膿毒癥大鼠急性腎損傷炎性因子的表達(dá)水平及意義

曾 民，佟 晶，張文超，凌 林

(南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院，湖南 衡陽(yáng) 421001)

膿毒癥(sepsis)是嚴(yán)重感染導(dǎo)致宿主反應(yīng)失調(diào)，進(jìn)而引起致命性多器官功能障礙的危重疾病[1]，其同時(shí)出現(xiàn)了組織低灌注，這是由于致病原微生物侵入機(jī)體并繁殖以及其代謝產(chǎn)物在機(jī)體內(nèi)引起微循環(huán)障礙從而誘導(dǎo)嚴(yán)重的炎性反應(yīng)及多器官功能障礙[2]，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球每年超過1 800萬(wàn)嚴(yán)重膿毒癥患者，且每年按1.5%～8.0%的速度增多。目前數(shù)據(jù)也顯示在重癥監(jiān)護(hù)病房中有超過50%的多臟器功能障礙與膿毒癥有關(guān)，并且其中50%～66% 的膿毒癥患者會(huì)發(fā)生急性腎損傷(AKI)，并且其病情發(fā)展迅速，病死率高[3-4]，所以膿毒癥致 AKI 的高發(fā)病率和高病死率已成為重癥醫(yī)學(xué)科面臨的重要難點(diǎn)和挑戰(zhàn)。目前對(duì)于膿毒癥性急性腎損傷與抑制促炎因子的合成和釋放的上游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制尚不清楚，因此本研究以AKI 模型大鼠為載體，考察膿毒癥大鼠NF-κB 信號(hào)通路中關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)蛋白的影響，進(jìn)一步探討AKI病癥下可能的炎癥反應(yīng)作用靶點(diǎn)及調(diào)控機(jī)制，為后續(xù)臨床用藥研究提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取雄性 SD大鼠40只，SPF級(jí)，體重 20～28 g，由南華大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)采用LPS(美國(guó) Sigma 公司)及TNF-a、IL-6、IL-10 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(美國(guó) eBioscience 公司)和p65、IκBα 抗體(英國(guó) Abcam 公司)。

1.2研究方法

1.2.1動(dòng)物模型建立及分組：40只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照24 h組，對(duì)照48 h組，模型24 h組和模型48 h組各10只，對(duì)照24 h組和對(duì)照48 h組大鼠予以腹腔注射生理鹽水2 ml，模型24 h組和模型48 h組大鼠予以腹腔注射脂多糖(15 mg/kg) 2 ml建立膿毒癥急性腎損傷模型。對(duì)照24 h組及模型24 h組于建模術(shù)后24 h后取大鼠腎臟標(biāo)本并凍存，采集大鼠的靜脈血；對(duì)照48 h組及模型48 h組于術(shù)后48 h后取標(biāo)本，本研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2.2血清炎性因子(TNF-a、IL-6、IL-10)水平檢測(cè)：ELISA 檢測(cè)大鼠靜脈血中 TNF-a、IL-6、IL-10含量，兩組均取處死大鼠靜脈血3 ml，2 000 r /min離心10 min，分離所得血清置于-80 ℃ 冰箱備檢。TNF-a、IL-6、IL-10檢測(cè)操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3血清肌酐(SCr)水平及大鼠小便腎損傷分子-1(KIM-1)表達(dá)水平檢測(cè)：采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清KIM-1表達(dá)水平，方法同上，反應(yīng)結(jié)束后各孔于波長(zhǎng) 450 nm 的酶標(biāo)儀上讀取光密度(D)值。采用全自動(dòng)多功能生化分析儀按照步驟進(jìn)行檢測(cè)大鼠血清SCr水平。

1.2.4蛋白免疫印跡法檢測(cè)腎組織中p65，IκBα蛋白表達(dá)水平：稱取適量?jī)龃娴拇笫竽I組織，用RIPA裂解液提取蛋白，并用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。各組取總蛋白樣品50 μg，然后行12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳( SDS PAGE)，再用濕法轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)至硝酸纖維素濾膜上后予以5% 脫脂牛奶封閉 2 h，TBST 洗滌后加入一抗稀釋液( 1∶1 000)，4 ℃孵育1夜。次日 TBST 洗滌后加入辣根過 氧化物酶 ( HRP)藕聯(lián)的羊抗兔 IgG( 1∶1 000)，室溫孵育2 h。TBST 洗膜3次后ECL法顯色，于凝膠成像系統(tǒng)中采集圖像信息分別計(jì)算NF-κB p65及核因子及IκBα蛋白相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠炎性因子水平比較：模型24 h組及模型48 h組大鼠水平炎性因子水平高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，模型48 h組IL-10較模型24 h組下降明顯，但TNF-a、IL-6上升明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠炎性因子水平比較

