小麥NPR1基因家族鑒定及其表達(dá)分析

李雅倩，王林，宋婧含，牛紅莉，朱光，高春保，方正武，劉易科

摘要：【目的】對(duì)小麥NPR1基因家族成員進(jìn)行鑒定及表達(dá)分析，為探究該家族基因的作用機(jī)制及小麥遺傳改良提供理論參考。【方法】以擬南芥NPR1家族蛋白序列為參考序列，從小麥基因組中鑒定出小麥NPR1基因家族成員，利用生物信息學(xué)軟件對(duì)其序列特征進(jìn)行分析，并分別利用RNA-Seq原始數(shù)據(jù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析小麥NPR1家族基因在不同組織及不同脅迫下的表達(dá)水平。通過STRING在線網(wǎng)站構(gòu)建TaNPR1s蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)?！窘Y(jié)果】共鑒定獲得20個(gè)小麥NPR1基因家族成員，其編碼蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)均大于40，為不穩(wěn)定蛋白;平均總親水性值（GRAVY）均為負(fù)值（除TaNPR5-D為正值外），為親水蛋白;主要分布于細(xì)胞核內(nèi)，在葉綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞質(zhì)等部位也有分布;二級(jí)結(jié)構(gòu)均由α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲組成，以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主;對(duì)應(yīng)的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型有10種。20個(gè)TaNPR1s蛋白均可與轉(zhuǎn)錄因子HBP-1b及未知蛋白A、B、C、D發(fā)生相互作用，這5種蛋白均含有bZIP結(jié)構(gòu)域（含TGACG基序）和種子休眠特異基因結(jié)構(gòu)域（DOG1）。TaNPR1s基因在不同組織中的表達(dá)模式不同，可分為在多個(gè)組織中表達(dá)、在特定的組織或發(fā)育階段表達(dá)和在不同組織發(fā)育階段均低表達(dá)或不表達(dá)，共三大類。隨機(jī)挑選的8個(gè)TaNPR1s基因中，有3個(gè)基因在禾谷鐮刀菌脅迫下表達(dá)量降低，但在白粉病菌脅迫下表達(dá)量升高;有2個(gè)基因在這兩種菌脅迫下表達(dá)量均升高，有2個(gè)基因在兩種菌脅迫下表達(dá)量均下降。TaNPR1s基因?qū)?種非生物脅迫處理均有響應(yīng)，但表達(dá)模式存在差異?！窘Y(jié)論】小麥NPR1基因家族成員在不同組織生長(zhǎng)發(fā)育過程和生物和非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用，且基因的可變剪接體也表現(xiàn)出不同組織表達(dá)特性，豐富了NPR1s蛋白功能。TaNPR1s蛋白可能通過與bZIP和DOG1結(jié)構(gòu)域結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)功能。

關(guān)鍵詞： 小麥;NPR1基因家族;鑒定;生物信息學(xué)分析;表達(dá)分析

中圖分類號(hào)： S512.103.53? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）09-2339-11

Genome-wide identification and expression analysis of

wheat NPR1 gene family

LI Ya-qian1，2， WANG Lin1，2， SONG Jing-han1，2， NIU Hong-li1， ZHU Guang2，

GAO Chun-bao1，2， FANG Zheng-wu1*， LIU Yi-ke2*

（1College of Agronomy， Yangtze University/Hubei Collaborative Innovation Center for Grain Industry， Jingzhou， Hubei? 434025， China; 2Food Crops Institute，Hubei Academy of Agricultural Sciences/Wheat Disease Biology

Research Station on Central China，Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Hubei Engineering and

