正交設(shè)計(jì)優(yōu)化濁點(diǎn)萃取—光度法測定野生食用菌中的銅

張水花+畢春麗+付延英

摘要：探討了以二乙基氨基二硫代甲酸鈉為絡(luò)合劑，非離子表面活性劑TritonX-100為萃取劑，測定4種食用野生菌中銅含量的濁點(diǎn)萃取-光度法聯(lián)用的新方法。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用L16（45）優(yōu)化萃取條件，詳細(xì)探討溶液的pH值、絡(luò)合劑和非離子表面活性劑的用量、萃取溫度和時(shí)間對濁點(diǎn)萃取效率的影響。在最優(yōu)條件下，銅的線性范圍0.0～0.5 μg/mL，線性回歸方程為D=0.130 6C+0.000 43（r=0.999 1），檢出限為0.48 μg/mL（n=11），相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD<3.4%（n=5），樣品加標(biāo)回收率在99.26%～101.15%。該方法操作簡單、環(huán)保、分析速度快、結(jié)果準(zhǔn)確，將該方法用于4種野生菌中銅含量測定，結(jié)果令人滿意。

關(guān)鍵詞：濁點(diǎn)萃??；野生菌；分光光度法；銅

中圖分類號： TS207.5+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）01-0186-03

云南省野生食用菌資源豐富，產(chǎn)量占全世界食用菌一半以上，占中國食用菌的2/3。食用野生菌常常含有利于人類身體健康的物質(zhì)，在改善人類身體亞健康、防止重大疾病的發(fā)生方面起著重要的作用[1-2]，如蕎面菌的子實(shí)體提取物對小白鼠肉瘤180及艾氏癌的抑制率為90%，奶漿菌有健胃、止咳平喘、祛痰等功效。此外，野生菌還具有味道鮮美的特點(diǎn)，備受人們喜愛。近年來，國內(nèi)外學(xué)者偏重于研究野生菌抗氧化清除自由基延緩衰老、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血脂的作用[3-5]，但野生菌中的微量元素可通過與蛋白質(zhì)和其他有機(jī)基團(tuán)結(jié)合，形成酶、激素、維生素等生物大分子，發(fā)揮著重要的生理生化功能，而到目前為止關(guān)于野生菌中的微量元素研究卻鮮見報(bào)道。因此，野生菌中微量元素的研究不可忽視，該研究不僅可以確定其營養(yǎng)水平，還能為野生菌進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用奠定化學(xué)基礎(chǔ)。食品中銅含量測定的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)方法有原子吸收光譜法和二乙基氨基二硫代甲酸鈉分光光度法。但運(yùn)行成本低、操作簡單的二乙基氨基二硫代甲酸鈉分光光度法在操作中使用了四氯化碳有機(jī)溶劑，對人體的身體健康有害，對環(huán)境也不友好。因此，對食品中銅含量測定新方法的研究不容忽視。濁點(diǎn)萃取法是近年來出現(xiàn)的一種新型環(huán)保的液-液萃取技術(shù)，目前在微量、痕量及復(fù)雜樣品的分類分析中已有研究并取得了滿意的結(jié)果[6-9]，但用于萃取并測定食用野生菌中微量銅的研究尚未見報(bào)道。本研究探討了以二乙基氨基二硫代甲酸鈉為絡(luò)合顯色劑，非離子表面活性劑TritonX-100為萃取劑的濁點(diǎn)萃取-分光光度法測定野生食用蕎面菌、奶漿菌、紅蠟?zāi)?、銅綠菌中微量銅的可行性，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用正交法優(yōu)化萃取測定試驗(yàn)條件，并將最佳條件下測定的結(jié)果與國標(biāo)方法測定的結(jié)果進(jìn)行對比。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

新鮮的奶漿菌、銅綠菌、紅蠟?zāi)?、蕎面菌均購自云南省曲靖市當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場，將塊菌洗凈，低溫干燥再在105 ℃下烘干后粉碎并過40目篩，得到干燥菌粉備用。

