葉氏消渴方降血糖最佳配伍及劑量的正交試驗(yàn)分析

霍宇+梁天堅(jiān)+龔志強(qiáng)

[摘要] 目的 以正交試驗(yàn)分析葉氏消渴方降糖最佳配伍及藥量規(guī)律，探討其對(duì)糖尿病大鼠糖脂代謝紊亂的調(diào)節(jié)作用。 方法 采用高脂飼料喂養(yǎng)結(jié)合低劑量鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射復(fù)制大鼠糖尿病模型，按L18（37）正交表分為18組不同配伍給藥組，另設(shè)模型組、二甲雙胍組及空白組，共21組，每組12只。每組分別給予受試藥物治療14 d，以血糖（FBG）、血清胰島素（Ins）、胰高血糖素（GC）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL-c）、低密度脂蛋白（LDL-c）有關(guān)聯(lián)的多項(xiàng)指標(biāo)計(jì)算綜合評(píng)分，對(duì)綜合評(píng)分進(jìn)行極差與方差分析；驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，另將72只SD大鼠分為最佳組方高、中、低劑量組，模型組，二甲雙胍組和空白組6個(gè)組，以同樣的方法造模并檢測(cè)指標(biāo)。 結(jié)果 根據(jù)綜合評(píng)分，葉氏消渴方最佳組方配伍主次關(guān)系為：生地>知母>石膏>麥冬>白芍>甘草；最佳藥量為生地30 g、知母9 g、石膏30 g、麥冬6 g、白芍9 g、甘草6 g，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該方對(duì)各指標(biāo)均表現(xiàn)出明顯改善作用，除HDL-c外，其余指標(biāo)與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 葉氏消渴方在配伍藥量為生地30 g、知母9 g、石膏30 g、麥冬6 g、白芍9 g、甘草6 g時(shí)，降糖效果最佳；其可能的降糖機(jī)制為改善大鼠體內(nèi)糖代謝、修復(fù)胰島β細(xì)胞、促進(jìn)胰島素分泌和調(diào)節(jié)血脂改善胰島素抵抗。

[關(guān)鍵詞] 葉氏消渴方；正交試驗(yàn)；降血糖；最佳組方

[中圖分類號(hào)] R914 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）10（c）-0023-06

[Abstract] Objective To investigate the optimal ingredient composition and the dosage of Yeshixiaokefang for the hypoglycemic effect in type 2 diabetic rats. Methods Rat models of type 2 diabetes were made by intraperitoneal injecting low-dose streptozotocin accompanied by feeding high-lipid and high-sugar diet. Based on orthogonal design， rat wererandomly divided into 21 groups （including 18 treatment groups， blank group， melbine group and model group）， 12 in each group according to L18（37） table. Then the rats were givent Yeshixiaokefang for 14 days， and fasting blood glucose （FBG）， Glucagon （GC）， insulin （Ins）， triglyceride （TG）， total cholesterol （TC）， high-density lipoprotein cholesterol （HDL-c） and low-density lipoprotein cholesterol （LDL-c） were as indicators. Synthesis score of multiple indicators was calculated and the multiple indicators were analyzed by using orthogonal design and variance analysis. In verification test， 72 mice were divided into 6 groups： blank group， melbine group， model group， high dose group， middle dose group and low dose group with 12 in each. Duplicating model and indexes test were followed former methods. Results Based on synthetic sores， the optimum of Yeshixiaokefang was as follows： 30 g Radix Rehmanniae； 9 g Anemarrhenaasphodeloides； 30 g Gypsum Fibrosum； 6 g Ophiopogonjaponicus； 9 g white peony root； and 6 g Glycyrrhiza. The sequence of priority was like： Radix Rehmanniae>Anemarrhenaasphodeloides>Gypsum Fibrosum>Ophiopogonjaponicus>white peony root>Glycyrrhiza. The verification test showed the significant difference （P < 0.01） in carbohydrate and lipid metabolism，the number of FBG in blood， Glucagon （GC）， insulin （Ins）， triglyceride （TG）， total cholesterol （TC） and low-density lipoprotein cholesterol （LDL-c） compared with model group. Conclusion The effect of Yeshixiaokefang on hypoglycemicis optimal when the dosage of 30 g Gypsum Fibrosum； 9 g Armeniacae Common Anemarrhena； and 30 g Radix Rehmanniae； 6 g Ophiopogonjaponicus； 9 g white peony root； and 6 g Glycyrrhiza. Its hypoglycemicmechanism of which probably lies in the modification of carbohydrate metabolism； accelerating the repair of pancreatic islet β cells； increasing secretion and decreasing decomposition of insulin； regulating lipids metabolism to improve insulin resistance.

