益生菌改善高脂高糖飼養(yǎng)誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂代謝紊亂

黃 婷，李真真，白 楊，劉惠雙

(鄭州市第七人民醫(yī)院 1.內(nèi)分泌科； 2.營養(yǎng)科，河南 鄭州 450016)

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，人們生活習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)的改變，全世界范圍內(nèi)，尤其是兒童青少年人群中肥胖發(fā)生率逐年上升[1]。肥胖(obesity)是由多種因素相互作用導(dǎo)致能量和代謝紊亂，為引起糖尿病、冠心病等多種疾病的重要危險因素，已成為威脅人類健康的公共衛(wèi)生問題[2]。腸道微生物群是人體最大的微生態(tài)系統(tǒng)，與肥胖、遺傳、胰島功能障礙等密切相關(guān)，其中嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜熱鏈球菌、雙歧桿菌是常見的腸道益生菌(probiotics)，可通過調(diào)節(jié)腸道微生物群緩解高脂高糖飲食引起的肥胖，是近年來治療因肥胖引起的脂代謝紊亂的潛在方案[3]。而AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)介導(dǎo)的自噬途徑參與肥胖引起的脂代謝紊亂，激活該通路可通過促進(jìn)自噬，減輕肝臟脂肪積累[4]，Ⅲ型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域5可通過上調(diào)AMPK/mTOR介導(dǎo)的小鼠肝細(xì)胞自噬和脂肪酸氧化，減少脂肪生成，減輕肝高脂血癥[5]。但益生菌是否通過調(diào)控AMPK/mTOR通路介導(dǎo)的自噬改善肥胖小鼠脂代謝紊亂，目前尚未有研究。本研究通過構(gòu)建高脂高糖誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型，并使用益生菌和AMPK抑制劑Dorsomorphin進(jìn)行干預(yù)，旨在從AMPK/mTOR通路揭示益生菌對肥胖小鼠脂代謝紊亂的改善作用，為益生菌對肥胖引起脂代謝紊亂的治療提供理論參考。

the black arrow indicated autophagosome圖1 各組小鼠肝臟組織病理學(xué)、脂肪蓄積及自噬小體比較Fig 1 Liver histopathology, fat accumulation and autophagy bodies of mice in each group

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：清潔級C57BL/6J小鼠(50只，3～4周齡，雄性，體質(zhì)量13～15 g)[大連醫(yī)科大學(xué)，許可證號：SCXK(遼)2018-0003]。按照3R原則給予實驗動物人道的關(guān)懷照顧。

1.1.2 益生菌及藥物：本研究所用益生菌種(嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜熱鏈球菌、雙歧桿菌)(大連醫(yī)科大學(xué)微生物教研室)；Dorsomorphin(又名compound C，是一種選擇性，ATP競爭性AMPK抑制劑)(MedChemExpres公司)。

1.1.3 主要試劑：普通飼料和高脂高糖飼料(北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司)；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)和β-actin鼠抗(Sigma-Aldrich公司)；蛋白提取試劑盒、ECL顯色試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒(北京中杉金橋生物科技有限公司)；4%多聚甲醛和2.5%戊二醛溶液(武漢塞維爾生物科技有限公司)；油紅O染液(北京索萊寶生物科技有限公司)；醋酸鈾、枸櫞酸鉛、蘇木精、伊紅染液(上海生工生物科技有限公司)；SREBP-1c、LC3、Beclin1、AMPK、mTOR、p-AMPK、p-mTOR鼠抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分組及處理：小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將小鼠隨機分為對照組，模型組、益生菌組(益生菌培養(yǎng)至對數(shù)期后，進(jìn)行菌落計數(shù)，每種菌各以2×109CFU的菌液進(jìn)行灌胃)、抑制劑組(AMPK抑制劑Dorsomorphin[6]，靜脈注射1次，劑量為10 mg/kg)、益生菌+抑制劑組(每種菌各以2×109CFU的菌液進(jìn)行灌胃前30 min，靜脈注射Dorsomorphin 1次，劑量為10 mg/kg)，每組10只，對照組和模型組分別注射和灌胃等量溶劑。其中對照組小鼠以普通飼料飼喂，其余各組小鼠以高脂高糖飼料飼喂。所有小鼠均自由攝食飲水，飼養(yǎng)環(huán)境相對濕度50%～60%，明暗周期12 h，溫度23 ℃～25 ℃，連續(xù)飼養(yǎng)6周，每隔1周記錄小鼠體質(zhì)量。

