL與胃蛋白酶10 g，搖勻后，加水衡釋至1000 mL，即可。將苦木酮置于人工胃液中于37 ℃的環(huán)境中震蕩溫孵。按照2.4中的色譜條件分析，苦木酮在4 h內(nèi)，在人工胃液中穩(wěn)定。

2.5.2 人源腸內(nèi)菌的轉(zhuǎn)化研究

參照文獻(xiàn)[14-15]配置厭氧培養(yǎng)液：L-半胱氨酸0.5 g，2 mL 25% L-抗壞血酸，牛肉膏1 g，蛋白胨1 g，營養(yǎng)瓊脂1 g，37.5 mL A液(0.78% K2HPO4)，37.5 mL B液 [0.47% KH2PO4，1.2% (NH4)2SO4，1.8% NaCl，0.12% CaCl2，0.25% MgSO4]，50 mL 8% Na2CO3，加純化水至1 L，稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.5～8.0。

腸內(nèi)菌培養(yǎng)液的制備：按健康青年的新鮮糞便與滅菌生理鹽水1∶4 (g:m L)混合均勻，用無菌4層紗布過濾，再與厭氧培養(yǎng)液按照1∶9的比例混合，得到腸菌培養(yǎng)液。

以10 mL空白腸內(nèi)菌培養(yǎng)液為空白對(duì)照(標(biāo)記為A)，10 mL厭氧培養(yǎng)液加苦木酮為陰性對(duì)照(標(biāo)記為B)，以10 mL腸內(nèi)菌培養(yǎng)液加入苦木酮(體系中苦木酮質(zhì)量濃度為12.5 μg/mL)為腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化組(標(biāo)記為C)。

將上述樣品置于37 ℃的厭氧培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)0 h，24 h，48 h和72 h時(shí)取樣，乙酸乙酯萃取后進(jìn)行HPLC分析，分別得到0 h，24 h，48 h和72 h的液相分析圖，見圖3、圖4、圖5和圖6。

注：A為空白對(duì)照 ；B為陰性對(duì)照； C為轉(zhuǎn)化組； 1為苦木酮。圖3 苦木酮0 h人源腸內(nèi)菌的轉(zhuǎn)化HPLCFig.3 HPLC of 4-methoxy-5-hydroxycanthin-6- dion Biotransformation by Human Intestinal Flora in 0 h

注：A為空白對(duì)照 ；B為陰性對(duì)照； C為轉(zhuǎn)化組； 1為苦木酮。圖4 苦木酮24 h人源腸內(nèi)菌的轉(zhuǎn)化的HPLCFig.4 HPLC of 4-methoxy-5-hydroxycanthin-6- dion Biotransformation by Human Intestinal Flora in 24 h

注：A為 空白對(duì)照 ；B為陰性對(duì)照； C為轉(zhuǎn)化組； 1為苦木酮，2為轉(zhuǎn)化產(chǎn)物圖5 苦木酮48h人源腸內(nèi)菌的轉(zhuǎn)化的HPLC Fig.5 HPLC of 4-methoxy-5-hydroxycanthin-6- dion Biotransformation by Human Intestinal Flora in 48 h

注：A為 空白對(duì)照 ；B為陰性對(duì)照； C為轉(zhuǎn)化組； 1為苦木酮，2為轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。圖6 苦木酮72 h人源腸內(nèi)菌的轉(zhuǎn)化的HPLCFig.6 HPLC of 4-methoxy-5-hydroxycanthin-6- dion Biotransformation by Human Intestinal Flora in 72 h

2.5.3 苦木酮的人源腸內(nèi)菌的轉(zhuǎn)化放大試驗(yàn)

配置腸菌培養(yǎng)液1 L，按上述操作方法加入50 mg 苦木酮，混勻。置于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，72 h后，取出加等體積乙酸乙酯萃取2次，減壓濃縮乙酸乙酯，得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。

將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物通過硅膠柱層析分離純化，得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的純品，即化合物2。

化合物2：黃色針狀結(jié)晶，易溶于氯仿，mp(145-146)℃。將化合物2的與化合物1的核磁譜圖仔細(xì)比較，發(fā)現(xiàn)多了一個(gè)甲氧基信號(hào)(δH4.07，δC61.17)，故猜測化合物2是化合物1的5位的羥基變成甲氧基。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.04(1H，d，J=4.0 Hz)，8.78(1H，d，J=4.0Hz)，8.57(1H，d，J=8.0 Hz)，7.72(1H，td，J=8.0，8.0 Hz)，7.54(1H，td，J=8.0，8.0 Hz)，8.15(1H，d，J=8.0Hz)，4.45(3H，s，C4-OCH3)，4.07(3H，s，C5-OCH3)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ：116.13(C-1)，145.19(C-2)，140.22(C-4)，139.18(C-5)，158.71(C-6)，116.72(C-8)，130.72(C-9)，125.64(C-10)，122.88(C-11)，124.75(C-12)，133.02(C-13)，128.44(C-14)，125.64(C-15)，130.98(C-16)，61.15(C4-OCH3)，61.17(C5-OCH3)。該化合物的核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道的苦木堿丁(4,5-二甲氧基鐵屎米酮)一致，故該化合物鑒定為苦木堿丁(4,5-二甲氧基鐵屎米酮)，其結(jié)構(gòu)及變化如圖7。

圖7 苦木酮在人源腸內(nèi)菌作用下轉(zhuǎn)化成苦木堿丁Fig.7 4-methoxy-5-hydroxycanthin-6-dione was Transformed into 4,5-dimethoxycanthin-6-one by Human Intestinal Flora

3 討論與結(jié)論

a)通過苦木乙醇提取物的HPLC色譜圖發(fā)現(xiàn)苦木酮是苦木的主要生物堿成分，是苦木的主要特征成分之一。

b)通過研究表明苦木酮在人工胃液中穩(wěn)定，表明口服含苦木的制劑，苦木酮大部分以原型的形式進(jìn)入腸道?？嗄就谌梭w腸道微生物及微生物分泌的酶的作用下發(fā)生變化，由于微生物酶的作用，苦木酮上的羥基變成甲氧基，轉(zhuǎn)化成極性較低的苦木堿丁，增強(qiáng)了化合物的脂溶性，有利于藥物分子透過腸系膜進(jìn)而被吸收，增大了藥物的生物利用度。

c)劉軍峰[16]等研究表明苦木酮和苦木堿丁對(duì)磷酸二酯酶4有抑制活性，但苦木堿丁表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制作用；同時(shí)苦木堿丁相對(duì)于苦木酮而言，對(duì)肺炎球菌的抑菌更顯著[2]。由此可見，苦木酮在人體腸道微生物及微生物分泌的酶的作用下藥效增強(qiáng)了。