[Key words] Yeshixiaokefang； Orthogonal test； Hypoglycemic； Optimal ingredient composition

葉氏消渴方為《臨證指南醫(yī)案》卷六“三消”中治中上焦消渴病的第一方[1]，方中諸藥在現(xiàn)代臨床治療糖尿病亦取得良好療效[2-7]，但在運(yùn)用科學(xué)試驗(yàn)方法來(lái)進(jìn)行配伍及劑量探討的研究尚無(wú)。為了更好地驗(yàn)證葉氏消渴方的降血糖療效，筆者擬采用正交試驗(yàn)結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)差系數(shù)權(quán)重法，計(jì)算多項(xiàng)指標(biāo)的綜合評(píng)分并進(jìn)行極差與方差分析，從中篩選出其最優(yōu)藥量配伍并驗(yàn)證其療效，同時(shí)探討該方干預(yù)糖尿病大鼠模型的最佳配伍規(guī)律及劑量的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)5周齡雄性SD大鼠，2批分別為252只和72只，體重160～200 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（桂）2014-0002。

1.1.2 藥材 方中所需石膏、知母、生地、麥冬、白芍、甘草，均購(gòu)自廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院苑敏教授鑒定，經(jīng)鑒定分別為鹽酸鹽類礦物硬石膏族石膏（Gypsum Fibrosum）、百合科植物知母（Anemarrhena asphodeloides Bge.）的干燥根莖、百合科植物麥冬[ Ophiopogon japonicus （Linn. f.） Ker-Gawl.]的干燥塊根、玄參科植物地黃（Rehmannia glutinosa Libosch.）的干燥塊根、毛茛科植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥根、豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的干燥根，藥材性狀均符合2010年版《中國(guó)藥典》一部規(guī)定[8]。

1.1.3 試劑 鏈脲佐菌素（Sigma S0130，批號(hào)18883-66-4）；膽固醇（鄭州利偉生物實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)130612）；丙硫氧嘧啶片（南通精華制藥有限公司，批號(hào)131202）；血糖檢測(cè)試劑盒（四川省邁克科技有限責(zé)任公司，批號(hào)0507031）；胰島素（Ins）放射免疫分析試劑盒（天津協(xié)和醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào) 130508）；胰高血糖素（GC）放射免疫分析試劑盒（天津協(xié)和醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)130508）；三酰甘油檢測(cè)試劑盒（四川省邁克科技有限責(zé)任公司，批號(hào)1307021）；總膽固醇檢測(cè)試劑盒（四川省邁克科技有限責(zé)任公司，批號(hào)1307031）；高密度脂蛋白膽固醇檢測(cè)試劑盒（長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司，批號(hào)2013015）；低密度脂蛋白膽固醇檢測(cè)試劑盒（長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司，批號(hào)2013007）；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 儀器 TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；SN-695B型智能放免γ測(cè)量?jī)x（上海原子核研究所日環(huán)儀器一廠）；TLXJ-IIB配套放免專用冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 正交試驗(yàn) 設(shè)計(jì)結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)研究文獻(xiàn)，同時(shí)查閱2010版《中國(guó)藥典》一部，得葉氏消渴方各味藥材成人常用量[8-10]：石膏15～60 g、知母6～12 g、生地12～30 g、麥冬6～12 g、白芍6～15 g、甘草2～10 g。本研究以此劑量為基礎(chǔ)，擬定3個(gè)劑量水平，同時(shí)將葉氏消渴方6味藥：石膏（A），知母（B），生地（C），麥冬（D），白芍（E），甘草（F）作為考察因素，選用正交試驗(yàn)表L18（37）安排試驗(yàn)。各因素水平見(jiàn)表1。