Technology Research Center of Wheat， Wuhan? 430064， China）

Abstract：【Objective】The identification and expression analysis of NPR1 gene family members in wheat provided theoretical reference for exploring the mechanism of this family gene and wheat genetic improvement. 【Method】Wheat NPR1 gene family members from wheat genome were identified? based on NPR1 family protein sequence from arabidopsis. The sequence characteristics were analyzed by bioinformatics software， and the expression levels of wheat NPR1 family genes under different tissues and different stresses were analyzed by RNA-Seq data and real-time fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR）. The online website STRING was used to predict and analyze the interaction relationship between related proteins of TaNPR1 family members. 【Result】A total of 20 members of wheat NPR1 gene family were identified， and the TaNPR1s encoded by them were unstable proteins with instability index greater than 40. The average total hydrophilic va-lue （GRAVY） was negative （except TaNPR5-D was positive）， which was hydrophilic protein. It was mainly distributed in the nucleus， chloroplast， mitochondria， endoplasmic reticulum and cytoplasm. The secondary structure was composed of α-helix， extended strand， β-turn and random coil， and α-helix and random coil were the main components. There were 10 kinds of tertiary structure models. All 20 TaNPR1s proteins could interact with the transcription factor HBP-1b and unknown proteins A， B， C and D， the five proteins all contained bZIP domain（containing TGACG motif） and seed dormancy specific gene domain（DOG1）. The expression pattern of TaNPR1s gene in different tissues was different， which could be divided into three categories：expressed in multiple tissues， expressed in specific tissues or developmental stages， and all low expression or no expression in different tissue development stages. Among the 8 randomly selected TaNPR1s genes， the expression levels of 3 genes decreased under Fusarium graminearum stress， but increased under powdery mildew stress. The expression levels of two genes increased under both strains， and the expression levels of two genes decreased under both strains. TaNPR1s gene responded to all six abiotic stress treatments， but their expression patterns were different. 【Conclusion】Members of wheat NPR1 gene family play an important role in regulating the growth and development of different tissues and the response to biological and abiotic stresses， and the variable spliceosomes of genes also show different tissue expression characteristics， enriching the function of NPR1s protein. TaNPR1s protein may play its bio-logical function by binding to bZIP and DOG1 domains.

Key words： wheat; NPR1 gene family; identification; bioinformatics analysis; expression analysis

Foundation item： Hubei Provincial Special Project of Central Government Guides Local Science and Technology Development（2020ZYYD011）;National Wheat Industry Technology System Construction Project（CARS-03）