硫酸銅，二乙基二硫代氨基甲酸鈉，TritonX-100，鹽酸，氫氧化鈉，硝酸，氨水，氯化銨，以上試劑均為分析純。所有玻璃儀器在使用前均用稀硝酸浸泡，實(shí)驗(yàn)室用水為二次蒸餾水。

UV-1810紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；pHS-3C精密酸度計(jì)（上海虹益儀器儀表有限公司）；HH-306型恒溫水浴鍋（樂清市姚奧特儀表有限公司）；TDL-5-A低速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 濁點(diǎn)萃取測定方法 準(zhǔn)確移取一定量的試樣于 10 mL 的具塞刻度離心管中，分別依次加入4 mL氨-氯化銨緩沖液，1.5 mL 0.4%二乙基二硫代氨基甲酸鈉，2.0 mL 10% TritonX-100，加水稀釋至刻度，恒溫水浴一定時(shí)間后以 4 000 r/min 離心分離，分相后冰水浴5 min移去水相層，用二次蒸餾水稀釋富膠束相定容至3 mL，靜止后用紫外分光光度計(jì)在440 nm處測定其吸光度值。

1.2.2 樣品預(yù)處理 采用GB/T5009.13—2003中的試樣處理方法對樣品進(jìn)行處理，準(zhǔn)確稱取約5 g（精確到0.000 1 g）菌粉樣品于瓷坩堝中，加5 mL硝酸放置0.5 h后小火蒸干，繼續(xù)加熱炭化，移入馬弗爐中，500 ℃灰化1 h，取出冷卻，再加入1 mL硝酸浸濕灰分，小火蒸干，再移入馬弗爐中，500 ℃灰化0.5 h，冷卻后取出用1 ∶1的硝酸溶解灰樣，并轉(zhuǎn)入 100 mL 容量瓶中用二次蒸餾水稀釋至刻度，搖勻備用（同時(shí)做空白試驗(yàn)）。

1.2.3 試驗(yàn)研究方法 考察試驗(yàn)過程中溶液的酸度、萃取平衡時(shí)間、平衡溫度、Triton X-100用量、絡(luò)合劑用量等5個(gè)因素對測定效果的影響，然后在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)L16（45）設(shè)計(jì)方法優(yōu)化測定方法，試驗(yàn)因素及水平見表1，試驗(yàn)方案及數(shù)據(jù)處理見表2，試驗(yàn)數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果見表3。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定波長的選擇

按照試驗(yàn)方法以試劑空白為參比，在360～600 nm波長范圍內(nèi)掃描得到銅絡(luò)合物的吸收光譜（圖1），選擇最大吸收波長為440 nm為測定波長。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 pH值對萃取效果的影響 絡(luò)合劑二乙基氨基二硫代甲酸鈉的穩(wěn)定性與溶液酸度密切相關(guān)，酸性條件下，二乙基氨基二硫代甲酸鈉易分解為二硫化碳，而堿性條件下又容易水解，因此，體系的酸度直接影響著絡(luò)合反應(yīng)的順利進(jìn)行及萃取效率。本試驗(yàn)考察不同pH值對銅萃取率的影響，發(fā)現(xiàn)隨著pH值的增大，萃取效果先增大后減小，溶液酸度pH值為 8.0～9.0時(shí)，對銅的萃取效果最好（圖2）。

2.2.2 平衡時(shí)間和溫度對萃取效果的影響 通常來講，較高的溫度有利于反應(yīng)快速達(dá)到平衡，但過高的溫度又會影響絡(luò)合物的穩(wěn)定性。因此，適宜的平衡溫度對萃取效果、效率影響較大。在保證萃取完全的條件下，選擇較短的平衡時(shí)間可以直接提高分析效率。為此，考察平衡溫度與時(shí)間對體系吸光度的影響（圖3、圖4），由圖3可知，平衡溫度為70～80 ℃，萃取效率最高，由圖4可知平衡15 min萃取效果最好。

