黑骨藤LC-MS定性分析及4種綠原酸一測(cè)多評(píng)分析方法

李 琪， 王 博， 李晨陽(yáng)， 趙喜玲， 陳 坤， 張 宏*

（1.四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都610101； 2.四川師范大學(xué) 植物資源應(yīng)用與開(kāi)發(fā)研究所，四川 成都610101）

黑骨藤（Periploca forrestiiSchltr.）為蘿藦科（Asclepiadaceae）杠柳屬（Periploca Linn）植物，又名黑龍骨（HLG），曾用于治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和一些創(chuàng)傷［1］.現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證明，黑骨藤具有抗氧化［2］、抗炎［3］、抗癌［4］、神經(jīng)保護(hù)［5］等作用.然而，黑骨藤的化學(xué)成分復(fù)雜，各種化學(xué)成分的極性差異很大，這使得很難對(duì)其進(jìn)行定性研究.目前，黑骨藤化學(xué)成分相關(guān)研究報(bào)道較多，成分包含揮發(fā)油、皂苷、杠柳苷等多種類(lèi)型化合物，并已建立了HPLCQ-TOF-MS對(duì)其進(jìn)行定量測(cè)定［6-7］.近年來(lái)，一種新的、簡(jiǎn)單快速的技術(shù)——UPLC-Q-TOF-MS得到了廣泛應(yīng)用，它可提供關(guān)于特征分子離子和碎片離子的準(zhǔn)確的質(zhì)量信息，在代謝物的鑒定和結(jié)構(gòu)解析中起著重要的作用［8-9］.因此，本研究采用UPLC-QTOF-MS技術(shù).

外標(biāo)法是最常用的評(píng)價(jià)方法之一，由于一些對(duì)照品具有高成本、化學(xué)多樣性和檢測(cè)的不穩(wěn)定性等因素，使其具有局限性［10-11］.為了解決這一問(wèn)題，王智民等［12］首次系統(tǒng)地提出了一測(cè)多評(píng)法（QAMS）.中國(guó)藥典（2015版）已報(bào)道此法適用于中藥材的含量測(cè)定［13］，其優(yōu)點(diǎn)是每種分析物的含量可以獨(dú)立測(cè)定，并且可以減少實(shí)驗(yàn)成本和檢測(cè)時(shí)間［14-15］.基于目前關(guān)于黑骨藤Q(mào)AMS法的缺乏，本文采用了QAMS法，以隱綠原酸為內(nèi)標(biāo)物，分別計(jì)算其與綠原酸、異綠原酸C、新綠原酸的相對(duì)校正因子（RCF）而得出其含量，從而建立黑骨藤中4種綠原酸的一測(cè)多評(píng)分析方法，為黑骨藤的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了一種快速、實(shí)用、有效的方法.

1 材料、試劑與方法

甲醇、乙醇（分析純，成都市科龍化工試劑廠）；乙腈（色譜純，美國(guó)天地試劑公司）；磷酸、甲酸、醋酸（色譜純，成都市科龍化工試劑廠）；硅膠（200～300目，青島海浪硅膠干燥劑廠）.綠原酸、新綠原酸（成都瑞恩思生物科技有限公司），隱綠原酸、杠柳毒苷、原花青素A1、原花青素A2、異綠原酸C（深圳市斯坦德合成有限公司）.所有對(duì)照品經(jīng)UPLC峰面積歸一化法檢測(cè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%.

1.3 色譜條件

1.3.1 UPLC-Q-TOF-MS色譜條件 色譜柱：Eclipse Plus-C18（100 mm×4.6 mm，1.8μm）.流速：0.7 mL/min.柱溫：30℃.進(jìn)樣量：5μL.檢測(cè)波長(zhǎng)：221 nm.流動(dòng)相：流動(dòng)相A（體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸溶液）；流動(dòng)相B（體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸乙腈）.梯度洗脫程序：0～8.0 min，95%～85%A；8.0～12.0 min，85%～82%A；12.0～20.0 min，82%A；20.0～25.0 min，82%～80%A；25.0～40.0 min，80%～70%A；40.0～60.0 min，70%～5%A.質(zhì)譜條件：正負(fù)離子掃描模式.掃描范圍（m/z）：100～1 500.霧化氣（GS1）：50 psi.霧化氣（GS2）：50 psi.氣簾氣（CUR）：30 psi.離子源溫度（TEM）：-550℃，600℃.離子源電壓（IS）：-4 500 V、5 500 V.一級(jí)掃描：去簇電壓（100 V）；聚焦電壓（10 V）.二級(jí)掃描：采用IDA模式，CID能量為20、40和60 V.

