基于SNP標(biāo)記的荷包紅鯉與興國紅鯉鑒別研究

王彥云 王濟(jì)世 劉曉夏 趙璐瑤 趙汝婷 楊曙明

摘 要：興國紅鯉和荷包紅鯉是寶貴的紅鯉品種，作為優(yōu)良雜交親本，廣泛應(yīng)用于品種改良和新品種的選育。由于形態(tài)相近、差異較小，在選擇雜交親本的過程中，極易發(fā)生兩種紅鯉的混淆，影響新品種的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。通過閱讀參考文獻(xiàn)，使用數(shù)據(jù)庫位點(diǎn)挑選和性狀基因位點(diǎn)挑選，獲得了8個SNP候選標(biāo)記，理論上使用7個SNP標(biāo)記，即可實現(xiàn)兩種紅鯉的鑒別，且鑒別錯誤率為6.30E-05，這對以兩種紅鯉為雜交親本的新品種選育及養(yǎng)殖效益的提升意義重大，也有利于兩種紅鯉的種質(zhì)資源保護(hù)。

關(guān)鍵詞：興國紅鯉;荷包紅鯉;SNP標(biāo)記;鑒別

紅鯉是極為重要的魚類育種材料之一，興國紅鯉和荷包紅鯉是中國江西省兩個傳統(tǒng)的地方鯉品種，其既可觀賞、又可食用，具有極高的經(jīng)濟(jì)價值[1]。由于具有生長速度快、繁殖率高、抗逆性強(qiáng)和雜交親和力強(qiáng)等特點(diǎn)，兩種紅鯉被廣泛應(yīng)用于品種改良和新品種的選育[2-3]。我國鯉魚養(yǎng)殖品種主要為德國鏡鯉選育系、荷包紅鯉抗寒系、豫選黃河鯉新品系等“三大系列”，其中，荷包紅鯉抗寒系是以荷包紅鯉為雜交親本，通過系統(tǒng)選育得到的一系列生長性狀更優(yōu)、抗逆性更強(qiáng)鯉魚新品種。此外，興國紅鯉在育種方法亦有諸多應(yīng)用，例如，豐鯉、芙蓉鯉、興德鯉等均為以興國紅鯉為親本雜交選育而得的優(yōu)良鯉魚品種。到目前，通過這兩種紅鯉魚和其他當(dāng)?shù)仄胀庺~品種雜交，已經(jīng)繁育出了10多個優(yōu)良的雜交品種，對促進(jìn)我國水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)的發(fā)展起到了很大的作用。兩種紅鯉形態(tài)特征較為相似，這給選育工作者選擇雜交親本造成了困難;同時，由于荷包紅鯉具有更高的經(jīng)濟(jì)價值，也會有興國紅鯉假冒荷包紅鯉之名銷售的情況。因此，對兩種紅鯉的鑒定十分必要，這對在鯉魚新品種資源的開發(fā)和鯉魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的提升具有重大的意義[2，4]。興國紅鯉與荷包紅鯉均產(chǎn)自江西省長江中下游水域，從形態(tài)學(xué)角度來看，荷包紅鯉體粗短，體色呈純紅或橘橙色，體長/體高為2.0～2.3，而興國紅鯉呈紡錘形，體紅色，體長/體高為2.55～3.55[5];從核型學(xué)特征來看，二者染色體組型一樣[6]。兩種紅鯉形態(tài)上雖有差別，但這種差別屬于一個種內(nèi)不同品種或生態(tài)種群間的細(xì)微差異[7]。由于地理因素和人為因素的影響，兩個品種極易混淆，這既不利于雜交親本的選擇，也不利于兩種紅鯉種質(zhì)資源的保護(hù)。單核苷酸多態(tài)性（SNP）是基因組水平上單個堿基的變異所引起的DNA序列的多態(tài)性，屬于第三代遺傳標(biāo)記技術(shù)。由于SNP標(biāo)記具有存在廣泛、富有代表性、遺傳穩(wěn)定性以及易實現(xiàn)分析的自動化等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)鑒定、產(chǎn)品溯源等方面[8-11]。

1 材料與方法

1.1 DNA樣品的準(zhǔn)備

實驗魚分別取自國家級婺源荷包紅鯉良種場和興國縣，兩個紅鯉品種各50條，各樣品取自不同池塘，相互之間不存在親屬關(guān)系。所有樣品均通過國標(biāo)方法進(jìn)行鑒定。所有樣本都用于SNP標(biāo)記的挑選。DNA樣本的提取使用組織DNA提取試劑盒，提取后的樣本使用紫外分光光度計（NanoDrop 2000c）測定濃度和純度，DNA樣本的完整性采用電泳的方法考察。符合標(biāo)準(zhǔn)的樣品于-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 多態(tài)性位點(diǎn)驗證

位點(diǎn)的挑選基于之前研究獲得的大量鯉多態(tài)性位點(diǎn)，所選位點(diǎn)盡可能分布在鯉魚50條染色體鯉魚性狀基因上[12-17]，且位于基因非編碼區(qū)[18-20]。挑選后的位點(diǎn)使用二代測序技術(shù)進(jìn)行基因分型，二代測序由上海翼合應(yīng)用生物技術(shù)有限公司提供支持。

1.3 統(tǒng)計分析

各位點(diǎn)在樣本群體中的等位基因頻率、基因型頻率通過直接計數(shù)方式獲得[21]。偶合概率（MP）計算公式為式（1）[22]：

MP=∏mk=1∑ni=1（P2ki）+∑ni=1∑nj=i+1（2pkipkj）2（1）

式（1）中，m-位點(diǎn)數(shù)、n-位點(diǎn)k等位基因數(shù)、pki（j）-位點(diǎn)k等位基因i、j等位基因頻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性位點(diǎn)驗證

