精子DNA損傷對IVF-ET/ICSI助孕患者妊娠結局的影響

龍婷 張慧　　彭露　　唐石歡　　謝巍偉　　賀育蘭　　廖婷　　李卓敏　　劉玲

[關鍵詞] 精子DFI;IVF-ET;ICSI;妊娠結局

[中圖分類號] R711? ? ? ? ? [文獻標識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）15-0104-05

Effect of sperm DNA damage on pregnancy outcome of IVF-ET/ICSI assisted fertility patients

LONG Ting1， 2? ?ZHANG Hui2? ?PENG Lu2? ?TANG Shihuan2? ?XIE Weiwei2? ?HE Yulan2? ?LIAO Ting2? ?LI Zhuomin2? ?LIU Ling2? ?TANG Xian2? ?ZHANG Xianping2

1.Jishou University School of Medicine， Jishou? ?416000， China; 2.Reproductive Medicine Center，Loudi Central Hospital in Hunan Province， Loudi? ?417000， China

[Abstract] Objective To explore the effect of sperm DNA damage on pregnancy outcome of IVF-ET/ICSI patients. Methods A total of 63 patients who underwent IVF-ET/ICSI in Loudi Central Hospital from August 2019 to September 2020 were enrolled. They were divided into three groups according to the level of DFI， including group A： DFI<25% （n=34）， group B： 25%≤DFI≤35% （n=18）， group C： DFI>35% （n=11）. The differences in semen routine analysis （abstinence time， sperm concentration， total motility， PR%）， normal fertilization rate， cleavage rate， available embryo rate， high-quality embryo rate， blastocyst formation rate， implantation rate and clinical pregnancy rate among three groups were compared. Results There was no statistically significant difference between the three groups in general data， including male and female age， BMI （P>0.05）. The difference in abstinence time and sperm concentration between group A and B was not statistically significant（P>0.05）. The vitality and PR% of group C were lower than those of group A and B， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Correlation analysis showed that sperm DFI was negatively correlated with total vitality and PR%（r were -0.362 and -0.290， P<0.05）. Sperm DFI had no correlation with abstinence time and sperm concentration（P>0.05）. The differences in normal fertilization rate， cleavage rate， and usable embryo rate in the three groups were not statistically significant（P>0.05）. The high quality embryo rate and blastocyst formation rate of group B were lower than those of group A， and the difference was statistically significant（P<0.05）.The high-quality embryo rate， blastocyst formation rate， implantation rate and clinical pregnancy rate of group C were all lower than group A， and the difference was statistically significant（P<0.05）. There was no statistically significant difference in indicators among other groups（P>0.05）. Conclusion Sperm DNA damage is negatively correlated with total motility and PR%. Increased sperm DNA damage may lead to a decrease in implantation rate and clinical pregnancy rate in IVF-ET/ICSI patients.

[Key words] Sperm DFI; IVF-ET; ICSI; Pregnancy outcome

女性無避孕性生活至少12個月而未孕，稱為不孕癥，在男性則稱為不育癥[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查顯示，全世界每年約有6000萬余對夫婦存在生育問題，其中男性因素不育患者可高達50%左右[2]。目前精液常規(guī)分析仍是評估男性不育的重要參考指標，但不能全面反應精子的質(zhì)量和功能，缺乏對精子內(nèi)部結構如精子DNA的評估[3]。而精子DNA是男方遺傳信息的載體，在受到內(nèi)、外源性不利因素影響時會形成DNA碎片。目前評判精子DNA碎片的常用指標為DNA碎片指數(shù)（DNA fragmentation index，DFI）。本研究通過檢測精液常規(guī)分析及精子DFI，探討精子DNA損傷對常規(guī)體外受精-胚胎移植（In vitro fertilization embyo transfer，IVF-ET）和卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（Intracytoplasmic sperm injection，ICSI）患者助孕治療后正常受精率、卵裂率、可移植胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、著床率及臨床妊娠率的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對象? 選取2019年8月至2020年9月在婁底市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學中心行IVF-ET/ICSI助孕患者共63周期。本研究經(jīng)醫(yī)院生殖醫(yī)學倫理委員會批準并同意，行IVF-ET/ICSI治療的所有患者夫妻雙方均簽署知情同意書。

1.1.2 IVF-ET/ICSI適應證[4]? ①輸卵管梗阻;②排卵障礙;③子宮內(nèi)膜異位癥;④男方為少、弱精子癥;⑤免疫性不孕（育）。

1.1.3 納入標準? 女方因素：①單純?yōu)榕枨换蜉斅压芤蛩夭辉?②月經(jīng)規(guī)律、卵巢儲備功能正常;③染色體正常。男方因素：染色體正常。

1.1.4 排除標準? ①診斷為多囊卵巢綜合征;②患有嚴重的呼吸、心血管、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病等;③睪丸和睪丸后性因素導致的不育;④患有外傷或感染性疾病;⑤男女雙方任何一方有輔助IVF-ET/ICSI治療禁忌的患者。

