江香薷乙酸乙酯成分及其抑制α-葡萄糖苷酶活性分析

鄒毅 潘建萍 周敏

摘 要：研究江香薷中抑制α-葡萄糖苷酶活性成分，采用硅膠柱層析、葡聚糖凝膠柱色譜、重結(jié)晶等方法從江香薷乙酸乙酯部位分離純化出單體化合物，根據(jù)化合物理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)鑒定化學(xué)結(jié)構(gòu)，采用4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）法進(jìn)行α-葡萄糖苷酶抑制活性評價(jià)。結(jié)果表明，從江香薷乙酸乙酯部位分離得到7個(gè)化合物，分別為南燭樹脂酚（1）、（-）-5-甲氧基異落葉松樹脂素（（-）-5-methoxyisolariciresinol）（2）、松脂醇（Pinoresinol）（3）、isoeucommin A（4）、丁香樹脂醇-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（Episyringaresinol-4-O-β-D-glucopyranoside）（5）、槲皮素（6）、山奈酚（7），化合物1～5為首次從該植物中分離得到。體外α-葡萄糖苷酶抑制活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，化合物1、7對α-葡萄糖苷酶的抑制率達(dá)到86%以上，IC50分別為（47.15±0.41）mg/L、（42.34±0.62）mg/L，化合物6的抑制率為94.11%，IC50是（39.28±0.30）mg/L，活性與陽性對照組Acarbose相當(dāng)?；衔?為競爭性抑制，化合物6、7為非競爭抑制。

關(guān)鍵詞：江香薷;化學(xué)成分;α-葡萄糖苷酶抑制活性

江香薷（Mosla chinensis）為唇形科石薺苧屬植物，以干燥地上部分入藥，屬藥食同源品種，為江西省的大宗藥材之一，主產(chǎn)于新余市分宜縣和渝水區(qū)等地。江香薷味辛，微溫，具有發(fā)汗解表，化濕和中的功效，可用于治療暑濕感冒、惡寒發(fā)熱、頭痛無汗、腹痛吐瀉、水腫、小便不利等病癥[1]。國內(nèi)外關(guān)于該植物的形態(tài)、資源、化學(xué)成分及生物活性研究報(bào)道較多，且發(fā)現(xiàn)該植物包含揮發(fā)油、生物堿、苷類、多糖、黃酮等多種化學(xué)成分，具有抗菌、調(diào)血脂、降糖、抗氧化、提高免疫力等藥理活性[2-3]。然而，目前研究多集中于具有抗炎、抗病毒等活性的揮發(fā)油成分的研究，對于其他成分的藥理活性研究報(bào)道甚少。α-葡萄糖苷酶抑制劑（AGI）是治療Ⅱ型糖尿?。―M）常用的口服藥物，目前已上市的有阿卡波糖、伏格列波糖等，但其胃腸道方面副作用明顯，從天然產(chǎn)物中篩選新的AGI的研究越來越受到廣泛關(guān)注。本課題組從江香薷中分離了7個(gè)化合物，并從中篩選出具有較強(qiáng)抑制α-葡萄糖苷酶活性的化合物。

1 材料及儀器

江香薷全草于2020年采自新余市分宜縣，全草性狀符合相關(guān)文獻(xiàn)描述[2]，經(jīng)贛南醫(yī)學(xué)院副教授胡海波鑒定為江香薷（Mosla chinensis）。

Inova 500型核磁共振儀，TMS內(nèi)標(biāo);Shimadzu LC-6AD液相色譜儀，制備柱YMC-Pack ODS-A;HP-20大孔吸附樹脂;LH-20型葡聚糖凝膠，Amersham Pharmacia Biotech公司;反相硅膠柱，日本YMC公司;柱色譜硅膠G;硅膠GF254;試劑為色譜純或分析純級別;MK3酶標(biāo)儀（Thermo Lab systems公司）;96孔板（上海一研生物科技有限公司）;PNPG、阿卡波糖（純度≥98%），上海研生實(shí)業(yè)有限公司。