0 引言

【研究意義】小麥?zhǔn)鞘澜鐝V泛種植的主要農(nóng)作物之一，也是人類的主要口糧來源，其生長(zhǎng)發(fā)育過程中易遭到各種病原微生物的侵?jǐn)_，從而影響其產(chǎn)量和品質(zhì)（Wang et al.，2018;陳文燁等，2020）。植物在生物體進(jìn)化過程中為了抵抗各種生物和非生物脅迫形成了各種免疫防御機(jī)制（Jones and Dangl，2006;陳文燁等，2020），其中，植物的系統(tǒng)性抗病機(jī)理存在兩種發(fā)生類型：一種是致病菌所誘導(dǎo)的系統(tǒng)獲得性抗性（Systemic acquired resistance，SAR）;另一種為非致病性微生物所誘導(dǎo)的系統(tǒng)誘導(dǎo)性抗性（Induced systemic resistance，ISR）（Kogel and Langen，2005;鄭世仲等，2020）。非表達(dá)病程相關(guān)蛋白（Non-expresser of pathogenesis related genes 1，NPR1）是植物防御信號(hào)中的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子，廣泛參與植物體內(nèi)的免疫防御反應(yīng)（Mhamdi，2019），其在SAR反應(yīng)過程中是水楊酸（Salicylic acid，SA）信號(hào)通路的重要組成部分，也是植物病程相關(guān)蛋白（Pathogenesis-rela-ted proteins，PRs）基因表達(dá)和SAR的激活子（Cao et al.，1997;Zhou et al.，2000;Backer et al.，2019）;其在茉莉酸（Jasmonic acid，JA）介導(dǎo)的ISR反應(yīng)過程中是JA信號(hào)途徑的負(fù)調(diào)控因子（Pieterse et al.，1998;Spoel et al.，2003）。此外，NPR1是植物響應(yīng)病原菌侵染的核心基因，參與調(diào)控植物體內(nèi)SA與JA的平衡（韓永光等，2018）。在植物對(duì)冷環(huán)境適應(yīng)過程中NPR1基因參與調(diào)節(jié)冷誘導(dǎo)基因表達(dá)（Olate et al.，2018）。因此，對(duì)小麥基因組中的NPR1基因家族成員進(jìn)行鑒定及分析，對(duì)探究NPR1基因在小麥抗逆過程中的作用機(jī)制及培育小麥抗性品種具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】NPR1基因首次從擬南芥中被克隆，該基因啟動(dòng)子區(qū)域的W-box元件和WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合進(jìn)而調(diào)控NPR1基因的轉(zhuǎn)錄，其編碼蛋白的C端含有錨蛋白重復(fù)序列（Ank）和NPR1-like C-terminal結(jié)構(gòu)域，N端有一個(gè)BTB/POZ（Broad complex Tramtrack and Bric-a-brac/Pox virus and zinc finger）結(jié)構(gòu)域（Cao et al.，1994;Cao et al.，1997;Aravind and Koonin，1999）。目前擬南芥基因組測(cè)序已完成，共鑒定出6個(gè)AtNPR1s基因（Initiative，2000），其中AtNPR1和AtNPR2是SA受體，在植物免疫中起轉(zhuǎn)錄共激活因子的作用（Castelló et al.，2018）;AtNPR3和AtNPR4也是SA受體，在植物防御中起轉(zhuǎn)錄輔抑制因子的作用（Zhang et al.，2006）;AtNPR5和AtNPR6基因又被稱為AtBOP1和AtBOP2基因，因缺乏NPR1-like C-terminal結(jié)構(gòu)域，在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中分支差異較大，二者主要在擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育過程和形態(tài)建成中發(fā)揮重要作用（Hepworth et al.，2005;Mikael et al.，2005）。目前大量研究證實(shí)，NPR1基因?qū)χ参锏目共⌒灾邪l(fā)揮重要作用，如在蘋果中過量表達(dá)MpNPR1基因能加強(qiáng)植株對(duì)火疫病、黑星病菌及膠銹菌的抗病性（Malnoy et al.，2007）;將擬南芥AtNPR1基因轉(zhuǎn)入草莓中可增強(qiáng)草莓對(duì)炭疽病、白粉病及葉斑病等的抗性（Silva et al.，2015）;水稻中過表達(dá)OsNPR1基因能增強(qiáng)植株對(duì)葉枯病菌的抗性（Yuan et al.，2007）。抑制煙草NPR1基因表達(dá)可導(dǎo)致植株喪失煙草花葉病毒（TMV）抗性（Liu et al.，2002）。保守的條銹菌蛋白可與小麥NPR1蛋白發(fā)生相互作用，并降低病原體對(duì)致病相關(guān)基因（Pathogenesis-related genes，PR）的誘導(dǎo)（Wang et al.，2016）。NPR1基因在受到病原物侵染的條件下，才能激活下游防御基因表達(dá)，在未被誘導(dǎo)物或病原體激活時(shí)，PR基因的表達(dá)并未顯著提高（蔡韡韡等，2019;Tripathi et al.，2019）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，NPR1基因家族已在番木瓜（Peraza-Echeverria et al.，2012）、蘋果（焦鵬，2016）、香蕉（任陪娣等，2019）、小麥（Liu et al.，2019） 和油菜（Wang et al.，2020）等多種植物中鑒定分析。但針對(duì)小麥NPR1基因在生物和非生物脅迫下的表達(dá)模式分析較少且缺乏驗(yàn)證，同時(shí)對(duì)該家族基因的蛋白特性還缺乏系統(tǒng)研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以擬南芥NPR1家族蛋白序列為參考序列，從小麥基因組中鑒定出小麥NPR1基因家族成員，利用生物信息學(xué)軟件對(duì)其序列特征進(jìn)行分析，并分別利用RNA-Seq原始數(shù)據(jù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析小麥NPR1家族基因在不同組織及不同脅迫下的表達(dá)水平;通過STRING在線網(wǎng)站構(gòu)建TaNPR1s蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)，為探究該家族基因的作用機(jī)制及小麥遺傳改良提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試的小麥品種為鄂麥170，由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所提供。RNA提取試劑TRIzol購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（SYBR Premix Ex Taq）購(gòu)自TaKaRa公司。主要設(shè)備儀器：人工氣候箱（PQX智能型，寧波萊?？萍加邢薰荆?、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國(guó)）和CFX Connect Real-Time System（Bio-Rad，美國(guó)）。

