分光光度法測定發(fā)酵型枸杞酒中的枸杞多糖含量

韓秋珍 羅珮妍 凌育昕 羅小寶 周芳梅

摘 要：建立發(fā)酵型枸杞酒中的枸杞多糖含量的測定方法，為優(yōu)選發(fā)酵型枸杞酒提供依據(jù)。枸杞多糖在80%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液中沉淀，與溶液中單糖和低聚糖分離，與苯酚-硫酸反應(yīng)，用分光光度法于485 nm處測定其含量，其顯色強度與含量成正比，計算發(fā)酵型枸杞酒中的枸杞多糖含量。該方法的線性范圍在0.010 5～0.104 6 mg，具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 1，回收率范圍為92%～106%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為1.9%～3.5%，檢出限為0.8 mg/100 mL，定量限為2.4 mg/100 mL。該方法操作簡單，顯色穩(wěn)定，靈敏度高，重現(xiàn)性好，適合發(fā)酵型枸杞酒中枸杞多糖含量的測定。

關(guān)鍵詞：枸杞多糖;發(fā)酵型枸杞酒;分光光度法

枸杞多糖作為一種天然植物多糖，具有重要的生物活性，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗炎鎮(zhèn)痛、抗疲勞、神經(jīng)保護(hù)及生殖功能保護(hù)等作用[1-3]。枸杞多糖作為發(fā)酵型枸杞酒中的重要功能成分，對其含量進(jìn)行檢測很有必要。目前測定多糖的標(biāo)準(zhǔn)主要采用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，苯酚-硫酸法進(jìn)行樣品前處理，分光光度法進(jìn)行測定，但這些標(biāo)準(zhǔn)方法不適用于測定發(fā)酵型枸杞酒中的枸杞多糖含量[4-6]。由于選擇葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時，需進(jìn)行系數(shù)換算，本方法直接選用葡聚糖作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。本方法主要從苯酚用量、硫酸用量、檢測波長3個方面進(jìn)行實驗比較，得到最佳的檢測方法，為優(yōu)選發(fā)酵型枸杞酒提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 試劑

濃硫酸（比重1.84）;標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：葡聚糖（CAS號9004-54-0）;苯酚溶液（50 g/L）：稱取精制苯酚5.0 g，加水溶解并稀釋至100 mL，混勻;無水乙醇;80%（V/V）乙醇溶液：20 mL水中加入無水乙醇80 mL，混勻。

1.1.2 儀器與設(shè)備

分光光度計、離心機（3 000 r/min）、50 mL離心管等。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

（1）儲備液的配制。準(zhǔn)確稱取相對分子質(zhì)量5×105已干燥恒重的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品0.104 6 g，加水溶解，并定容至100 mL，混勻，置冰箱中保存。此溶液1 mL含有1.046 mg葡聚糖。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。吸取葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液10.00 mL，置于100 mL容量瓶中，加水至刻度，混勻，置冰箱中保存。此溶液1 mL含有葡聚糖0.104 6 mg葡聚糖。準(zhǔn)確吸取此標(biāo)準(zhǔn)使用液0 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL和1.00 mL分別置于25 mL具塞試管中，各加水至2.0 mL，加入苯酚溶液1.0 mL，小心加入濃硫酸10.0 mL，搖勻后放置5 min，置沸水浴中煮沸2 min，冷卻后于485 nm處以試劑空白為參比，1 cm比色皿測定吸光度，以葡聚糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 樣品溶液的制備及測定

（1）沉淀枸杞多糖。移取5.00 mL試樣于50 mL離心管中，加入無水乙醇20 mL，混勻5 min后，以3 000 r/min離心5 min，棄去上清液。殘渣用10 mL 80%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液洗滌，離心后棄去上清液，反復(fù)操作4次。殘渣用水溶解并定容至25.00 mL。

（2）樣品的測定。準(zhǔn)確吸取樣品測定液2.00 mL置于25 mL具塞試管中，加入苯酚溶液1.0 mL，小心加入濃硫酸10.0 mL，搖勻后放置5 min，置沸水浴中煮沸