1.3.2 QAMS法色譜條件 色譜柱：ZORAX SB C18（2.1 mm×100 mm，1.8μm）.流速：0.3 mL/min.柱溫：40℃.檢測(cè)波長(zhǎng)：325 nm.進(jìn)樣量：1μL.流動(dòng)相A：甲醇；流動(dòng)相B：體積分?jǐn)?shù)為0.1%的磷酸水溶液（pH=3.0）.梯度洗脫程序：0～10.0 min，5%～25%A；10.0～25.0 min，25%～40%A；25.0～30.0 min，40%～60%A.

1.4 混合對(duì)照品溶液的制備 稱取新綠原酸（6.70 mg）、綠原酸（7.54 mg）、隱綠原酸（4.71 mg）和異綠原酸C（4.84 mg）、原花色素A1（4.25 mg）、原花色素A2（4.39 mg）和杠柳毒苷（4.48 mg）于10 mL容量瓶中，色譜甲醇溶解定容到刻度以制備混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，再經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后待用.

1.5 供試品溶液制備 稱取已活化的硅膠200 g于1 L燒杯中，采用濕法裝柱，加入600 mL石油醚攪拌均勻裝柱.粉碎黑骨藤樣品，過(guò)3號(hào)藥典篩.稱取50 g干粉于1 L錐形瓶中，按料液比1∶20，加入體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇1 L，超聲（功率200 W，頻率40 kHz）提取30 min，提取溫度50℃，提取2次.將2次提取液合并減壓濃縮旋干至干粉.取5 g干粉于50 mL燒杯中，添加10 g硅膠，加入40 mL甲醇，于通風(fēng)櫥中待自然風(fēng)干成細(xì)粉末后上樣.依次用石油醚、V（石油醚）∶V（乙酸乙酯）=1∶1、乙酸乙酯、V（乙酸乙酯）∶V（甲醇）=1∶1、甲醇洗脫，最終收集乙酸乙酯片段和V（乙酸乙酯）∶V（甲醇）=1∶1片段.稱取上述2個(gè)片段各10 mg加入5 mL甲醇于離心管中，超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz）30 min，離心10 min（12 000 RPM，4℃）.取上層清液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，200μL體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇溶液溶解，經(jīng)0.22μm微孔膜過(guò)濾后，供UPLC-Q-TOF-MS分析.

在QAMS方法建立中，將S1樣品收集粉碎，過(guò)3號(hào)藥典篩.稱取1 g左右的干粉于50 mL錐形瓶中，按料液比1∶20，加入體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇20 mL，超聲提取30 min（功率200 W，頻率40 kHz），提取溫度50℃，提取1次，抽濾、減壓濃縮旋至近干，色譜甲醇洗3次轉(zhuǎn)移到5 mL容量瓶中，定容得黑骨藤供試品溶液.

從圖2可看出，谷索的就位對(duì)吊索索力影響很小；脊索就位對(duì)不同索的索力影響不同；膜的安裝將提高吊索的索力。

1.6 QAMS方法學(xué)考察

1.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測(cè)限、定量限 精密移取混合對(duì)照品溶液各0.3、0.5、0.8、1.0、2.0、4.0 mL，分別用色譜甲醇定容于10 mL容量瓶中.每個(gè)濃度平行測(cè)定3次，記錄混合對(duì)照品的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，建立隱綠原酸、異綠原酸C、新綠原酸、綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù).選取最低濃度對(duì)照品，采用逐級(jí)稀釋方法，每次稀釋2倍，按照色譜條件進(jìn)行檢測(cè).借助信噪比，以S/N=3為檢測(cè)限，以S/N=10為定量限.

1.6.2 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加標(biāo)回收率 平行測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和S1供試品溶液6次，以考察儀器精密度和樣品精密度.選取6份1.000 g的S1號(hào)黑骨藤樣品考察重復(fù)性，并在0、2、4、6、8、10、12、24和48 h對(duì)供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，以獲得其穩(wěn)定性.選取3份5.000 g的S1號(hào)黑骨藤樣品，每份按藥材與對(duì)照品質(zhì)量比約1∶1的量加入對(duì)照品，根據(jù)（1）式［16］計(jì)算每種分析物的加標(biāo)回收率.精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加標(biāo)回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均用RSD表示.

1.7 RCF的測(cè)定及評(píng)價(jià)精密移取混合對(duì)照品溶液各0.3、0.5、0.8、1.0、2.0、4.0 mL，色譜甲醇定容于5 mL容量瓶，色譜甲醇定容至刻度，搖勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜.由于在一定的線性范圍內(nèi)，組分的濃度與檢測(cè)器的響應(yīng)成正比［10］，本次實(shí)驗(yàn)以隱綠原酸為內(nèi)參物，對(duì)每個(gè)濃度平行測(cè)定3次，分別運(yùn)用（2）式［11］計(jì)算隱綠原酸相對(duì)于其他組分的相對(duì)校正因子（RCF），用f表示，并計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD.As為內(nèi)參物峰面積，Ws為內(nèi)參物質(zhì)量，Ai為其他組分的峰面積，Wi為其他組分的質(zhì)量.