1. 2 樣品處理及采集

參考Jiang等（2019）的方法對(duì)小麥種子消毒處理后進(jìn)行無菌培養(yǎng)，生長(zhǎng)出來的小麥幼苗在人工氣候箱中培養(yǎng)至兩葉一心時(shí)期。對(duì)小麥幼苗分別進(jìn)行生物脅迫[禾谷鐮刀菌（PH-1）、白粉病菌（Bgt strain E09）]和非生物脅迫[熱（42 ℃）、冷（4 ℃）、脫落酸（ABA，100 μmol/L）、水楊酸（SA，100 μmol/L）、茉莉酸甲酯（MeJA，100 μmol/L）和氯化鈉（NaCl，150 μmol/L）]處理24 h，對(duì)照組（CK）不作脅迫處理。收集幼苗根和葉部位組織，每3株混作一個(gè)樣，液氮速凍處理后，-80 ℃保存?zhèn)溆?，用于分析不同逆境脅迫下TaNPR1基因的表達(dá)特性。

1. 3 小麥NPR1基因家族成員鑒定

以擬南芥AtNPR1（AT1G64280.1）、AtNPR2（AT4G26120.1）、AtNPR3（AT5G45110.1和AT5G451 10.2）、AtNPR4（AT4G19660.1和AT4G19660.2）、AtNPR5（AT2G41370.1）和AtNPR6（AT3G57130.1）的蛋白序列為查詢序列，在小麥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTp比對(duì)（E值<1×10-10）（Altschul et al.，1997）。將檢索到的序列提交到Pfam（http：//pfam.xfam.org/）（Finn et al.，2006）和InterProScan（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）（Mulder and Apweiler，2007）網(wǎng)站，篩選出同時(shí)含有BTB/POZ和Ankyrin結(jié)構(gòu)域的蛋白，即為小麥NPR1基因家族成員。

1. 4 生物信息學(xué)分析及互作預(yù)測(cè)

小麥NPR1蛋白的理化性質(zhì)通過ExPASy Ser-ver10（https：//prosite.espasyp.org/）（Wilkins et al.，1999）進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用WoLF PSORT：Protein Subcellular Localization Prediction（https：//www.genscript.com/wolf-psort.html）（Horton et al.，2007）在線預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位。利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。使用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive#alignment）（Schwede et al.，2003）對(duì)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。通過功能蛋白關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)在線網(wǎng)站STRING（https：//stringdb.org）（Szklarczyk et al.，2018）預(yù)測(cè)小麥NPR1基因家族成員相關(guān)蛋白的互作關(guān)系，可信度分?jǐn)?shù)為0.70。

1. 5 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

從NCBI的Short Read Archive（SRA）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載關(guān)于不同組織生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的RNA-Seq原始數(shù)據(jù)（SBA編號(hào)：PRJEB25639），以及不同逆境脅迫處理的RNA-Seq原始數(shù)據(jù)（SBA編號(hào)：條銹菌PRJEB12497、禾谷鐮刀菌PRJEB12358、干旱PRJNA306536和高溫─干旱共處理PRJNA257938），并通過HISAT2將其映射到小麥基因組中。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)采用TPM值（Transcripts Per Million）來表示基因的表達(dá)量。TPM值低于1的看作基因不表達(dá)或表達(dá)量很低。利用R語言“pheatmap”包，基于TPM值繪制基因表達(dá)譜，以Log2（TPM+1）值繪制NPR1基因差異表達(dá)熱圖。

