復(fù)合益生菌粉對小鼠免疫機能的影響研究

黃蕊蕊 劉文正 李亞楠

摘?要：目的：研究復(fù)合益生菌粉在增強免疫力功能方面的作用。方法：采用經(jīng)口灌胃給予方式，設(shè)受試物組3組，分別為低、中、高劑量組，同時設(shè)陰性對照組（生理鹽水），從小鼠體重指標(biāo)、細(xì)胞免疫、體液免疫、單核—吞噬細(xì)胞活性、NK細(xì)胞活性等方面綜合評價復(fù)合益生菌對小鼠體內(nèi)免疫機能的影響。結(jié)果：與空白對照組相比，中、高劑量下的益生菌粉組中的小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)顯著增加（P<0.05）;低、中、高劑量益生菌組中的小鼠碳廓清功能顯著提高（P<0.05）;高劑量組的NK細(xì)胞活性比對照組有顯著性提高（P<0.01）。不同劑量的益生菌給予期間，均未見益生菌粉對小鼠體重、脾臟/體重比值、胸腺/體重比值、足趾腫脹度、淋巴細(xì)胞增殖能力、半數(shù)溶血、巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力有影響。結(jié)論：該復(fù)合益生菌粉能夠增強體液免疫、單核—吞噬細(xì)胞活性和NK細(xì)胞的活性，具有一定的免疫增強功能。

關(guān)鍵詞：益生菌粉;免疫機能;小鼠

近年來，益生元一直是國內(nèi)外研究的熱點，其功能和作用機制備受關(guān)注。許多研究發(fā)現(xiàn)，益生元在調(diào)節(jié)腸道菌群、預(yù)防慢性病、提高機體免疫力等方面具有一定的作用，是良好的免疫激活劑，不僅可以改善宿主腸道微生態(tài)平衡，還可以改善腸道黏膜表面的屏障功能，影響免疫代謝。益生元的攝入導(dǎo)致腸道微生物改變而發(fā)出的刺激信號可使各種免疫細(xì)胞信號通路改變，以促進免疫細(xì)胞的活化和免疫功能的產(chǎn)生，其中增強吞噬細(xì)胞功能現(xiàn)已廣泛用于人類和動物保健與疾病預(yù)防治療過程中[1-7]。已發(fā)現(xiàn)多種特異性益生菌菌株可增強先天性免疫反應(yīng)，特別是吞噬活性和NK細(xì)胞殺傷活性，其中，雙歧桿菌能夠增強免疫球蛋白（IgA）的分泌，促使小腸粘膜上的淋巴細(xì)胞的分化及增殖[8]，并激活自然殺傷細(xì)胞（NK）和巨噬細(xì)胞，生成白介素1（IL-1）、白介素6（IL-6）、白介素12（IL-12）、腫瘤壞死因子ɑ（TNF-ɑ）及干擾素Y等細(xì)胞因子，激活腸粘膜免疫系統(tǒng)，調(diào)節(jié)機體的免疫應(yīng)答，進而增強機體免疫力[9]。植物乳桿菌不僅能夠增強NK細(xì)胞的活性，在進入機體后激活腸黏膜免疫系統(tǒng)，還可作為一種外源性的營養(yǎng)素介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的極化，起到抗突變和防癌、預(yù)防糖尿病和心血管疾病的作用[10-11]，而益生元不僅能夠刺激攝入益生菌的生長，還能夠刺激結(jié)腸中固有益生菌的生長，提高機體免疫力，因此，益生菌和益生元組合對健康影響的機制更為復(fù)雜?；谝嫔亩鄻有怨δ?，雖然研究已經(jīng)證實了其免疫保護增強的作用[12]，但隨著益生菌個性化精準(zhǔn)補充的倡導(dǎo)，益生元與免疫系統(tǒng)的整體作用及其劑量依賴性有待進一步研究。

綜上，對益生元及其對免疫功能影響的深入研究可為其功能的拓展應(yīng)用積累數(shù)據(jù)，但目前針對復(fù)合益生菌粉特異性免疫的研究尚不完善。因此，本實驗研究該實驗條件下不同劑量的益生菌對增強小鼠免疫功能的影響，為益生菌微生態(tài)制劑產(chǎn)品的合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?樣品