2 提取分離

將6 kg干燥的江香薷地上部分切碎，用95%乙醇回流提取3次，合并提取液，減壓濃縮至無醇味后得乙醇總浸膏。將總浸膏加水混懸，分別用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取。乙酸乙酯部位（38 g）經(jīng)硅膠柱色譜（氯仿∶甲醇，1∶0→1∶1）梯度洗脫得到8個(gè)組分（A-H）。B組分（3.3 g）經(jīng)硅膠柱色譜（石油醚∶乙酸乙酯，3∶1）、Sephadex LH-20柱色譜（甲醇）和制備液相色譜得化合物1（8.5 mg）、化合物2（5.2 mg）和化合物3（7.5 mg）。C組分（8.3 g）經(jīng)硅膠柱色譜和制備液相色譜分別得化合物6（2.8 mg）和化合物7（3.7 mg）。E組分（6.6 g）經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜（甲醇）、硅膠柱色譜（氯仿-甲醇-水，10∶1∶0.1）得到化合物4（3.8 mg）和化合物5（5.6 mg）。

3 化合物鑒定

從江香薷乙酸乙酯部位分離得到的化合物依據(jù)實(shí)驗(yàn)測試結(jié)果，鑒定結(jié)果如下，化合物結(jié)構(gòu)如圖1所示。

（1）化合物1。白色粉末，ESI-MSm/z：435[M+H]+。1H-NMR（MeOH-d4，500 MHz）δ：6.60（1H，s，H-2′），6.40（1H，s，H-2，6），4.32（1H，d，J=5.5 Hz，H-7），2.71，2.59（each1H，m，H-7′），1.98（1H，m，H-8），1.64（1H，m，H-8′），3.60（2H，m，H-9），3.51（2H，m，H-9′），3.87（3H，s，3′-OMe），3.75（6H，s，3，5-OMe），3.39（3H，s，5′-OMe），4.84，4.40（2H，t，-CH2OH）。13C-NMR（MeOH-d4，125 MHz）δ：139.3（C-1），106.9（C-2，6），149.0（C-3，5），134.5（C-4），42.3（C-7），49.8（C-8），64.2（C-9），130.2（C-1′），107.8（C-2′），148.7（C-3′），138.3（C-4′），147.7（C-5′），126.2（C-6′），33.6（C-7′），40.9（C-8′），66.8（C-9′），56.8（3，5-OMe），60.1（3′-OMe），56.6（5′-OMe）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[3]報(bào)道一致，鑒定該化合物（+）lyoniresinol（南燭樹脂酚）。

（2）化合物2。白色粉末，ESI-MSm/z：383[M+Na]+，359[M-H]-。1H-NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：6.62（1H，d，J=1.5 Hz，H-2），6.67（1H，d，J=8 Hz，H-5），6.47（1H，dd，J=8，1.5 Hz，H-6），3.73（1H，d，J=9.5 Hz，H-7），1.83（1H，m，H-8），6.59（1H，s，H-2′），6.07（1H，s，H-5′），2.71～2.61（2H，m，H-7′），1.60（1H，m，H-8′），3.43（2H，m，H-9），3.14（1H，m，H-9′），3.56（1H，m，H-9′），3.68（3H，s，OMe-3），3.69（3H，s，OMe-3′），8.42，8.73（2H，s，Ar-OH），4.84，4.40（2H，t，-CH2OH）;13C-NMR（DMSO-d6，125 MHz）δ：127.1（C-1），111.8（C-2），145.5（C-3），144.1（C-4），116.2（C-5），132.5（C-6），32.3（C-7），38.0（C-8），63.5（C-9），136.2（C-1′），106.6（C-2′），147.8（C-3′），133.7（C-4′），147.6（C-5′），106.6（C-6′），46.5（C-7′），45.7（C-8′），59.7（C-9′），55.5（OMe-3），56.0（OMe-3′，5′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[4]報(bào)道一致，鑒定該化合物為（-）-5-甲氧基異落葉松樹脂素（（-）-5-methoxyisolariciresinol）。