1. 6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）表達(dá)分析

利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用SYBR Premix Ex Taq進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系（20.0 μL）：cDNA 2.0 μL，正、反向引物各0.8 μL，50×ROX Reference Dye II 0.4 μL，TB Green Premix Ex Taq II 10.0 μL，滅菌水補(bǔ)足至20.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 3 min;95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s（同時(shí)收集信號(hào)值），共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，溶解曲線分析為65 ℃。β-Actin作為相對(duì)定量的內(nèi)參基因。利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)內(nèi)參基因和小麥NPR1基因家族成員的引物序列，如表1所示。采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算，每個(gè)樣本技術(shù)重復(fù)3次，基因的相對(duì)表達(dá)量用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。對(duì)照的相對(duì)表達(dá)量為1。

2 結(jié)果與分析

2. 1 小麥NPR1基因家族成員鑒定及序列特征分析結(jié)果

以8個(gè)擬南芥NPR1家族蛋白序列為參考序列，在小麥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTp比對(duì)分析，并結(jié)合Pfam和SMART網(wǎng)站去除不具有BTB/POZ和Ank保守結(jié)構(gòu)域的序列，共鑒定獲得20個(gè)小麥NPR1基因家族成員（其中包含3個(gè)可變剪接體：TaNPR3.1-A、TaNPR3.1-B、TaNPR4.1-B），并根據(jù)其與擬南芥NPR1基因家族的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分組及命名（表2）。20個(gè)小麥NPR1家族蛋白（TaNPR1s）的不穩(wěn)定指數(shù)均大于40，為不穩(wěn)定蛋白;平均總親水性值（GRAVY）均為負(fù)值（除TaNPR5-D為正值外），為親水蛋白;主要分布于細(xì)胞核內(nèi)，在葉綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞質(zhì)等部位也有分布。

2. 2 TaNPR1s蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

由表3可知，TaNPR1s蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲4種元件組成，以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，其中TaNPR1-A、TaNPR1-B、TaNPR1-D、TaNPR2-A、TaNPR2-D、TaNPR3-A、TaNPR3-B、TaNPR3-D、TaNPR4-A、TaNPR4-B和TaNPR4-D蛋白以α-螺旋比例最大，TaNPR5-A、TaNPR5-B、TaNPR5-D、TaNPR6-A、TaNPR6-B和TaNPR6-D蛋白中α-螺旋和無規(guī)卷曲所占比例較相近。此外，TaNPR5-A、TaNPR5-B、TaNPR5-D、TaNPR6-A、TaNPR6-B和TaNPR6-D蛋白結(jié)構(gòu)不含NPR1-like C-terminal結(jié)構(gòu)域，與該家族其他蛋白差異較大。

利用SWISS-MODEL構(gòu)建小麥NPR1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，共有10種，如表3所示。TaNPR1-A、TaNPR1-B、TaNPR1-D、TaNPR2-A和TaNPR2-D蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)相似，但三級(jí)結(jié)構(gòu)差異較大，除TaNPR1-B和TaNPR1-D對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)模型相同外，其余蛋白對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)模型均不相同;TaNPR3-A、TaNPR3.1-A、TaNPR4-A、TaNPR4.1-B和TaNPR4-D蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)相似，對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)模型均為5y4d.1。5y4d.1三維結(jié)構(gòu)在I和II組均有分布，其原因可能是與I和II組的遺傳關(guān)系較近（Liu et al.，2019）。第III組內(nèi)除TaNPR6-A和TaNPR6-B蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)差異較大外，其余蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)相似（圖1）。TaNPR3-A和TaNPR3-B蛋白分別與其對(duì)應(yīng)的可變剪接體TaNPR3.1-A和TaNPR3.1-B三級(jí)結(jié)構(gòu)類似，而TaNPR4-B蛋白與其對(duì)應(yīng)的可變剪接體TaNPR4.1-B三級(jí)結(jié)構(gòu)差異相對(duì)較大。