益生菌粉：復(fù)合益生菌產(chǎn)品，本實驗所用益生菌粉主要是由植物乳桿菌Lp90、長雙歧桿菌BL21、嗜酸乳桿菌LA85和菊粉、低聚果糖等復(fù)配混合制成的，產(chǎn)品每袋含植物乳桿菌Lp90 1.0×107 CFU、長雙歧桿菌BL21 1.0×107 CFU、嗜酸乳桿菌LA85 1.0×107 CFU，菊粉0.28 g、低聚果糖0.22 g。產(chǎn)品規(guī)格：2 g/袋，推薦食用方法和用量：每日2次、每次1袋。保存條件：密閉、置于干燥陰涼處，冷藏保存效果更佳，保質(zhì)期：6個月。

1.2?實驗動物

本實驗中的SPF級雌性ICR小鼠由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，共240只，其中60只，體重18～22 g，將小鼠隨機分為4組，每組15只，分別進行免疫機制的研究實驗，包括遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗、臟器/體重比值、半數(shù)溶血值測定和抗體生成細(xì)胞能力、碳廓清試驗、巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力、ConA誘導(dǎo)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗和NK活性測定等實驗。

1.3?主要儀器與試劑

主要儀器：分析天平，冷凍離心機、生物安全柜、渦旋儀，二氧化碳培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、倒置顯微鏡等。主要試劑：綿羊紅細(xì)胞（SRBC）、雞紅細(xì)胞、0.9% NaCl 溶液、Hanks液（pH7.2）、RPMI1640培養(yǎng)基、FBS（血清）、雙抗、刀豆蛋白A（ConA）、1%冰醋酸、YAC-1細(xì)胞、（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽、PBS、補體、SA緩沖液、碘硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲基酯硫酸鹽、氧化型輔酶I、印度墨汁、0.1%Na2CO3、Giemsa染液等。

1.4?劑量選擇與受試物飼喂方式

益生菌粉的推薦成人每日攝入量為4 g/60 kg BW。本實驗設(shè)定低、中、高劑量設(shè)為人體推薦攝入量的5、10、30倍，即0.333、0.667、2.000 g/kg BW，其中去離子水作為空白陰性對照組。稱取0.333 g、0.667 g、1.000 g分別用去離子水定容至20 mL，各劑量組及陰性對照組均按20 mL/kg BW灌胃給藥，連續(xù)給予受試物30 d，每周根據(jù)體重調(diào)整灌胃量，活殺小鼠并測定各項免疫指標(biāo)。

1.5?實驗方法[13]

1.5.1?小鼠臟器/體重比值測定實驗[13]?將給與不同劑量益生菌粉的小鼠進行稱重，處死后解剖得到脾臟和胸腺，置于生理鹽水中洗去血液，并用濾紙吸干表面殘留的血水，稱重，計算脾臟/體重比值和胸腺/體重比值。

1.5.2?足趾增厚法（DTH）測定遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)[13]取新鮮的羊血，玻璃棒沿同一方向攪拌去除纖維后，用生理鹽水洗滌3次（2 000 r/min，10 min）后分別稀釋至20%和2%（v/v）。于小鼠腹腔中注射2%的SRBC 0.2 mL，注射4 d后，精確測量小鼠的左后足趾厚度。然后在測量部位局部注射20% SRBC 20 μL，24 h后觀察并精準(zhǔn)測量左后足趾厚度，以注射前后小鼠足趾厚度的差值，即足趾腫脹度來表征DTH的程度。

1.5.3?ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗[13]?將處死的小鼠置于75%酒精中滅菌10 min，無菌環(huán)境下取出脾臟，并加入滅菌后的Hanks液清洗3次，每次1 000 r/min離心10 min，計數(shù)活細(xì)胞數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2*107個/mL，每孔加入0.2 mL細(xì)胞懸液，再加入培養(yǎng)基至1 mL，其中一孔中加入75 μL ConA液（7.5 μg/mL），另一孔作為空白對照，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，棄掉上清液，并加入新鮮的 RPM1640不完全培養(yǎng)基，同時加入MTT（5mg/mL）50 μL，繼續(xù)孵育4 h。結(jié)束后去掉上清液，每孔加入1 mL異丙醇，震蕩溶解后，置于酶標(biāo)儀上測定吸光度（570 nm）。