2.2各組大鼠p65，IκBα蛋白磷酸化水平比較：模型24 h組及模型48 h組大鼠p65，IκBα蛋白磷酸化水平高于對(duì)照組大鼠，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；并且模型48 h組較模型24 h組上升明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠p65，IκBα蛋白磷酸化水平比較

2.3各組大鼠腎功能比較：模型48 h組大鼠KIM-1、SCr水平高于對(duì)照48 h組大鼠，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且模型24 h組KIM-1水平高于對(duì)照24 h組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但模型24 h組SCr水平與對(duì)照24 h組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠腎功能比較

3 討論

膿毒血癥在臨床上是一種十分常見的能夠?qū)е聶C(jī)體多個(gè)臟器功能發(fā)生損傷的病理過程，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜[5]，目前大家多支持全身炎性反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)是其重要因素，由感染等多種誘因?qū)е聶C(jī)體免疫失衡，被炎性反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行級(jí)聯(lián)放大，最終導(dǎo)致全身炎性反應(yīng)綜合征[6-7]，AKI是其嚴(yán)重的常見并發(fā)癥之一。KIM-1是一種腎臟近曲小管上皮細(xì)胞表達(dá)的跨膜蛋白，在正常腎臟內(nèi)表達(dá)極低，近年有研究表明KIM-1可作為急性腎損傷的早期特異性生物標(biāo)志[8]。本實(shí)驗(yàn)中數(shù)據(jù)顯示早期模型24 h組與對(duì)照24 h組SCr差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),模型24 h組及模型48 h組KIM-1表達(dá)水平較對(duì)照24 h組、對(duì)照48 h組均明顯升高(P<0.005)，再次證明KIM-1可以用作早期監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)腎功能的有效指標(biāo)。LPS是革蘭陰性菌外膜的主要成分，可作為膿毒癥動(dòng)物模型建立的主要致病原，能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞及產(chǎn)生大量炎性因子和氧自由基[9]。 TNF-α、IL-6和 IL -1β 是先天免疫系統(tǒng)對(duì)感染最初反應(yīng)的重要促炎因子，能夠引發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴的發(fā)生，并放大機(jī)體的炎性反應(yīng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。 本研究發(fā)現(xiàn)，模型24 h組及模型48 h組TNF-α、IL-6 水平較對(duì)照24 h組、對(duì)照48 h組均明顯升高(P<0.05)，IL-10是一種由B細(xì)胞刺激激活的內(nèi)源性抑炎因子，由B細(xì)胞、T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可以抑制免疫反應(yīng)及應(yīng)答。實(shí)驗(yàn)中模型24 h組及模型48 h組IL-10高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005)，但模型48 h組IL-10較模型24 h組下降明顯，而TNF-a、IL-6上升明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)合實(shí)驗(yàn)中大鼠腎功能改變說明膿毒血癥早期引起大量釋放促炎因子，并導(dǎo)致后期抗炎因子的不足及促炎因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，再次證明TNF-α、IL-6 及 IL-10參與了膿毒血癥性AKI的發(fā)生、發(fā)展過程。

NF-κB 是早期誘導(dǎo)炎性因子釋放的核轉(zhuǎn)錄因子，在靜息狀態(tài)下，NF-κB p65 和胞漿內(nèi)的抑制蛋白IκB結(jié)合以無(wú)活性的復(fù)合物形式存在。當(dāng)機(jī)體遭受刺激后，IκB發(fā)生磷酸化并降解，與NF-κB p65二聚體解離，使NF-κB p65 磷酸化再轉(zhuǎn)移至胞核內(nèi)，從而調(diào)控炎性因子等基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AKI 模型大鼠腎組織中p65，IκBα蛋白磷酸化水平均顯著升高(P<0.05)，并且隨著時(shí)間的推移，大鼠腎組織中p65，IκBα蛋白磷酸化水平升高更加明顯(P<0.05)，且TNF-α、IL-6及IL-10水平較對(duì)照組也顯著上升(P<0.05)，但模型48 h組IL-10較模型24 h組下降明顯(P<0.005)，表明膿毒癥后期大鼠出現(xiàn)免疫抑制表現(xiàn)，表明模型大鼠腎組織中 NF-κB信號(hào)通路被激活，進(jìn)而促進(jìn)了下游炎性因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

綜上所述，NF-κB是膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中的重要通路，是一種多效性、多向性的調(diào)控因子，是致炎-抗炎的核心通路，在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，所以通過本研究可試想尋找一種抑制 NF-κB 通路的藥物治療膿毒癥。