（3）化合物3。無色油狀，ESI-MSm/z：381[M+Na]+，1H-NMR（500 Mz，CDCl3）δ：6.80～6.89（6H，Ar-H），4.78（2H，d，J=4.0 Hz，H-7，7′），4.28（2H，dd，J=9.0，7.0 Hz，H-9a，9a′），3.91（2H，dd，J=9.0，7.0 Hz，H-9b，9b′），3.96（6H，s，3，3′-OCH3），3.15（2H，m，H-8，8′）。13C-NMR（150 Mz，CDCl3）δ：133.1（C-1，1′），108.7（C-2，2′），146.8（C-3，3′），145.4（C-4，4′），114.4（C-5，5′），119.1（C-6，6′），86.0（C-7，7′），54.3（C-8，8′），71.8（C-9，9′），56.1（3，3′-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]報(bào)道一致，鑒定該化合物為pinoresinol（松脂醇）。

（4）化合物4。白色粉末，1H-NMR（500 Mz，MeOH-d4）δ：7.02（1H，brs，H-2），7.14（1H，d，J=8.0 Hz，H-5），6.91（1H，d，J=8.0，1.5 Hz，H-6），6.65（2H，s，H-2′，6′），4.75（1H，brs，H-7），4.71（1H，brs，H-7′），4.25，3.88（each 1H，m，H-9），3.68，3.40（each 1H，m，H-9′），3.12（2H，brs，H-8，8′），3.86（3H，s，3-OCH3），3.84（6H，s，3′，5′-OCH3），4.87（1H，d，J=7.0 Hz，Glc-1）。13C-NMR（125 Mz，MeOH-d4）δ：136.2（C-1），111.6（C-2），151.0（C-3），147.5（C-4），118.0（C-5），119.8（C-6），87.0（C-7），55.5（C-8），72.8（C-9），133.1（C-1′），104.5（C-2′，6′），149.3（C-3′，5′），137.5（C-4′），87.6（C-7′），55.5（C-8′），72.7（C-9′），56.8（3-OCH3），56.8（3′，5′-OCH3），102.8（Glc-1），74.9（Glc-2），77.8（Glc-3），71.3（Glc-4），78.2（Glc-5），62.5（Glc-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道一致，鑒定該化合物為isoeucommin A。

（5）化合物5。白色粉末，1H-NMR（500 Mz，DMSO-d6）δ：6.67（2H，brs，H-2，6），6.61（2H，s，H-2′，6′），4.71（1H，brs，H-7），4.63（1H，brs，H-7′），4.19，3.80（each 2H，m，H-9，9′），3.06（2H，brs，H-8，8′），3.77（6H，s，3，5-OCH3），3.76（6H，s，3′，5′-OCH3），4.90（1H，d，J=7.0 Hz，Glc-1）。13C-NMR（125 Mz，DMSO-d6）δ：137.3（C-1），103.7（C-2，6），152.7（C-3，5），133.8（C-4），85.1（C-7），53.7（C-8），71.3（C-9），131.3（C-1′），102.7（C-2′，6′），148.0（C-3′，5′），135.0（C-4′），85.4（C-7′），53.7（C-8′），71.2（C-9′），56.5（3，5-OCH3），56.1（3′，5′-OCH3），104.2（Glc-1），74.2（Glc-2），76.6（Glc-3），71.2（Glc-4），77.3（Glc-5），61.0（Glc-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道一致，鑒定該化合物為丁香樹脂醇-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（episyringaresinol-4-O-β-D-glucopyranoside）。

（6）化合物6。黃色粉末，1HNMR（400 MHz，DMSO）δ：7.67（1H，d，J=2.0 Hz，H-2′），7.55（1H，dd，J=8.4，2.0 Hz，H-6′），6.89（1H，d，J=8.4 Hz，H-5′），6.39（1H，brs，H-8），6.18（1H，brs，H-6），以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道一致，鑒定該化合物為槲皮素（quercertin）。

（7）化合物7。黃色粉末，1HNMR（400 MHz，DMSO）δ：8.04（1H，d，J=8.0 Hz，H-2′，6′），6.91（1H，d，J=8.0 Hz，H-3′，5′），6.40（1H，brs，H-8），6.16（1H，brs，H-6），以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致，鑒定該化合物為山奈酚（kaempferol）。