淋巴細(xì)胞的增殖能力=OD加ConA孔-OD不加ConA孔

1.5.4?改良玻片法檢測抗體生成細(xì)胞[13]?取新鮮的羊血，玻璃棒沿同一方向攪拌去除纖維后，用生理鹽水洗滌3次（2 000 r/min，10 min）后稀釋至2%（v/v）。于小鼠腹腔中注射2%的SRBC 0.2 mL，4 h后，取出脾臟，制成單細(xì)胞懸液，并調(diào)整濃度至2*107個/mL，待用。將1 mL壓積SRBC加入5 mL小鼠血清中，4℃下放置30 min，多次震蕩，離心取上清，作為補體，待用。將表層培養(yǎng)基置于45 ℃保溫，與等體積2倍濃度的Hank’s液混勻后，分裝于試管中，每管加入0.5 mL，再加入10%（v/v）SRBC 50 μL和脾單細(xì)胞懸液20 μL，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1.5 h，然后加入補體，置于玻片凹槽內(nèi)，培養(yǎng)2.0 h后，計數(shù)溶血空斑數(shù)。

1.5.5?血清溶血素溶血值的檢測[13]?取新鮮的羊血，玻璃棒沿同一方向攪拌去除纖維后，用生理鹽水洗滌3次（2 000 r/min，10min）后稀釋至2%（v/v）。于小鼠腹腔中注射2%的SRBC 0.2 mL，4 h后，摘眼球取小鼠血液于離心管中，靜置1 h后，2 000 r/min離心10 min，收集上層血清。將血清稀釋300倍后取 0.1 mL，置96孔板內(nèi)，依次加入10%（v/v）SRBC 0.05 mL，補體0.1 mL，置于37 ℃水浴30 min后，置于冰上終止反應(yīng)。1 500 r/min離心10 min，取上清液0.05 mL，加文齊氏試劑0.15 mL，同時，取10%（v/v）SRBC 0.0125 mL，加文齊氏試劑至0.2 mL，作為空白對照。用酶標(biāo)儀（540 nm）測定各孔的吸光度。溶血素的量以半數(shù)溶血值（HC50）表示，按式（1）計算：

樣品HC50=（OD樣品/ODSRBC半數(shù)溶血）×稀釋倍數(shù)（1）

1.5.6?小鼠碳廓清試驗[13]?將印度墨汁用生理鹽水稀釋4倍后尾靜脈注入小鼠體內(nèi)，在注射墨汁后2 min和10 min，從小鼠眼內(nèi)呲靜脈叢取血20 μL，加到2 mL 0.1% Na2CO3溶液中，用酶標(biāo)儀在600 nm波長處測定吸光度值，以Na2CO3溶液作空白對照。將小鼠進行稱重后處死。取出肝臟和脾臟，置于生理鹽水中洗滌后，濾紙吸干表面殘留血污稱重。按式（2）計算吞噬指數(shù)（a）：

1.5.7?小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實驗[13]?經(jīng)小鼠腹腔注射5%的雞紅細(xì)胞懸液1 mL，2.5 h后，處死小鼠，仰位，注射生理鹽水洗液2 mL至小鼠腹腔，轉(zhuǎn)動小鼠1 min后，吸出生理鹽水洗液1 mL，分別均勻的滴于2片載玻片上，移至37℃孵箱中孵育30 min。然后用生理鹽水漂洗載玻片后干燥。在丙酮甲醇溶液（1：1）中固定后，用4%的Giemsa-磷酸鹽緩沖液進行染色3 min，漂洗晾干。油鏡下計數(shù)，通過觀察巨噬細(xì)胞的形態(tài)，按式（3）～（4）計算。

吞噬率（%）[13]=吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/總巨噬細(xì)胞數(shù)×100（3）

吞噬指數(shù)[13]=被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/總巨噬細(xì)胞數(shù)（4）

