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      豬源丁酸梭菌DSY-1產(chǎn)芽孢高密度發(fā)酵條件優(yōu)化

      2021-09-11 01:29:53杜全能區(qū)毅恒余杰豪劉子恒史寶軍
      江蘇農(nóng)業(yè)科學 2021年16期
      關(guān)鍵詞:正交試驗

      杜全能 區(qū)毅恒 余杰豪 劉子恒 史寶軍

      摘要:為獲取丁酸梭菌芽孢高密度發(fā)酵工藝,以丁酸梭菌DSY-1為試驗材料,以芽孢數(shù)為指標,通過單因素試驗,探究碳源、氮源、接種量、初始pH值、培養(yǎng)溫度和正交試驗,并通過5 L發(fā)酵罐進行中和劑選擇。結(jié)果表明,菌株DSY-1以C6H12O6 30 g/L、酵母提取粉10 g/L、NaCl 5 g/L、乙酸鈉 5 g/L、K2HPO4 3 g/L、MgSO4·7H2O 0.3 g/L、L-半胱氨酸酸鹽 0.5 g/L為發(fā)酵培養(yǎng)基,初始pH值為6.5,培養(yǎng)溫度為35 ℃,接種量為2.5%,5 L發(fā)酵灌發(fā)酵使用12.5%氨水作中和劑時,菌株 DSY-1 芽孢數(shù)最大,達9.3億CFU/mL。

      關(guān)鍵詞:丁酸梭菌;正交試驗;芽孢生物量;發(fā)酵工藝

      中圖分類號:S182 文獻標志碼: A 文章編號:1002-1302(2021)16-0148-05

      隨著我國養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,養(yǎng)殖模式已經(jīng)轉(zhuǎn)向集約化、規(guī)?;l(fā)展。為了減少病害,人們在飼料中添加抗生素,雖起到了促進動物生長的作用,但也造成了抗生素的濫用。我國每年約8 000 t的抗生素被用于動物疾病預(yù)防和治療[1]。在禁抗大背景下,禁抗替抗已成為養(yǎng)殖行業(yè)持續(xù)健康發(fā)展和食品安全的重點話題。近年來,益生菌作為替抗產(chǎn)品,乳酸菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌等已被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)中[2-3]。

      丁酸梭菌(Clostridium butyricum)屬于梭菌科梭菌屬,為革蘭氏陽性厭氧桿菌,具有耐胃酸、耐膽鹽特性。自1933年,日本Miyairy博士首次從糞便中分離出丁酸梭菌便引起了科學家廣泛關(guān)注。目前,丁酸梭菌被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖行業(yè)中。研究發(fā)現(xiàn),在基礎(chǔ)日糧中添加丁酸梭菌能夠增強機體的免疫力、提高抗氧化性能[3-4]、改善肉品質(zhì)[5-6]和腸道組織形態(tài)[7-11]、抑制腸道中有害菌群、提高有益菌群豐度[11-12]。

      目前,制約丁酸梭菌微生態(tài)制劑大規(guī)模生產(chǎn)的主要因素是制備過程中菌體量和芽孢量過低。本試驗采用單因素試驗和正交試驗優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基和5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)優(yōu)化,探究對丁酸梭菌芽孢產(chǎn)量的影響,為丁酸梭菌芽孢的高密度發(fā)酵提供理論依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      1.1.1 供試菌株 丁酸梭菌DSY-1由筆者所在實驗室篩選獲得。

      1.1.2 培養(yǎng)基 種子液:蛋白胨10 g/L、牛肉膏 10 g/L、葡萄糖5 g/L、氯化鈉 5 g/L、可溶性淀粉 1 g/L、乙酸鈉3 g/L、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L。pH值7.0±0.1,121 ℃滅菌20 min。

      LB液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g/L、酵母提取粉 5 g/L、NaCl 10 g/L。固體培養(yǎng)基加20 g/L瓊脂。121 ℃滅菌20 min。

      LB固體培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g/L、酵母提取粉5 g/L、NaCl 10 g/L、20 g/L瓊脂。121 ℃滅菌20 min。

      活化培養(yǎng)基:同種子液,加20 g/L瓊脂。pH值 7.0±0.1,121 ℃滅菌20 min。

      芽孢計數(shù)培養(yǎng)基:下層為TSC培養(yǎng)基+5 g/L瓊脂,上層:18 g/L海藻酸鈉+30 g/L TSC培養(yǎng)基。121 ℃滅菌20 min。