2. 3 TaNPR1s蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為了更好地理解基因功能，使用STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建TaNPR1s蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)（圖2）。所有TaNPR1s蛋白均可與轉(zhuǎn)錄因子HBP-1b及未知蛋白A、B、C、D發(fā)生相互作用。通過Pfam檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，這5種蛋白均含有bZIP結(jié)構(gòu)域（含TGACG基序）和種子休眠特異基因結(jié)構(gòu)域（DOG1）。TaNPR1可能通過與這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用從而發(fā)揮其功能。

2. 4 TaNPR1s基因在不同組織中的表達(dá)分析結(jié)果

從NCBI下載與中國(guó)春小麥籽粒、穗、葉、莖和根5個(gè)組織在生長(zhǎng)發(fā)育過程中的RNA-Seq原始數(shù)據(jù)（SBA編號(hào)：PRJEB25639），對(duì)TaNPR1s基因在小麥生長(zhǎng)發(fā)育過程中表達(dá)水平進(jìn)行分析。在20個(gè)TaNPR1s基因中，大部分基因在小麥生長(zhǎng)發(fā)育過程中均有表達(dá)，TPM值為1.00～31.32（圖3）。按照在不同組織的表達(dá)情況，TaNPR1s基因可分為三大類：第一類在多個(gè)組織中表達(dá)，包括TaNPR3.1-A、TaNPR3-B、TaNPR3-D、TaNPR4-A、TaNPR4-B、TaNPR4-D和TaNPR4.1-B共7個(gè)基因;第二類僅在特定的組織或發(fā)育階段表達(dá)，包括TaNPR1-A、TaNPR1-B、TaNPR1-D、TaNPR2-A、TaNPR2-D、TaNPR5-A、TaNPR5-B、TaNPR5-D、TaNPR6-A、TaNPR6-B和TaNPR6-D共11個(gè)基因;第三類在不同組織發(fā)育階段均低表達(dá)或不表達(dá)，包括TaNPR3-A和TaNPR3.1-B。以第二類中的TaNPR5-B基因?yàn)槔肂AR在線軟件繪制其基因表達(dá)的電子熒光象形圖（圖4），該圖直觀顯示了TaNPR5-B基因在小麥早、中、晚3個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段在不同組織的表達(dá)情況。由上述結(jié)果推測(cè)小麥NPR1基因家族成員在小麥不同組織生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。

2. 5 TaNPR1s基因在不同脅迫條件下的表達(dá)分析結(jié)果

從NCBI下載與生物脅迫（SBA編號(hào)：條銹菌PRJEB12497;禾谷鐮刀菌PRJEB12358）和非生物脅迫（SBA編號(hào)：干旱PRJNA306536;高溫─干旱共處理PRJNA257938）相關(guān)的RNA-Seq原始數(shù)據(jù)，對(duì)TaNPR1s基因在不同逆境脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果圖5所示。TaNPR1s基因在不同逆境脅迫條件下表達(dá)模式不同。TaNPR1-A、TaNPR1-B、TaNPR1-D和TaNPR4.1-B基因在接種條銹菌后1 d時(shí)表達(dá)量上升，而后表達(dá)量下降;TaNPR3.1-A和TaNPR3-D基因在接種后3 d時(shí)表達(dá)量下降，而在5 d時(shí)表達(dá)量上升。禾谷鐮刀菌侵染后，TaNPR1-A、TaNPR1-B、TaNPR1-D、TaNPR5-A、TaNPR5-B和TaNPR6-B基因的表達(dá)量總體上呈上升趨勢(shì)，TaNPR4-B、TaNPR4.1-B和TaNPR5-D基因的表達(dá)量總體呈下降趨勢(shì)。在干旱脅迫處理?xiàng)l件下，TaNPR1-A、TaNPR1-B、TaNPR1-D、TaNPR4.1-B和TaNPR4-D基因表達(dá)量下降。此外，TaNPR1-A、TaNPR1-B、TaNPR1-D、TaNPR4.1-B和TaNPR4-D基因在高溫或高溫—干旱共處理?xiàng)l件下表達(dá)量變化不顯著，而TaNPR1-A、TaNPR1-B和TaNPR1-D基因在干旱處理1 h時(shí)表達(dá)量上升，隨后下降，TaNPR4.1-B、TaNPR4-A和TaNPR4-D基因在干旱處理6 h時(shí)表達(dá)量下降。TaNPR3-B基因在干旱處理?xiàng)l件下表達(dá)量下降，在高溫或高溫—干旱共處理?xiàng)l件下表達(dá)量上升。TaNPR4-B干旱處理?xiàng)l件下表達(dá)量下降，在高溫或高溫—干旱共處理?xiàng)l件下表達(dá)量先上升后下降。綜上所述，TaNPR1s基因參與逆境環(huán)境的響應(yīng)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，且不同NPR1基因在不同脅迫下基因的表達(dá)量變化不同。