4 抑制α-葡萄糖苷酶活性的篩選

參考文獻(xiàn)[9]方法，以PNPG為底物，在96微孔板上測定α-葡萄糖苷酶活性，并用阿卡波糖作為陽性對照。取102 μL磷酸鉀緩沖液（pH6.8），加入6 μLDMSO，15 μLα-葡萄糖苷酶（0.1 U/mL），恒溫（37 ℃）反應(yīng)10 min，加入15 μLPNPG（1.2 mmol/L），恒溫（37 ℃）反應(yīng)10 min，加60 μLNa2CO3，在405 nm 波長處測吸光度值A(chǔ)。計(jì)算酶活性抑制率=[1-（A樣品組-A樣品空白組）/（A陰性組-A空白組）]×100%，用Origin6.0求對應(yīng)的IC50。酶活性抑制作用結(jié)果見表1，由表可知，化合物1、6、7對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用較強(qiáng)，其抑制率分別為88.57%、94.11%、90.18%。IC50分別為（47.15±0.41）mg/L、（39.28±0.30）mg/L、（42.34±0.62）mg/L。

5 酶抑制類型的確定

分別取化合物1、6、7兩個(gè)不同濃度，PNPG取4個(gè)不同濃度，根據(jù)Lineweave-Burk作圖法，分別繪制3個(gè)化合物的抑制作用動(dòng)力學(xué)曲線，見圖2、圖3和圖4。

由上圖可知，化合物1對α-葡萄糖苷酶抑制作用為競爭性抑制，化合物濃度增大而反應(yīng)速度Vmax不變，根據(jù)競爭性抑制動(dòng)力學(xué)方程計(jì)算其Ki為37.6 mg/L?；衔?、7則屬于非競爭性抑制劑，Vmax隨濃度的增大而減小，根據(jù)非競爭性抑制動(dòng)力學(xué)方程求出2個(gè)化合物的Ki分別為156.2 mg/L、3.09 mg/L。

6 結(jié)論

目前對于江香薷多集中于具有抗炎、抗病毒等活性的揮發(fā)油成分的研究，而本課題首次利用體外篩選模型對江香薷乙酸乙酯萃取物抑制α-葡萄糖苷酶活性成分進(jìn)行了研究，從中分離鑒定出7個(gè)化合物。其中，化合物1～5為首次從該植物中分離得到。利用96微孔板PNPG法評價(jià)化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，篩選出較強(qiáng)抑制酶活性的化合物1、6、7，其中化合物1屬于競爭性抑制，化合物6、7屬于非競爭性抑制。本研究有助于加快江香薷資源的現(xiàn)代化開發(fā)，并為深入研究天然AGI藥物提供方向。

參考文獻(xiàn)

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2005.

[2]陳鐘文，吳文茂，等.藥用香薷類植物化學(xué)成分的研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（24）：260-264.

[3]姚奕，許浚，黃廣欣，等.香薷的研究進(jìn)展及其質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測分析[J].中草藥，2020，51（10）：2661-2670.

[4]劉波，劉明韜，甘茂羅，等.瑤山潤楠根的化學(xué)成分研究[J].中國中藥雜志，2012，37（9）：1227-1231.

[5]王瑞，童玲，師彥平.芫花中1個(gè)新的四氫呋喃型木脂素[J].中草藥，2016，47（14）：2408-2411.

[6]楊美珍，王曉琴，李超.彎管列當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)成分研究[J].中草藥，2014，45（17）：2447-2452.

[7]王威，劉小紅，高華，等.東北鐵線蓮地上部位化學(xué)成分研究[J].中草藥，2014，45（17）：2440-2446.

[8]倪付勇，陳重，許瓊明，等.高山紅景天化學(xué)成分研究[J].中草藥，2013，44（7）：798-802.

[9]李婷，張小東，宋聿文，等.一種用微孔板篩選alpha-葡萄糖苷酶抑制劑的方法（英文）[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2005（10）：1128-1134.