      基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:C6H12O6 30 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、乙酸鈉 5 g/L、K2HPO4 3 g/L、MgSO4·7H2O 0.3 g/L、L-半胱氨酸酸鹽 0.5 g/L,pH值6.4±0.1,115 ℃滅菌20 min。

      1.1.3 試驗藥品 蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、可溶性淀粉、瓊脂(BR),廣東環(huán)凱生物科技有限公司生產(chǎn);K2HPO4、MgSO4·7H2O、C6H12O6、NaCl、乙酸鈉、L-半胱氨酸鹽酸鹽、海藻酸鈉(AR),國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn);TSC培養(yǎng)基,青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

      1.1.4 試驗儀器 雷磁pH計(pH-3C),上海儀電科學儀器股份有限公司生產(chǎn);厭氧袋(C-11),日本三菱公司生產(chǎn);鼓風干燥箱(DHG-9246A),上海精宏實驗設(shè)備有限公司生產(chǎn);恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9052),上海精宏實驗設(shè)備有限公司生產(chǎn);高壓滅菌鍋(YXQ-LS-100S),上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn);顯微鏡(CX-23),日本奧林巴斯;電子天平(ME204E),梅特勒-托利多儀器有限公司生產(chǎn);超凈工作臺(SW-CJ-ID),蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

      1.2 試驗方法

      1.2.1 菌種活化及種子液制備 吸取于-80 ℃甘油管保藏的菌種DSY-1 1 mL,接種于液體種子液中,并置于厭氧培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。

      1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng) 將培養(yǎng)24 h的種子液按3 ∶ 100(體積比)接種于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,置于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

      1.2.3 芽孢計數(shù) 芽孢計數(shù)方法與李雯靜等的方法[13]相同。

      1.2.4 不同因素對菌株DS-1芽孢產(chǎn)量的影響 為了探究菌株DSY-1最佳碳源,選取淀粉、乳糖、蔗糖、麥芽糖來替換基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖,添加量均為1%;在最佳氮源選擇試驗中,選取牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸銨來替換基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源,添加量均為3%;為了研究接種量對菌株 DSY-1 芽孢產(chǎn)量的影響,分別以體積分數(shù)為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3%的接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中;為了探究初始pH值對菌株芽孢產(chǎn)量的影響,利用3 mol/L HCl或3 mol/L NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的pH值至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5;上述試驗接種量均為2.5%,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。在上述試驗的基礎(chǔ)上,探究不同培養(yǎng)溫度對菌株DSY-1生長的影響,將發(fā)酵培養(yǎng)基置于25、30、35、40、45 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以上所有試驗均進行3次重復(fù)。

      1.2.5 正交試驗 在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,采用正交試驗優(yōu)化菌株DSY-1產(chǎn)芽孢最佳條件。本試驗選取初始pH值(A)、培養(yǎng)溫度(B)、接種量(C)3個對菌株產(chǎn)芽孢影響較大的因素,對其進行3因素3水平試驗,以確定上述3因素對菌株DSY-1產(chǎn)芽孢最佳組合,其正交試驗設(shè)計見表1。

      1.2.6 5 L發(fā)酵罐發(fā)酵試驗 在“1.2.5”節(jié)試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上配制培養(yǎng)基,裝液量70%,接種量3%,轉(zhuǎn)速50 r/min,培養(yǎng)溫度為35 ℃,培養(yǎng)時間為48 h。發(fā)酵過程不控制pH值自然發(fā)酵;發(fā)酵過程中前 24 h,用12.5%氨水將pH值維持在6.5±0.2。

      1.2.7 不同中和劑對菌株DSY-1芽孢產(chǎn)量的影響 在上述單因素試驗和正交試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,以12.5%、25.0%、50.0%氨水,3 mol/L NaOH、3 mol/L Ca(OH)2、3 mol/L KOH調(diào)節(jié)pH值。

      1.2.8 數(shù)據(jù)分析 使用Excel統(tǒng)計數(shù)據(jù),采用統(tǒng)計軟件SPSS 25中的One-Way ANOVA進行單因素方差分析,用Turkey多重比較法對處理間的差異性進行比較分析,結(jié)果以“平均值±標準差”表示,P<0.05為差異顯著。采用GraphPad Prism 8.0.1作圖。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 菌株DSY-1菌落形態(tài)與菌體形態(tài)