2.2.3 TritonX-100用量對萃取效果的影響 非離子表面活性劑TritonX-100的用量不僅決定了銅富膠束相體積的大小，同時(shí)還會影響萃取分相過程。試驗(yàn)考察了TritonX-100用量對萃取效果的影響（圖5），發(fā)現(xiàn)加入量小于2.0 mL時(shí)萃取不完全從而降低萃取效果，加入量大于2.0 mL時(shí)，萃取效果沒有十分明顯的變化。

2.2.4 絡(luò)合劑用量對萃取效果的影響 二乙基二硫代氨基甲酸鈉（DDTC）對銅離子具有較高的生產(chǎn)常數(shù)，且生成物二乙基二硫代氨基甲酸銅具有疏水好的特點(diǎn)，是一種理想的絡(luò)合劑，它除了能與試樣中的銅離子生成絡(luò)合物到膠束相中之外，還起到顯色的作用。用量過少導(dǎo)致絡(luò)合不完全從而使吸光度偏低，用量過多則會造成浪費(fèi)，導(dǎo)致成本過高。本試驗(yàn)考察DDTC用量在0.5～2.5 mL時(shí)對萃取效率的影響（圖6）。由圖6可知，用量為1.5 mL時(shí)萃取效率最好。

2.3 正交試驗(yàn)

由表2、表3的分析結(jié)果可知，溶液的pH值、萃取平衡溫度、 平衡時(shí)間、非離子表面活性劑TritonX-100用量、二乙基二硫代氨基甲酸鈉用量等5個(gè)影響因素中，各因素影響程度順序是溶液的pH值>平衡溫度>二乙基二硫代氨基甲酸鈉用量>非離子表面活性劑TritonX-100用量>平衡時(shí)間。方差分析表明，溶液的pH值與平衡溫度對測定結(jié)果有顯著影響。優(yōu)化工藝條件為：溶液的pH值為8.0，萃取溫度為 70 ℃，萃取時(shí)間為20 min，TritonX-100（體積分?jǐn)?shù)為10%）的用量為 2.0 mL，二乙基氨基二硫代甲酸鈉（0.4%）為 1.5 mL。

2.4 分析特性

在最優(yōu)試驗(yàn)條件下以不同濃度（0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μg/mL）銅標(biāo)準(zhǔn)溶液按照試驗(yàn)方法進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，在0～0.5 μg/mL范圍內(nèi)，吸光度與銅濃度之間存在良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為D=0.130 6C+0.000 43，相關(guān)系數(shù)r=0.999 1，檢出限為0.48 μg/mL（n=11）。

2.5 樣品分析

在最佳試驗(yàn)條件下分別測定蕎面菌、奶漿菌、紅蠟?zāi)?、銅綠菌中的銅，并進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)（表4），由表4可知，樣品加標(biāo)回收率在99.26%～101.15%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于 3.40%。對照國標(biāo)法與本試驗(yàn)方法測定的結(jié)果（表5），可知本試驗(yàn)所用測定方法可靠。

3 結(jié)論

建立二乙基氨基二硫代甲酸鈉為絡(luò)合劑、非離子表面活性劑TritonX-100為萃取劑測定4種食用野生菌中銅含量的濁點(diǎn)萃取-光度法聯(lián)用的新方法。得出最佳試驗(yàn)條件為pH值8.0，萃取溫度70 ℃，萃取時(shí)間20 min，TritonX-100（體積分?jǐn)?shù)為10%）的用量2.0 mL，二乙基氨基二硫代甲酸鈉（0.4%）1.5 mL，在最優(yōu)條件下，銅的線性范圍0～0.5 μg/mL，線性回歸方程為D=0.130 6C+0.000 43（r=0.999 1），檢出限為0.48 μg/mL（n=11），相對標(biāo)準(zhǔn)差RSD<3.4%（n=5），樣品加標(biāo)回收率在99.26%～101.15%。研究結(jié)果表明，該方法與現(xiàn)行國標(biāo)法相比更環(huán)保，操作簡單、分析速度快、結(jié)果準(zhǔn)確。將該方法用于4種野生菌中銅含量測定，結(jié)果令人滿意。本研究的測定結(jié)果可以為4種野生菌進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用奠定化學(xué)基礎(chǔ)。

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