分析物的濃度是影響RCF的主要參數(shù)之一，但RCF還受其他實(shí)驗(yàn)條件的影響［11］.本次實(shí)驗(yàn)考察了不同色譜柱及其溫度和不同進(jìn)樣量對(duì)RCF的影響以驗(yàn)證其穩(wěn)定性.

1.8 待測(cè)成分色譜峰的定位待測(cè)成分色譜峰的準(zhǔn)確定位是建立QAMS的前提和關(guān)鍵，主要有2種主要的峰定位方法，保留時(shí)間RT（retention time）和待測(cè)成分與內(nèi)標(biāo)物之間的相對(duì)保留時(shí)間RRT（relative retention time）［15］.本實(shí)驗(yàn)以隱綠原酸與其他3種組分的相對(duì)保留時(shí)間值對(duì)黑骨藤中待測(cè)成分色譜峰進(jìn)行定位.

1.9 外標(biāo)法與一測(cè)多評(píng)法的比較分別用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法計(jì)算S1～S8不同產(chǎn)地黑骨藤中隱綠原酸、異綠原酸C、新綠原酸、綠原酸的含量，基于t檢驗(yàn)、相關(guān)系數(shù)R［17］、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD［18］和相對(duì)誤差δ［19］，驗(yàn)證一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法是否存在差異性.

2 結(jié)果

2.1 UPLC-Q-TOF-MS結(jié)果各洗脫片段UPLC分析結(jié)果如圖1所示.

圖1 硅膠柱層析洗脫色譜圖Fig.1 Chromatogram of silica gel column chromatography elution

分析可知：石油醚片段和甲醇片段含有少量的峰，而在其他2個(gè)片段中含有大量的峰，且其中有的峰與石油醚片段和甲醇片段中的有所重復(fù)，表明大多數(shù)組分存在于乙酸乙酯片段和V（乙酸乙酯）∶V（甲醇）=1∶1片段中，故最終選擇上述2個(gè)片段用于定性分析，它們的總離子流色譜圖如圖2所示，具體參數(shù)見(jiàn)表2.通過(guò)比較分子式、保留時(shí)間tR、準(zhǔn)分子離子和產(chǎn)物離子，質(zhì)量誤差均在8.6×10-6以內(nèi)，共分離鑒定出10種化合物.

圖2 黑骨藤提取物總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatograms of the extracts from HLG

表2 黑骨藤提取物中被鑒定出的10種成分Tab.2 Identification of 10 components in HLG extracts

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果回歸分析的結(jié)果見(jiàn)表3，相關(guān)系數(shù)R≥0.999 5，表明所有組分均表現(xiàn)出良好的線性，回歸方程可用于給定濃度范圍內(nèi)的定量分析.由表4可得RSD值均小于2.0%，表明本方法具有良好的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性，穩(wěn)定可行.

表3 4種綠原酸的線性關(guān)系Tab.3 Linear relationship of 4 chlorogenic acids

表4 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加標(biāo)回收率結(jié)果（n＝6）Tab.4 Results of precision，stability，repeatability and recovery（n＝6）

2.3 RCF的測(cè)定及評(píng)價(jià)結(jié)果如表5所示，f1（隱綠原酸/異綠原酸C）、f2（隱綠原酸/新綠原酸）、f3（隱綠原酸/綠原酸）的RSD值分別為1.71%、1.41%、1.17%，均小于2%，說(shuō)明3者的RCF都符合定量要求，以隱綠原酸為內(nèi)標(biāo)物來(lái)計(jì)算其余3種化合物含量的方法是切實(shí)可行的.在表6～8中的RSD值均小于2%，說(shuō)明已測(cè)定的RCF值在不同的色譜柱、柱溫和進(jìn)樣量的條件下均具有良好的穩(wěn)定性.

表5 相對(duì)校正因子計(jì)算結(jié)果Tab.5 Calculation results of RCFs

表6 不同柱溫時(shí)的相對(duì)校正因子結(jié)果Tab.6 RCFs based on different column temperatures

表7 不同進(jìn)樣量時(shí)的相對(duì)校正因子結(jié)果Tab.7 RCFs based on different injection volumes

表8 不同色譜柱時(shí)的相對(duì)校正因子結(jié)果Tab.8 RCFs based on different columns

2.4 待測(cè)成分色譜峰的定位結(jié)果如圖3所示，待分析物于23 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了良好的分離.異綠原酸C、新綠原酸、綠原酸的相對(duì)保留時(shí)間分別為2.015、0.626和0.908 min，其RSD值分別為1.98%、1.72%和1.85%，均小于5%，表明峰的識(shí)別結(jié)果可靠，可用于色譜峰的定位.