      菌株DSY-1在計數(shù)平板上的菌落形態(tài)見圖1,菌落表面光滑、不透明,呈黑色。菌體形態(tài)見圖2,為革蘭氏陽性菌,有芽孢產(chǎn)生,菌體成桿狀。

      2.2 不同碳源對菌株DSY-1產(chǎn)芽孢的影響

      碳源作為細胞合成的骨架和能量來源,在細胞生長過程中起著重要的作用。從圖3中可以看出,麥芽糖和乳糖對菌株產(chǎn)芽孢不存在顯著性差異(P>0.05),其余碳源對菌株DSY-1產(chǎn)芽孢存在顯著性差異(P<0.05)。其中,淀粉、乳糖、蔗糖和麥芽糖4種碳源屬于多糖和雙糖,菌株 DSY-1 對其利用均低于葡萄糖。在以葡萄糖為唯一碳源時,菌株 DSY-1 芽孢產(chǎn)量最大,可達(2.40±0.10)億CFU/mL,因此采用葡萄糖作為唯一碳源進行后續(xù)試驗。

      2.3 不同氮源對菌株DSY-1芽孢產(chǎn)量的影響

      氮是構(gòu)成微生物細胞的蛋白質(zhì)及核酸的主要物質(zhì)。從圖4可以看出,5種氮源對菌株DSY-1芽孢產(chǎn)量存在顯著影響(P<0.05)。5種氮源中芽孢產(chǎn)量從大到小表現(xiàn)為酵母提取粉>蛋白胨>牛肉膏>尿素>硫酸銨,可能是由于丁酸梭菌生長需要的營養(yǎng)比較復(fù)雜,而無機氮無法提供。酵母提取粉為唯一氮源時,菌株芽孢數(shù)最大,達(3.47±0.25)億CFU/mL。

      2.4 接種量對菌株DSY-1芽孢產(chǎn)量的影響

      接種量可以影響菌體增殖的速度,適當?shù)慕臃N量能夠縮短菌體的延滯期。從圖5可以看出,隨著接種量的增加,菌株DSY-1芽孢產(chǎn)量呈先上升后下降的趨勢,在接種量為3%時,芽孢產(chǎn)量達到最大。接種量低,引起菌株延滯期過長;而當接種量超過3%時,或許由于菌體生長過快,培養(yǎng)基中pH值下降,造成酸脅迫效應(yīng);在接種量為3%時,菌株DSY-1獲得的芽孢最多,為(4.47±0.04)億CFU/mL。

      2.5 不同初始pH值對菌株DSY-1芽孢產(chǎn)量的影響

      由圖6可知,在初始pH值5.5~7.5之間,菌株芽孢產(chǎn)量存在顯著差異(P<0.05);而在初始pH值6.0~6.5之間,菌株DSY-1芽孢產(chǎn)量不存在顯著差異(P>0.05)??梢姡闐SY-1適合在弱酸性條件下生長,且菌株DSY-1在初始pH值6.5時具有最大芽孢產(chǎn)量,為(4.47±0.18)億CFU/mL。

      2.6 不同培養(yǎng)溫度對菌株DSY-1芽孢產(chǎn)量的影響

      培養(yǎng)溫度對菌株DSY-1芽孢產(chǎn)量存在顯著性影響(P<0.05),從圖7可以看出,隨著培養(yǎng)溫度升高 菌株芽孢產(chǎn)量呈先上升后下降的趨勢。培養(yǎng)溫度過低或過高可能影響菌株DSY-1代謝活動,進而影響菌體的生長;在溫度為35 ℃時,菌株芽孢產(chǎn)量達到最大,為(5.82±0.10)億CFU/mL。

      2.7 正交試驗結(jié)果

      從表2可以看出,以芽孢產(chǎn)量為指標,通過正交試驗發(fā)現(xiàn),影響菌株DSY-1芽孢產(chǎn)量因素表現(xiàn)為培養(yǎng)溫度>初始pH值>接種量,最優(yōu)組合為A2B2C3,即發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為6.5,培養(yǎng)溫度為35 ℃,接種量為2.5%時,菌株DSY-1具有最大芽孢產(chǎn)量。

      2.8 自然發(fā)酵與控pH值發(fā)酵

      從表3可以看出,用50%氨水控制pH值6.5發(fā)酵芽孢數(shù)是自然發(fā)酵的1.7倍,可見酸脅迫嚴重抑制菌株DSY-1的生長,而通過控制發(fā)酵pH值可大幅度提高芽孢產(chǎn)量。