1.5.8?乳酸脫氫酶LDH法測定NK細(xì)胞活性[13]?將靶細(xì)胞YAC-1培養(yǎng)24 h后，棄掉上清，清洗3次后，消化收集制成細(xì)胞懸液（4*105個/mL）。小鼠處死后置于75%乙醇中滅菌，無菌條件下取脾，制成脾的單細(xì)胞懸液，作為效應(yīng)細(xì)胞。然后用臺盼藍活細(xì)胞染色計數(shù)，調(diào)整效應(yīng)細(xì)胞的濃度為2*107個/mL，效靶比為50：1。取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞溶液各100 μL，加入U型96孔板中，其中靶細(xì)胞自然釋放孔中僅加靶細(xì)胞100 μL和培養(yǎng)液100 μL，靶細(xì)胞最大釋放孔加靶細(xì)胞100 μL和1%NP40 100 μL，均設(shè)3個平行孔，培養(yǎng)4 h后，離心5 min，吸取上清100 μL置于新的96孔板中，加入LDH基質(zhì)液100 μL，避光反應(yīng)10 min后，加入HCL溶液（1mol/L）30 μL終止反應(yīng)，在492 nm處測定吸光度值。按式（5）計算NK活性：

NK活性=（OD反應(yīng)孔-OD自然釋放孔）/（OD最大釋放孔-OD自然釋放孔）× 100（5）

1.6?數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS 10.0進行t檢驗及相關(guān)分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?益生菌粉對小鼠體重的影響

飼喂益生菌粉期間，小鼠活動正常，生長發(fā)育良好，未觀察到異常體征或死亡，由表1～4可見，小鼠在攝入不同劑量的益生菌粉30 d后，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，其體重在各劑量組與對照組間比較無顯著性差異（P>0.05），均表明體重增長正常，該益生菌粉長期口服安全性良好。

2.2?益生菌粉對小鼠臟器/體重比值的影響

如表5所示，小鼠在攝入不同劑量的益生菌30 d后，各組的脾臟/體重比值與對照組相比無明顯差異（P>0.05），其胸腺/體重比值在各劑量組與對照組間比較無顯著性差異（P>0.05）。

2.3?益生菌粉對小鼠細(xì)胞免疫機能的影響

2.3.1?益生菌粉對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響?如表6所示，各劑量組對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)無顯著影響（P<0.01）。

2.3.2?益生菌粉對ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗的影響?如表7所示，給小鼠喂食不同劑量的益生菌粉30 d后，各劑量組的益生菌粉對小鼠的淋巴細(xì)胞增殖能力無顯著性差異（P<0.05）。

2.4?益生菌粉對體液免疫的影響

2.4.1?益生菌粉對抗體生成細(xì)胞數(shù)的影響?如表8所示，給小鼠喂食不同劑量的益生菌粉30 d后，其抗體生成細(xì)胞數(shù)在中、高劑量組中有顯著性增加（中劑量P<0.05、高劑量P<0.01），表明隨著益生菌粉攝入劑量的提高，抗體生成細(xì)胞數(shù)顯著升高，具有一定的劑量依賴性。

2.4.2?益生菌粉對小鼠半數(shù)溶血值（HC50）的影響由表9可見，給小鼠喂食不同劑量的益生菌粉30 d后，其半數(shù)溶血值（HC50）在各劑量組與對照組間比較無顯著性差異（P>0.05）。

2.5?益生菌粉對小鼠單核—巨噬細(xì)胞吞噬功能的作用

2.5.1?益生菌粉對小鼠單核-巨噬細(xì)胞碳廓清能力的作用?由表10可見，給小鼠喂食不同劑量益生菌粉30 d后，其碳廓清功能在低、中劑量組與對照組間相比具有顯著的提高（P<0.05）。

2.5.2?益生菌粉對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力的影響?由表11可見，給小鼠喂食不同劑量的益生菌粉30 d后，其吞噬率和吞噬指數(shù)在各劑量組之間以及與對照組相比均無顯著性差異（P>0.05）。

2.6?益生菌粉對小鼠NK細(xì)胞活性的影響

由表12可見，給小鼠喂食不同劑量的益生菌粉30 d后，高劑量益生菌粉組中小鼠的NK細(xì)胞活性有顯著提高（P<0.01），而低劑量和中劑量組與陰性對照組無顯著性差異，表明該復(fù)合益生菌粉增強NK細(xì)胞活性的能力具有一定的劑量依賴性。

3?討論

益生菌和益生元的功能復(fù)雜多樣，不同益生菌的免疫激活和調(diào)節(jié)機制不同，本研究中所用的復(fù)合益生菌粉對體液免疫、單核—巨噬細(xì)胞吞噬功能增強具有一定的增強作用，在本研究劑量下對細(xì)胞免疫和NK細(xì)胞活性的影響作用不顯著，依據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)，上述四類實驗中任兩個結(jié)果陽性，可表明本益生菌粉具有增強免疫力的功能。