1.2.2 全自動生化分析儀檢測血清血脂：取尾靜脈血，2 000 r/min，離心10 min后取血清，采用全自動生化分析儀檢測各組小鼠血清中總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triacylglyceride，TAG)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)的含量。并分離肝臟組織，等分成4份，分別置于4%多聚甲醛、OCT包埋劑、2.5%戊二醛及-80 ℃冰箱中待用。

1.2.3 HE染色觀察各組小鼠肝臟組織病理學(xué)變化：取上述1.2.2中使用4%的多聚甲醛固定24 h的肝組織，行常規(guī)蘇木精-伊紅染色后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 油紅O染色觀察各組小鼠肝臟組織中脂肪蓄積情況：取上述1.2.2中使用OCT包埋劑包埋的肝組織進(jìn)行切片，行常規(guī)油紅O染色后，將切片置于光學(xué)顯微鏡下，觀察脂滴并拍照，脂滴呈橘紅色至鮮紅色。

1.2.5 透射電子顯微鏡觀察各組小鼠肝臟組織中自噬小體：取上述置于2.5%戊二醛中固定2～4 h后的肝組織，使用0.1 mol/L磷酸緩沖液沖洗3次，制作常規(guī)超薄切片(60～80 mm)，用2%醋酸鈾和枸櫞酸鉛各染色15 min，室溫干燥過夜，透視電子顯微鏡觀察肝臟組織自噬小體。

1.2.6 Western blot檢測各組小鼠肝臟組織中LC3、Beclin、SREBP-1c、AMPK、mTOR蛋白表達(dá)：使用蛋白提取試劑盒提取-80 ℃冰箱中的各組肝臟組織總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量，然后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、轉(zhuǎn)PVDF膜、5%脫脂奶粉封閉、1∶2 000濃度稀釋后的LC3、Beclin、SREBP-1c、AMPK、mTOR、p-AMPK、p-mTOR、β-actin鼠抗4 ℃過夜孵育、含辣根過氧化物酶綴合的二抗(1∶5 000)中室溫孵育2 h，用ECL顯色試劑盒顯色，β-actin為內(nèi)參，全能型凝膠成像分析系統(tǒng)分析蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量變化比較

與對照組相比，模型組小鼠體質(zhì)量均升高(P<0.05)；與模型組相比，益生菌組小鼠體質(zhì)量均降低(P<0.05)，抑制劑組小鼠體質(zhì)量均升高(P<0.05)；與益生菌組相比，益生菌+抑制劑組小鼠體質(zhì)量均升高(P<0.05)；與抑制劑組相比，益生菌+抑制劑組小鼠體質(zhì)量均降低(P<0.05)(表1)。

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化比較

2.2 各組小鼠血脂水平比較

與對照組相比，模型組小鼠TC、TAG和LDL升高，HDL降低(P<0.05)。與模型組相比，益生菌組小鼠TC、TAG和LDL降低，HDL升高(P<0.05)；抑制劑組小鼠TC、TAG和LDL升高，HDL降低(P<0.05)。與益生菌組相比，益生菌+抑制劑組小鼠TC、TAG和LDL升高，HDL降低(P<0.05)；與抑制劑組相比，益生菌+抑制劑組小鼠TC、TAG和LDL降低，HDL升高(P<0.05)(表2)。

表2 各組小鼠血脂水平比較Table 2 Comparison of blood lipid levels of mice in each mmol/L, n=10)