1.2.2 高脂飼料的配制 配方：豬油5%，膽固醇1%，丙硫氧嘧啶0.1%，基礎(chǔ)飼料93.9%。

1.2.3 鏈脲佐菌素致糖尿病模型的復(fù)制及分組[11-14] 取健康雄性SD大鼠252只，適應(yīng)性普通飼料喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)抽取12只為空白組動(dòng)物，繼續(xù)以普通飼料喂養(yǎng)。其余動(dòng)物給予高脂飼料喂養(yǎng)3周，第22天禁食不禁水24 h，次日上午以35 mg/kg鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射。72 h后，測(cè)FBG，以FBG≥11.1 mmol/L，并伴有多食、多尿、多飲為成模型大鼠；模型組大鼠穩(wěn)定1周后再次測(cè)定FBG，2次血糖均合格者納入實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 分組和給藥 采用L18（37）正交表將造模成功大鼠根據(jù)血糖和體重按隨機(jī)區(qū)組法分為18組，加上模型組、二甲雙胍組和空白組共21組，每組12只。給藥期間，空白組給予普通飼料及生理鹽水，其余各組給予高脂飼料及相應(yīng)配伍劑量，連續(xù)灌胃給藥14 d。選擇正交試驗(yàn)中的最佳配伍組進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，雄性SD大鼠72只，隨機(jī)分為最佳配伍高、中、低劑量組，模型組，二甲雙胍組和空白組6個(gè)組，每組12只，造模和給藥方法同上。

1.2.5 給藥劑量 造模同日給藥，按成人日服復(fù)方生藥量60 g（成人按60 kg體重）計(jì)算，根據(jù)體表面積換算大鼠的等效劑量為成人的6.3倍。灌胃藥物濃度為1 mL溶液含復(fù)方生藥量1 g，各組給藥劑量均相當(dāng)于復(fù)方生藥量6.3 g/kg；二甲雙胍組給予二甲雙胍藥物200 mg/kg；模型、空白組給予等容積生理鹽水，連續(xù)灌胃給藥14 d；驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，最佳配伍高、中、低劑量組劑量分別為18.6、6.3、3.15 g/kg。

1.2.6 檢測(cè)指標(biāo) 末次給藥后以水合氯醛腹腔注射麻醉，從大鼠股靜脈取血，于室溫放置6 h，3500 r/min離心15 min，取血清分別測(cè)定血糖（FBG）、血清胰島素（Ins）、胰高血糖素（GC）、血清三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL-c）、低密度脂蛋白（LDL-c），采用多指標(biāo)綜合評(píng)分法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 綜合指標(biāo)的計(jì)算及評(píng)分 由于在多指標(biāo)試驗(yàn)中， 有的指標(biāo)要求越小越好， 有的指標(biāo)要求越大越好，還有的指標(biāo)則要求穩(wěn)定在某一理想值。另外還存在數(shù)量級(jí)和量綱不同的問(wèn)題，為了統(tǒng)一各指標(biāo)的趨勢(shì)要求，消除各指標(biāo)間的不可公度性[15-18]。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)綜合指標(biāo)（overall desirability，OD），將各個(gè)指標(biāo)統(tǒng)一綜合考察，以綜合指標(biāo)進(jìn)行直觀分析和方差分析。在計(jì)算綜合指標(biāo)之前，需先將各指標(biāo)進(jìn)行規(guī)格化，具體方法如下：

1.3.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在正交試驗(yàn)中對(duì)綜合指標(biāo)評(píng)分進(jìn)行極差分析和方差分析；驗(yàn)證試驗(yàn)中，組間比較采用t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)各項(xiàng)糖脂代謝指標(biāo)結(jié)果， 對(duì)各組療效通過(guò)公式計(jì)算進(jìn)行綜合評(píng)分，見(jiàn)表2～3。綜合評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)的極差大小顯示各因素作用主次為C（生地）>B（知母）>A（石膏）>D（麥冬）>E（白芍）>F（甘草），見(jiàn)表3；方差分析結(jié)果表明，因素C（生地）、B（知母）對(duì)療效的影響比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），因素A（石膏）對(duì)療效的影響比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），見(jiàn)表4。綜合直觀分析與方差分析的結(jié)果確定葉氏消渴方最佳配伍藥量為C3B2A3D3E2F1，即生地30 g、知母9 g、石膏30 g、麥冬6 g、白芍9 g、甘草6 g。