綜上，給小鼠喂食不同劑量的益生菌粉30 d后，該益生菌粉對細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)作用不顯著，而其抗體生成細(xì)胞數(shù)在中、高劑量組與對照組相比具有顯著性差異（中劑量P<0.05、高劑量P<0.01），該結(jié)果提示，該復(fù)合菌粉可增強小鼠的體液免疫功能，其碳廓清功能在低、中、高劑量組與對照組相比均有顯著性差異（P<0.05），而益生菌粉對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力在各劑量組與對照組均無顯著性差異，兩個實驗中的任一實驗的兩個劑量組結(jié)果陽性可表明，該復(fù)合益生菌粉具有一定的單核—吞噬細(xì)胞的免疫增強作用;NK細(xì)胞活性僅在高劑量組顯示與對照組具有顯著性差異（P<0.01），該陽性結(jié)果依據(jù)不足，有待進一步研究。本次實驗未見益生菌粉對小鼠體重、脾臟/體重比值、胸腺/體重比值、足趾腫脹度、淋巴細(xì)胞增殖能力有影響，主要原因可能是：動物自身對臟器指標(biāo)和體重具有一定的自我調(diào)節(jié)能力，因此會在一定的范圍內(nèi)波動變化，除非在特殊生理狀態(tài)下才會發(fā)生顯著變化;免疫系統(tǒng)具有一定的動態(tài)性和自身調(diào)節(jié)性，也解釋了本研究中淋巴細(xì)胞的增值未見明顯差異的現(xiàn)象，而且免疫調(diào)節(jié)的機制通路復(fù)雜，該益生菌粉對細(xì)胞免疫的淋巴細(xì)胞增殖不顯著表明其對特異性免疫的增強效果小于非特異性免疫的效果，有待進一步深入研究。

本研究中的益生菌粉主要是由植物乳桿菌Lp90、長雙歧桿菌BL21、嗜酸乳桿菌LA85和菊粉、低聚果糖等復(fù)配混合制成，其多功能的免疫增強活性與其組成成分相關(guān)。本研究結(jié)果表明，復(fù)合益生菌粉對免疫力有有益調(diào)節(jié)的作用，與蔡玟[14]、潘香香[15]等的研究結(jié)果較一致。據(jù)報道，植物乳桿菌在口服后能夠通過誘導(dǎo)IL-12的釋放增強NK細(xì)胞的活性，通過穿孔素和顆粒酶的釋放，保護機體免受感染源的侵襲[16]。Alberto Finamore等[17]研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌與長雙歧桿菌的復(fù)合益生菌能夠通過影響初始T細(xì)胞、記憶T細(xì)胞，B細(xì)胞、Treg和NK細(xì)胞，提高人體的免疫力，其中，兩株益生菌的混合物并沒有改變NK細(xì)胞的總數(shù)，但增加了NK的活性，從而改善了先天性免疫，與本研究結(jié)果一致。

益生菌粉實現(xiàn)上述四種免疫調(diào)節(jié)作用主要通過以下幾種機理[18-19]，首先，口服益生菌粉后，促進腸道粘膜細(xì)胞的修復(fù)，保證屏障功能的完整性，在維持腸道免疫平衡方面起著重要作用;其次，益生菌粉引起的腸道菌群的改變，可能會局部持續(xù)激活先天和獲得性免疫，并調(diào)節(jié)IgA在腸道中的分泌，防止病原體的侵入和感染;此外，益生菌還可以直接刺激腸道中的抗原呈遞細(xì)胞，刺激腸道免疫系統(tǒng);最后，益生菌能夠調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞等，影響細(xì)胞因子的釋放從而參與自身免疫或其他炎癥性疾病。針對本研究中的復(fù)合益生菌粉的具體調(diào)節(jié)機制，與成分、劑量、和免疫系統(tǒng)自身調(diào)節(jié)的復(fù)雜性有關(guān)，相關(guān)具體機制有待進一步研究。

綜上，該實驗條件下的益生菌粉未對小鼠產(chǎn)生負(fù)面影響，并能夠從多方面增強小鼠的免疫機能。

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