隨機(jī)挑選8個(gè)TaNPR1s基因，利用qRT-PCR檢測(cè)其在生物脅迫（禾谷鐮刀菌和白粉病菌）下的表達(dá)情況，結(jié)果如圖6-A和圖6-B所示。與對(duì)照相比，TaNPR2-D、TaNPR3.1-A和TaNPR3-D基因在禾谷鐮刀菌脅迫下的情況下相對(duì)表達(dá)量降低，而在白粉病菌脅迫下相對(duì)表達(dá)量升高;TaNPR3-B和TaNPR3.1-B基因在兩種菌脅迫下相對(duì)表達(dá)量均升高，TaNPR2-A和TaNPR4-A基因在兩種菌的脅迫下相對(duì)表達(dá)量均下降。

利用qRT-PCR檢測(cè)上述隨機(jī)挑選的8個(gè)TaNPR1s基因在非生物脅迫（冷、熱、NaCl、SA、MeJA和ABA）下的表達(dá)情況，結(jié)果如圖6-C～圖6-H所示。TaNPR1s基因?qū)?種非生物脅迫處理均有響應(yīng)，但表達(dá)模式存在明顯差異。與對(duì)照相比，在冷脅迫下，除TaNPR3-B和TaNPR3.1-A基因的相對(duì)表達(dá)量上升外，其余基因相對(duì)表達(dá)量均下降;在熱和SA脅迫下，所有基因的相對(duì)表達(dá)量均下降;在NaCl脅迫下，TaNPR2-A、TaNPR2-D和TaNPR3.1-B基因的相對(duì)表達(dá)量上升，其余基因相對(duì)表達(dá)量下降;在MeJA脅迫下，除TaNPR2-A基因外，其他基因的相對(duì)表達(dá)量下降;在ABA脅迫下，除TaNPR3-A基因外，其余基因的相對(duì)表達(dá)量下降。