1.2 方法

1.2.1 精液采集與分析? 男方在禁欲2～7 d后，通過手淫收集完整的精液樣本，取精前應要求研究對象排空膀胱、洗凈雙手、清洗陰莖，使用統(tǒng)一的無菌標本杯收集完整的精液。取精后立即將樣本送往實驗室，于37℃孵育箱內(nèi)靜置，待精液完全液化后，取小部分精液行精液常規(guī)檢測及DFI檢測。精液常規(guī)檢測根據(jù)《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5版[5]的標準進行分析計數(shù)，對于精子濃度過高的精液樣本（>50×106個/mL），將其精液稀釋，調(diào)整精子濃度成（1～2）×106個/mL。

1.2.2 精子DFI檢測? 采用精子DNA碎片染色質(zhì)擴散（SCD）檢測試劑盒（深圳博銳德公司）檢測精子DNA損傷情況。①檢測方法：嚴格遵循試劑盒的使用說明方法進行檢測。②精子DNA碎片判定標準：精子的頭部僅產(chǎn)生較小光暈或無光量，且單側光暈的厚度不超過精子頭部最小直徑的1/3。根據(jù)精子暈輪寬度與頭部橫徑比值，分為大、中、小和無光暈4個等級，大暈輪：暈輪寬度>2/3精子頭部橫徑;中暈輪：暈輪寬度和精子頭部橫徑比值為1/3～2/3;小暈輪：暈輪寬度<1/3精子頭部橫徑。DNA完整的精子產(chǎn)生擴散的大暈輪或中暈輪，而DNA損傷的精子不產(chǎn)生或產(chǎn)生很小的暈輪。DFI=（小暈輪精子+無暈輪精子）/精子總數(shù)×100%。正常參考值：DFI<25%。

1.2.3 精液優(yōu)化處理方法? 取卵當日精液采取密度梯度離心后上游法優(yōu)化處理，胚胎培養(yǎng)基及精液處理試劑盒均于SAGE公司采購，取卵當日患者手淫取精，精液標本置于37℃熱臺至完全液化，鏡下觀察并記錄優(yōu)化處理前精液常規(guī)，分別取1.5 mL的40%梯度試劑和1.5 mL的80%梯度試劑加入15 mL離心管，使之形成界面清晰的兩層，再加入1.5～3.0 mL完全液化后的精液，150 g離心 20 min后，沉淀混勻后再次150 g，5 min離心2次，收集精子沉淀后置于培養(yǎng)箱中上游待用。

1.3 觀察指標及評價標準

1.3.1 體外受精、胚胎觀察與移植? 女方在本中心常規(guī)行超促排卵方案，經(jīng)陰道B超下監(jiān)測卵泡，根據(jù)血清激素水平及卵泡的大小來決定注射人絨毛膜促性腺激素（HCG）時機;待卵泡成熟后，肌注HCG 10 000 IU，36～40 h后在陰道B超引導下取卵，同時男方手淫取精，常規(guī)IVF授精，授精后16～18 h后觀察原核受精情況，0原核（Pronucleus，PN）、1 PN、≥3 PN的為異常受精，2 PN的為正常受精，66～68 h觀察胚胎情況，優(yōu)質(zhì)胚胎卵裂球為8～10個、碎片不足20%、無空泡。取卵后3～5 d按照我中心常規(guī)行新鮮胚胎移植，移植12～14 d抽血查HCG判斷是否生化妊娠，移植28 d行超聲檢查見孕囊以確定臨床妊娠。根據(jù)患者HCG日雌二醇水平、獲卵數(shù)及相關臨床表現(xiàn)來評估患者發(fā)生卵巢過度刺激綜合征（Ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS）的風險，酌情是否取消本周期鮮胚移植。

1.3.2 公式計算? IVF正常受精率=正常受精數(shù)/獲卵總數(shù)×100%;ICSI正常受精率=正常受精數(shù)/注射MII卵子總數(shù)×100%;卵裂率=卵裂胚胎數(shù)/受精卵子數(shù)×100%;胚胎發(fā)育質(zhì)量：D3日胚胎發(fā)育的形態(tài)作為胚胎發(fā)育質(zhì)量的評估標準，胚胎分為I、Ⅱ、Ⅲ級胚胎，可利用胚胎率=D3日（I+Ⅱ+Ⅲ級胚胎）數(shù)/卵裂胚胎數(shù)×100%;優(yōu)質(zhì)胚胎率=D3日（I+Ⅱ級胚胎）數(shù)/正常受精卵裂胚胎數(shù)×100%;囊胚形成率=囊胚形成數(shù)/囊胚培養(yǎng)數(shù)×100%;著床率=孕囊數(shù)/總移植胚胎數(shù)×100%;臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料符合正態(tài)分布以（x±s）表示，采用單因素方差分析，應用Pearson直線分析DFI與精液參數(shù)的相關性;計數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組患者一般情況比較