圖3 UPLC色譜圖Fig.3 Chromatograms of the sample

2.5 外標(biāo)法與一測(cè)多評(píng)法的比較結(jié)果分別以一測(cè)多評(píng)法和外標(biāo)法測(cè)定S1～S8樣品中異綠原酸C、新綠原酸、綠原酸的含量.結(jié)果如表9所示，P值分別為0.956、0.983、0.995，均大于0.05，相關(guān)系數(shù)R均大于0.999 3，同時(shí)相對(duì)誤差δ和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值均小于5%.表明一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法無(wú)顯著差異，說(shuō)明將一測(cè)多評(píng)法應(yīng)用于黑骨藤中4種綠原酸含量測(cè)定研究基本可行.

表9 外標(biāo)法與一測(cè)多評(píng)法的比較結(jié)果Tab.9 Comparison of External Standard Method and QAMS

3 討論

3.1 硅膠柱層析洗脫體系的選擇由于黑骨藤中化學(xué)成分極性差距較大，為使大部分成分均能被分離出來(lái)，故本實(shí)驗(yàn)選取石油醚-乙酸乙酯-甲醇為洗脫體系.極性小的石油醚先除去黑骨藤中的色素、油脂等成分，再利用乙酸乙酯將中等極性成分洗脫出來(lái)，再利用V（乙酸乙酯）∶V（甲醇）=1∶1將極性大的部分洗脫出來(lái)，最后利用甲醇將硅膠柱洗脫干凈，分離出不同極性片段.

3.2 一測(cè)多評(píng)法色譜條件的確定考察了流動(dòng)相體系（乙腈-水、甲醇-水、乙腈-醋酸、甲醇-醋酸、乙腈-磷酸、甲醇-磷酸、乙腈-甲酸、甲醇-甲酸）和流動(dòng)相pH（2.5、3、3.5、4.0），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)流動(dòng)相為甲醇-甲酸體系且pH=3時(shí)，被檢測(cè)物質(zhì)峰形尖銳，無(wú)拖尾現(xiàn)象，且分離度都在1.5以上.運(yùn)用Aglient 1290 DAD二極管陣列檢測(cè)器，對(duì)隱綠原酸、異綠原酸C、新綠原酸、綠原酸進(jìn)行190～400 nm全波長(zhǎng)掃描，最大紫外吸收波長(zhǎng)為325 nm，且分離度均大于1.5，故選擇325 nm為檢測(cè)波長(zhǎng).在這些條件下，4種綠原酸都能被較好地檢測(cè)到，保障測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性.

3.3 一測(cè)多評(píng)法內(nèi)標(biāo)物的確定異綠原酸C、新綠原酸和綠原酸均曾被選為內(nèi)標(biāo)物，然而其他3種化合物的RCF值與其RSD值的結(jié)果表明：只有當(dāng)隱綠原酸作為內(nèi)標(biāo)物時(shí)，其他分析物RCF的RSD值才均小于2%.因此，本實(shí)驗(yàn)選擇隱綠原酸作為內(nèi)標(biāo)物，利用它對(duì)另外3種成分進(jìn)行定量，從而建立黑骨藤中4種綠原酸的一測(cè)多評(píng)法.

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用UPLC-Q-TOF-MS聯(lián)用技術(shù)從黑骨藤提取物中共分離并鑒定出10種化合物，其中，杠柳毒 苷、periplogenin 3-O-β-D-glucopyranosyl-（1→4）-O-β-D-digitoxopyranoside和periplocymarin能誘導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞合成膠原，與傷口愈合有關(guān)［20］.新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸能治療免疫性關(guān)節(jié)炎，其療效可能與抑制炎癥因子有關(guān)［21］.此外，原花青素A1和原花青素A2具有一定的抗過(guò)敏性，可以應(yīng)用于治療炎癥和其他相關(guān)疾病［22］.這種快速、高效的分析方法有利于擴(kuò)展黑骨藤化學(xué)成分類(lèi)別，以期進(jìn)一步研究其藥理活性，為黑骨藤的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及質(zhì)量控制提供新的依據(jù).

本研究還建立一測(cè)多評(píng)法，以隱綠原酸為內(nèi)標(biāo)，同時(shí)測(cè)定異綠原酸C、新綠原酸和綠原酸的含量，并對(duì)其可行性進(jìn)行了探討分析.結(jié)果可看出，一測(cè)多評(píng)法穩(wěn)定有效，能高效準(zhǔn)確地得到其他3種分析物的含量，降低生產(chǎn)測(cè)試成本，實(shí)現(xiàn)了黑骨藤多指標(biāo)成分控制的目的，而且該方法操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，可為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考依據(jù).