3 討論

NPR1是植物SAR及PRs基因表達(dá)的激活子，也參與SA與JA/乙烯信號(hào)途徑的相互作用，是調(diào)節(jié)植物整體抗病性的重要作用因子，參與植物多種抗性代謝通路，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗病性研究中具有重要作用（Cao et al.，1997），因而植物NPR1基因的研究受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注。本研究在Liu等（2019）對(duì)于NPR1基因系統(tǒng)分類分析的基礎(chǔ)上，對(duì)小麥NPR1家族蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、互作網(wǎng)絡(luò)及在不同組織和不同逆境脅迫下的表達(dá)情況進(jìn)行系統(tǒng)分析，初步揭示了小麥NPR1基因家族成員的結(jié)構(gòu)和功能，為該基因家族在小麥遺傳改良中的應(yīng)用提供了理論參考。前人研究發(fā)現(xiàn)，NPR1蛋白的BTB結(jié)構(gòu)域與TGA2的抑制區(qū)結(jié)合會(huì)導(dǎo)致TGA2抑制PRs基因表達(dá)的功能缺失，從而提升植物抗病性，可見，NPR1典型特征結(jié)構(gòu)域?qū)ζ涔δ馨l(fā)揮極為重要（Rochon et al.，2006;Boyle et al.，2009;李微巍，2014）;NPR1蛋白的NPR1-like C-terminal結(jié)構(gòu)域含有核定位信號(hào)，對(duì)定位于細(xì)胞核內(nèi)的NPR1參與轉(zhuǎn)錄共激活發(fā)揮重要作用（Kinkema et al.，2000）。本研究通過構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，所有TaNPR1s蛋白均與轉(zhuǎn)錄因子HBP-1b及未知蛋白A、B、C、D發(fā)生相互作用，經(jīng)Pfam檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這5種蛋白均含有bZIP結(jié)構(gòu)域和DOG1結(jié)構(gòu)域，這兩類結(jié)構(gòu)域均屬于TGA轉(zhuǎn)錄因子。在細(xì)胞核內(nèi)，NPR1蛋白能與TGA亞家族成員（含有TGACG基序，屬于bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族）結(jié)合，這些轉(zhuǎn)錄因子參與SAR反應(yīng)，在SA的誘導(dǎo)下能激活下游防衛(wèi)基因PR1的表達(dá)（Zhang et al.，1999;Fan and Dong，2002）。而DOG1結(jié)構(gòu)域可以通過結(jié)合ABA信號(hào)傳遞的負(fù)調(diào)控因子，增加對(duì)ABA的敏感性從而引起種子休眠，在種子成熟和發(fā)育過程中發(fā)揮作用（宋松泉等，2020）。說明TaNPR1蛋白可能通過與bZIP或DOG1結(jié)構(gòu)域結(jié)合，進(jìn)而在生物和非生物脅迫過程中發(fā)揮功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，部分TaNPR1s基因（TaNPR3.1-A、TaNPR3-B、TaNPR3-D、TaNPR4.1-B和TaNPR4-D）在不同組織中均有較高的相對(duì)表達(dá)量，即使在不同脅迫下，這些基因仍保持較高的相對(duì)表達(dá)量，表明這些基因在小麥不同生長(zhǎng)階段發(fā)揮重要的調(diào)控作用，可能直接或間接參與小麥的生長(zhǎng)發(fā)育過程和形態(tài)建成。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，盡管TaNPR1s基因在不同生物脅迫和非生物脅迫下的相對(duì)表達(dá)量不同，但大多數(shù)TaNPR1s基因的相對(duì)表達(dá)量明顯上調(diào)或下調(diào)，表明這些基因參與逆境環(huán)境的響應(yīng)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Ma and Bohnert，2007），且TaNPR3.1-A、TaNPR3-B和TaNPR4.1-B基因在不同發(fā)育時(shí)期均具有較高的相對(duì)表達(dá)量，但其對(duì)應(yīng)的可變剪接體TaNPR3-A、TaNPR3.1-B和TaNPR4-B基因的相對(duì)表達(dá)量較低?？勺兗羟畜w可使同一個(gè)基因翻譯成不同的蛋白，進(jìn)而表現(xiàn)出不同的功能，可變剪接是基因在轉(zhuǎn)錄過程中普遍存在的現(xiàn)象，是導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能多樣性的重要原因之一（Wang et al.，2015）。小麥的3個(gè)NPR1基因與其對(duì)應(yīng)的可變剪切體在逆境脅迫下表達(dá)情況不同，說明可變剪切增加了小麥NPR1家族的轉(zhuǎn)錄本，豐富了其蛋白的遺傳多樣性。NPR1介導(dǎo)的逆境脅迫下植物信號(hào)通路非常復(fù)雜，今后應(yīng)進(jìn)一步比較TaNPR1s基因可變剪切體之間的差異，并探究其具體作用機(jī)制，對(duì)挖掘NPR1基因在響應(yīng)逆境脅迫中的關(guān)鍵位點(diǎn)具有重大意義。

4 結(jié)論

小麥NPR1基因家族成員在不同組織生長(zhǎng)發(fā)育過程和生物和非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用，且基因的可變剪接體也表現(xiàn)出不同組織表達(dá)特性，豐富了NPR1s蛋白功能。TaNPR1s蛋白可能通過與bZIP和DOG1結(jié)構(gòu)域結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)功能。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）