通過大量位點(diǎn)的挑選，共得多態(tài)性位點(diǎn)20個，位點(diǎn)基因名稱、染色體、位置和突變信息如表1。對兩個品種紅鯉共計100個樣本，測定上面20個多態(tài)性位點(diǎn)基因型，分型后對20個多態(tài)性位點(diǎn)在不同紅鯉品種中的基因型以及等位基因頻率進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有一部分位點(diǎn)在兩個紅鯉品種間存在較大多態(tài)性差異，這些位點(diǎn)在一個紅鯉品種中兼具三種基因型，而在另一紅鯉品種中只有一種純合子基因型。我們共獲得這樣的候選標(biāo)記11個，用于2個紅鯉品種的鑒別。由表2可知，11個候選標(biāo)記均與鯉魚頭部和體型等性狀基因相關(guān)，其中，與頭部、體高性狀基因相關(guān)的標(biāo)記就有一半，如SNP14、SNP15、SNP16與鯉魚頭長性狀基因有關(guān)，SNP17、SNP18與鯉魚眼徑、體高和體厚等性狀基因相關(guān)，這與明俊超等[23]對6 個不同鯉群體的形態(tài)差異分析結(jié)果一致，荷包紅鯉和興國紅鯉群體在形態(tài)上存在一定差異和分化，主要體現(xiàn)在體型、頭部和眼部特征上。

2.2 兩種紅鯉鑒定效果評估

由表3可知，所有11個候選多態(tài)性位點(diǎn)，除SNP14、SNP16和SNP18外，其余8個位點(diǎn)在興國紅鯉中均表現(xiàn)出較高的多態(tài)性，兼具兩種純合子和一種雜合子，而在荷包紅鯉中保守，只有一種純合子。這8個標(biāo)記均能用于兩種紅鯉的鑒定，若檢測這些位點(diǎn)上黃河鯉特有的等位基因，則單個標(biāo)記使用時的品種耦合概率（BMP）如附圖所示。所有8個標(biāo)記單獨(dú)使用的品種耦合概率（BMP）在0.040～0.735不等，以耦合概率最小的標(biāo)記SNP5為例，荷包紅鯉群體只有一種純合子“AA”，而興國紅鯉群體兼具兩種純合子“AA”、“GG”以及雜合子“AG”，即等位基因“G”為興國鯉所特有。若未知樣品于標(biāo)記SNP5上檢測出“G”等位基因，則判定樣品為興國紅鯉，耦合概率為0.04，即單獨(dú)使用SNP5標(biāo)記對兩種紅鯉進(jìn)行個體鑒定，每鑒定100個興國鯉個體，僅有4個被誤判為荷包紅鯉。

在實際應(yīng)用中，僅使用單個標(biāo)記遠(yuǎn)不能滿足品種鑒定時群體數(shù)量和準(zhǔn)確度的要求，為了達(dá)到更好的鑒定效果，通常需要增加標(biāo)記的數(shù)目。本研究通過鑒定只在興國紅鯉中出現(xiàn)的等位基因來對兩個紅鯉品種進(jìn)行鑒定，通過多個標(biāo)記共同使用，降低品種耦合概率。按照區(qū)分能力大小對標(biāo)記進(jìn)行排序，并計算不同數(shù)量標(biāo)記組合時品種鑒定耦合概率。從表3我們可以看到，隨著標(biāo)記數(shù)目的增加，兩個品種紅鯉鑒定的耦合概率值在不斷下降，當(dāng)使用區(qū)別能力最好的6個SNP標(biāo)記SNP5、SNP17、SNP15、SNP13、SNP7、SNP19時，MP值僅為萬分之1.23，兩種紅鯉鑒定錯誤的概率不超過萬分之1.23;當(dāng)使用全部7個標(biāo)記時，MP值僅為10萬分之6.30，即兩種紅鯉鑒定錯誤的概率不超過10萬分之6.30。

3 結(jié)論

通過研究我們共獲得了8個SNP候選標(biāo)記，結(jié)合兩種紅鯉在我國的養(yǎng)殖情況和分布范圍，使用5～7個SNP標(biāo)記即可實現(xiàn)兩種紅鯉不同群體數(shù)量的鑒定。據(jù)中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒，2019年江西省鯉魚總產(chǎn)量近15萬t，只需使用7個SNP標(biāo)記就能基本滿足荷包紅鯉和興國紅鯉的鑒定需求。普通小型實驗室使用等位特異性PCR結(jié)合毛細(xì)管電泳的方法[23-24]，即可實現(xiàn)對興國紅鯉和荷包紅鯉的快速鑒別。本研究為兩種紅鯉快速、準(zhǔn)確鑒別提供了新思路、新方法，有利于提高選育工作的效率和可靠性?！?/p>

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Identification of Purse Red Carp and Xingguo Red Carp Based on SNP Markers

WANG Yan-yun，WANG Ji-shi，LIU Xiao-xia，ZHAO Lu-yao，ZHAO Ru-ting，YANG Shu-ming

（Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Quality and Safety of Agricultural Products，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Beijing 100081，China）

Abstract：Xingguo red carp（C.carpio var.xingguonensis）and Purse red carp（C.carpio var.wuyuanensis）are precious red carp varieties.As excellent hybrid parents，they are widely used in variety improvement and breeding of new varieties.Due to the small morphological difference，the confusion of two varieties of red carp is common to occur in the selection of hybrid parents.By reading a large number of references and using database site selection and trait loci selection，we obtained 8 candidate SNP markers.Using 7 SNP markers，the identification error rate of two red carp in China was 6.30E-05，which is of great significance to the conservation and breeding of the germplasm resources of the two breeds.

Keywords：Xingguo red carp;Purse red carp;SNP marker;identification