2.2 最佳組方配伍驗(yàn)證

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，模型組與空白組相比，各項(xiàng)指標(biāo)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；葉氏消渴方最佳配伍各劑量組均能顯著降低模型大鼠FBG（P < 0.05）；與模型組相比，高、中劑量組的Ins顯著升高（P < 0.05），中劑量組GC顯著降低（P < 0.05）；高、中劑量組TG顯著降低（P < 0.05）；各劑量組均能顯著降低TC、LDL-c（P < 0.05）。結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

葉氏消渴方為《臨證指南醫(yī)案》治療消渴病的首方，原文“計(jì)，四十，能食善饑，渴飲，日加癟瘦。心境愁郁，內(nèi)火自燃。乃消證大病。生地、知母、石膏、麥冬、生甘草、生白芍?！狈街幸愿屎|(zhì)潤(rùn)，具有清熱涼血，養(yǎng)陰生津的生地替代原方熟地，并作為君藥，配合知母、石膏滋陰瀉火為臣藥，以麥冬、生甘草補(bǔ)液、清熱解毒為輔佐，使藥生白芍能斂陰、引散血中郁熱。從該方巧妙的藥物配伍分析，應(yīng)是《景岳全書(shū)》“玉女煎”的化裁活用[19]，是葉天士“范于法而不囿于法”的典型方劑，葉氏善于從營(yíng)血的角度辨治中上焦消渴病，在陽(yáng)明熱盛，耗液傷津的病機(jī)中重視郁火傷陰，體現(xiàn)了其學(xué)術(shù)過(guò)人之處?，F(xiàn)代中藥藥理也驗(yàn)證了該方大多數(shù)藥物具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)降血糖的作用[20-26]。

在正交試驗(yàn)中以不同的指標(biāo)測(cè)定結(jié)果作為考察指標(biāo)，雖然結(jié)果更為科學(xué)客觀，但優(yōu)選出的組方配伍有時(shí)并不一致[15]。中藥作用有“多靶點(diǎn)、多方位”的原則，其往往是通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體的多個(gè)方面而達(dá)到治療效果。針對(duì)這一點(diǎn)，本研究運(yùn)用多指標(biāo)評(píng)價(jià)法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了綜合分析[17-18]，對(duì)各指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行必要的規(guī)格化處理。我們通過(guò)直觀分析與方差分析的結(jié)果確定，葉氏消渴方最佳組方配伍為生地30 g、知母9 g、石膏30 g、麥冬6 g、白芍9 g、甘草6 g。綜合評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)的極差大小顯示各因素作用主次為生地>知母>石膏>麥冬>白芍>甘草，這為葉氏消渴方生地為君，知母為臣，石膏、白芍、麥冬及甘草為佐使的組方原則提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

在驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，從 FBG的測(cè)定結(jié)果來(lái)看，葉氏消渴方最佳配伍組亦能顯著降低 FBG，證明該方對(duì)糖尿病大鼠的糖代謝有一定的調(diào)節(jié)作用，能有效降低血糖；從Ins、GC的測(cè)定結(jié)果來(lái)看，與模型組相比，葉氏消渴方最佳配伍組的血清Ins水平明顯升高，GC明顯降低，提示其降糖機(jī)制可能與修復(fù)胰島β細(xì)胞，刺激胰島素分泌的功能和減低胰高血糖素的作用有關(guān)；TG、TC、HDL-c、LDL-c的測(cè)定結(jié)果顯示，葉氏消渴方最佳配伍組可明顯降低糖尿病大鼠體內(nèi)TG、TC、LDL-c水平，提示葉氏消渴方可能通過(guò)降低血脂水平改善胰島素抵抗。

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（收稿日期：2016-07-10 本文編輯：趙魯楓）