三組的男女方年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2 三組精液常規(guī)參數(shù)比較

三組患者禁欲時間及精子濃度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;C組精子總活力和前向運動精子百分率（Progressive sperm rate，PR）均低于A組和B組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;而A、B組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。

2.3 精子DFI與精液常規(guī)參數(shù)相關性分析

精子DFI與禁欲時間無相關性（r=0.094，P>0.05）;精子DFI與精子濃度無相關性（r=-0.063，P>0.05）;精子DFI與總活力呈負相關（r=-0.362，P<0.05）;精子DFI與PR呈負相關（r=-0.290，P<0.05）。見表3。

2.4 三組IVF-ET/ICSI患者妊娠結局比較

三組患者正常受精率、卵裂率及可利用胚胎率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;與A組比較，B組優(yōu)質(zhì)胚胎率和囊胚形成率下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而著床率和臨床妊娠率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），C組優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、著床率和臨床妊娠率均下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與B組比較，C組優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、著床率和臨床妊娠率均略有下降，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表4。

3 討論

目前精液常規(guī)分析為評估精液質(zhì)量的主要參考指標，其主要包括對精子濃度、總活力及PR的評估[6]，但其波動范圍大，極易受禁欲時間、外界環(huán)境及生活方式等影響，不能滿足所有場景下對精子質(zhì)量的檢查要求[7-9]。有研究表明，約15%的男性不育患者精液常規(guī)分析結果正常[10];在精液參數(shù)正常的患者中，約8%的患者精子DFI水平升高[11]。另有學者指出，高度完整的精子DNA對成功受精、維持正常胚胎發(fā)育是不可缺少的[12]。精子DNA的完整性可能直接關系到男性的生育能力，是評估精子質(zhì)量的重要參考指標。

本研究結果顯示，C組總活力和PR均低于A組和B組，差異有統(tǒng)計學意義;此外精子DFI與精子總活力及PR具有負相關，驗證了張丹等[13]研究結論。提示精子DFI越高，精子的前向運動能力越弱，推測精子的運動可能與精子Na+-K+-ATP酶的濃度有關，當DNA發(fā)生損傷時，會引起編碼ATP酶的基因發(fā)生改變，導致ATP酶變性，使ATP不能水解釋放能量，故轉運到精子尾部的能量就會減少，從而導致精子前向活動能力變?nèi)?。而另有研究[14-15]指出，精子DFI與精液參數(shù)無相關性。這可能與納排標準、精子DNA損傷檢測方法及研究對象分組不同有關。

本研究結果提示，A、B、C三組的正常受精率、卵裂率及可利用胚胎率比較;差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;C組患者優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、著床率及臨床妊娠率均低于A組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與梁泳娜等[16]的研究結果相符合。李婷婷等[17]研究發(fā)現(xiàn)，隨著DFI水平增加，IVF受精率、卵裂率顯著下降;但又有研究表明[18-21]，精子DFI不會對受精過程造成影響，與IVF-ET/ICSI妊娠結局無相關性。因此精子DFI與IVF-ET/ICSI胚胎質(zhì)量及妊娠結局是否有關，臨床尚無統(tǒng)一定論。本研究發(fā)現(xiàn)，精子DFI升高（≥25%）對受精卵早期增殖發(fā)育無明顯影響，但高DFI（>35%）會導致著床率和臨床妊娠率下降，推測可能由于成熟卵子受精形成受精卵，繼而卵裂形成2～4細胞胚胎均依賴卵母細胞發(fā)育和成熟階段積累的線粒體RNA，卵母細胞中具有很高的DNA修復酶活性，所以一定量的精子DNA損傷可以得到復制后修復機制的修復。但胚胎發(fā)育至6～8細胞及囊胚期時，父源性基因初步表達，當受到內(nèi)、外源性不利因素的影響時，精子DNA會發(fā)生單鏈或雙鏈的斷裂，若精子DNA損傷程度超過卵母細胞的修復能力，修復機制無法完全修復，那么受精卵的基因組中就會存在新突變體，可致父源基因組完整性異常，帶有DNA碎片的精子能夠與成熟卵母細胞結合受精，其中有缺陷的父源基因激活可損害胚胎的發(fā)育，導致植入前和植入后的胚胎發(fā)育阻滯或停滯，從而影響輔助生殖技術的結局[22]。此推測與Dhawan等[23]研究結果相吻合。

綜上所述，精子DFI升高可能通過降低總活力和PR%，導致男性生育力下降，從而可能影響IVF-ET/ICSI患者妊娠結局。但鑒于本研究的患者數(shù)量有限，后期還需進一步擴大樣本量來進一步證實此結論。

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（收稿日期：2021-01-07）