      2.9 不同中和劑對菌株DSY-1芽孢產(chǎn)量的影響

      從圖8可以看出,不同中和劑對菌株DSY-1產(chǎn)芽孢存在顯著性影響(P<0 .05)。以12.5%氨水為中和劑時,菌株DSY-1具有最大的芽孢產(chǎn)量。而當氨水為25%和50%時,芽孢產(chǎn)量均低于12.5%氨水,可能是由于氨濃度過高不能及時中和,導致發(fā)酵液中游離氨濃度升高,進而抑制菌體生長。當以NaOH和Ca(OH)2、KOH作為中和劑時,效果均低于氨水。可能是由于鹽離子影響細胞內(nèi)外滲透壓,不利于菌體的生長。因此,選用12.5%氨水作為中和劑進行控pH值。

      3 討論與結(jié)論

      本次碳源試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),以葡萄糖作為唯一碳源時,菌株DSY-1具有最佳芽孢產(chǎn)量,這與徐瑩等研究結(jié)果[14-16]一致。也有研究者發(fā)現(xiàn),可溶性淀粉[17]、麥芽糖[18]作為唯一碳源時,丁酸梭菌具有最大的芽孢產(chǎn)量。李雯靜等認為,面粉和米粉作為混合碳源時,可獲得最大的芽孢產(chǎn)量。可見,不同菌株對于碳源的利用情況有所差異[13]。

      菌株DSY-1在以酵母提取粉為唯一氮源時,具有最大的芽孢產(chǎn)量,這與邢宏觀等的研究結(jié)果[17]一致。而徐瑩等認為,以胰蛋白胨為唯一氮源時具有最大的芽孢產(chǎn)量[14]。而菌株HDRyYB1[13]以魚粉、酵母粉作為混合氮源時,具有最大的芽孢產(chǎn)量。史禎暉研究發(fā)現(xiàn),菌株SHYY088以酵母自溶粉和酵母浸膏作為混合氮源時,具有最大的芽孢產(chǎn)量[18]。接種量過高或過低均影響菌株的生長,接種量過大使得代謝產(chǎn)物積累過快,造成酸脅迫;而過小則引起延滯期過長,本試驗結(jié)果與胡曉龍等結(jié)論[19]相似。

      初始pH值和培養(yǎng)溫度是制約丁酸梭菌高密度生長的重要因素,過低或過高的初始pH值會改變細胞膜的通透性,進而影響菌體的生長和代謝;而培養(yǎng)溫度則影響生物體重酶的活性,從而造成菌體代謝緩慢。有研究認為,初始pH值在7.2~7.4[13]、7.3[16]時,菌株具有最大的芽孢產(chǎn)量。趙旭冬研究發(fā)現(xiàn),通過補堿使pH值維持在6.8,所得芽孢數(shù)高于自然發(fā)酵[15]。史禎暉認為,pH值6.5更適合菌株生長[18]。而Li等發(fā)現(xiàn),在初始pH值 6.0~7.5對丁酸梭菌NN-2活菌數(shù)和產(chǎn)芽孢數(shù)均無顯著性影響(P>0.05)[20]。本試驗結(jié)果與趙旭冬研究結(jié)論[15]相一致,在pH值為6.8時能夠獲得最多芽孢。本試驗發(fā)現(xiàn),菌株DSY-1在35 ℃下,產(chǎn)芽孢量達到最大。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),丁酸梭菌在 32 ℃[18]、37 ℃[16]具有最大芽孢產(chǎn)量。

      在發(fā)酵過程中調(diào)控pH值有利于緩解酸脅迫,利于菌體的生長。眾多研究發(fā)現(xiàn),在發(fā)酵過程中通過調(diào)控pH值有利于菌體的生長[14-15,21],這與本試驗結(jié)果相一致。

      通過單因素試驗和正交試驗確定碳源、氮源、培養(yǎng)條件對丁酸梭菌DSY-1產(chǎn)芽孢的影響。在以葡萄糖和酵母提取粉分別作為唯一碳源和氮源,培養(yǎng)溫度為35 ℃、初始pH值為6.5,接種量為2.5%時,菌株DSY-1具有最大的芽孢產(chǎn)量。在5 L發(fā)酵試驗中,通過使用12.5%氨水在發(fā)酵前 24 h使pH值維持在6.5,使得芽孢數(shù)是自然發(fā)酵的1.7倍,最終芽孢產(chǎn)量為(9.30±0.09)億CFU/mL。

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