2 min，冷卻后于485 nm處以試劑空白為參比，1 cm比色皿測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出吸取的待測液中葡聚糖的含量，計算樣品中枸杞多糖含量，同時做樣品空白實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯酚用量的選擇

分別準(zhǔn)確吸取5份葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL于5支25 mL具塞試管中，再在具塞試管中分別加入0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL和1.4 mL的苯酚溶液，各加水至3.0 mL，小心加入濃硫酸10.0 mL，搖勻后放置5 min，置沸水浴中煮沸2 min，冷卻后于485 nm處以試劑空白為參比，1 cm比色皿測定吸光度，選擇較適合苯酚用量。隨著苯酚用量增加吸光值相應(yīng)增加，在1.0 mL時出現(xiàn)最大值，后隨著苯酚繼續(xù)增加吸光值有所下降。因此，最終選擇苯酚用量為1.0 mL。

2.2 硫酸用量的選擇

分別準(zhǔn)確吸取5份葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL于5支25 mL具塞試管中，各加入苯酚溶液1.0 mL，小心加入濃硫酸6.0 mL、8.0 mL、10.0 mL、12.0 mL和14.0 mL，搖勻后放置5 min，置沸水浴中煮沸2 min，冷卻后于485 nm處以試劑空白為參比，1 cm比色皿測定測定吸光度，選擇較適合硫酸用量。隨著硫酸用量增加吸光值相應(yīng)增加，在10.0 mL時出現(xiàn)最大值，后隨著硫酸繼續(xù)增加吸光值有所下降。因此，最終選擇硫酸用量為10.0 mL。

2.3 檢測波長的選擇

取空白對照和樣品溶液，分別經(jīng)苯酚-硫酸試劑顯色后，用分光光度計在400～800 nm波長范圍內(nèi)作全波長掃描則定，兩者均在485 nm處有最大吸收，故選擇485 nm作為測定波長。

2.4 線性范圍及檢出限、定量限

標(biāo)準(zhǔn)使用液按1.2.2進(jìn)行測定，以濃度X為橫坐標(biāo)，吸光度Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表1。

2.5 方法的準(zhǔn)確度和精密度

準(zhǔn)確稱取相對分子質(zhì)量5×105已干燥恒重的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品0.104 6 g，加水溶解并定容至100 mL，混勻，分別取濃度為1.046 mg/L的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL加入預(yù)先加入5.00 mL樣液的50 mL的離心管中，其余按上述樣品的制備及測定操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出吸取的待測液中葡聚糖的質(zhì)量。其中加標(biāo)濃度為5.23 mg/100 mL、10.46 mg/100 mL及20.92 mg/mL的測定用所試樣測定液的體積為1.0 mL，使其濃度處于標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。進(jìn)行3個濃度水平的試驗，每個濃度水平需要獨立檢測6次。結(jié)果見表2。回收率范圍為92%～106%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為1.9%～3.5%。

2.6 實際樣品的測定

用本實驗方法對7個發(fā)酵型枸杞酒樣品進(jìn)行測定分析，每個樣品重復(fù)測定2次。檢測結(jié)果見表3。

3 結(jié)論

本研究采用乙醇溶液除去單糖、低聚糖、甙類及生物堿等干擾性成分。用水溶解乙醇沉淀物中所含的多糖類成分。多糖類成分在硫酸作用下，先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后和苯酚縮合成有色化合物，用分光光度法于485 nm波長處測定其多糖含量。

采用苯酚-硫酸比色法測定發(fā)酵型枸杞酒中枸杞多糖含量的最佳顯色條件為苯酚溶液（50 g/L）用量1.0 mL，硫酸用量10.0 mL，搖勻后放置5 min，置沸水浴中煮沸2 min，冷卻后于485 nm處以試劑空白為參比，1 cm比色皿測定吸光度。通過加樣回收率試驗和精密度試驗，回收率范圍為92%～106%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為1.9%～3.5%。表明采用此方法檢測發(fā)酵型枸杞酒中枸杞多糖含量準(zhǔn)確度高、精密度好、加樣回收率高，本方法適合于發(fā)酵型枸杞酒中枸杞多糖含量的測定。

參考文獻(xiàn)

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