2.3 各組小鼠肝臟組織病理變化、脂肪蓄積及自噬小體比較

對照組小鼠肝臟組織著色均勻，無明顯脂肪空泡，無脂肪蓄積。與對照組相比，模型組小鼠肝臟組織出現(xiàn)明顯的空泡，細(xì)胞核染色加深，出現(xiàn)大量脂肪蓄積，自噬小體數(shù)目減少。與模型組相比，益生菌組小鼠肝臟組織著色趨于均勻，脂肪空泡減少，脂肪蓄積不明顯，自噬小體數(shù)目增多；抑制劑組小鼠肝臟組織脂肪空泡增多且變大，出現(xiàn)嚴(yán)重脂肪蓄積，自噬小體數(shù)目減少。益生菌+抑制劑組較益生菌組脂肪空泡增多和蓄積現(xiàn)象加重，較抑制劑組減輕，自噬小體數(shù)目較益生菌組減少，較抑制劑組增多(圖1)。

2.4 各組小鼠肝臟組織中脂代謝相關(guān)蛋白SREBP-1c、自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1蛋白表達(dá)水平及AMPK和mTOR蛋白磷酸化水平比較

與對照組相比，模型組小鼠SREBP-1蛋白表達(dá)及mTOR磷酸化水平升高，LC3和Beclin1蛋白表達(dá)及AMPK磷酸化水平降低(P<0.05)。與模型組相比，益生菌組小鼠SREBP-1c蛋白表達(dá)及mTOR磷酸化水平降低，LC3和Beclin1蛋白表達(dá)及AMPK磷酸化水平升高(P<0.05)； 抑制劑組小鼠SREBP-1c蛋白表達(dá)及mTOR磷酸化水平升高，LC3和Beclin1蛋白表達(dá)及AMPK磷酸化水平降低(P<0.05)。與益生菌組相比，益生菌+抑制劑組小鼠SREBP-1c蛋白表達(dá)及mTOR磷酸化水平升高，LC3和Beclin1蛋白表達(dá)及AMPK磷酸化水平降低(P<0.05)；與抑制劑組相比，益生菌+抑制劑組小鼠SREBP-1c蛋白表達(dá)及mTOR磷酸化水平降低，LC3和Beclin1蛋白表達(dá)及AMPK磷酸化水平升高(P<0.05)(圖2)。

3 討論

肥胖是當(dāng)今人類最普遍的健康問題之一。本研究通過構(gòu)建小鼠肥胖模型，發(fā)現(xiàn)模型組肥胖小鼠發(fā)生脂代謝紊亂且肝臟組織自噬減弱。腸道微生物群與肥胖兩者可通過遺傳、代謝等機制相互作用。其中乳酸菌和雙歧桿菌能夠誘導(dǎo)骨髓充質(zhì)干細(xì)胞的自噬激活，參與益生菌保護作用[7]。有實驗證明益生菌對高脂肪飲食引起的小鼠代謝紊亂的保護作用[8]，但脂代謝相關(guān)蛋白SREBP-1c表達(dá)的升高可加重肝脂質(zhì)積累[9]。本研究通過使用益生菌干預(yù)肥胖小鼠，發(fā)現(xiàn)益生菌可改善肥胖小鼠脂代謝紊亂，提高肝臟細(xì)胞自噬，但其中的機制并未完全闡明。

噬在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用，山茶酚可能通過AMPK/mTOR介導(dǎo)的自噬，使肝組織脂質(zhì)存儲減少、自噬小體增加[10]。?；D(zhuǎn)移酶可通過AMPK/mTOR途徑誘導(dǎo)自噬，從而減輕脂肪毒性[11]。醋氨酚可通過抑制AMPK通路，激活mTOR途徑， 從而抑制自噬，加重非酒精性脂肪性肝病中脂肪堆積[12]；紅蓮孢菌素龍膽二糖苷可通過激活A(yù)MPK信號通路，降低肥胖小鼠體質(zhì)量，抑制脂質(zhì)積累[13]。激活A(yù)MPK可通過負(fù)調(diào)控mTOR通路促進(jìn)自噬，減輕脂肪毒性。成纖維細(xì)胞生長因子21(FGF21)通過抑制AMPK/mTOR信號通路刺激胰島細(xì)胞自噬[14]，這與上述研究并不一致。但是，關(guān)于自噬與細(xì)胞及疾病關(guān)系一直是爭論的焦點，細(xì)胞既可通過提高自噬減少細(xì)胞壞死，減輕有毒物質(zhì)的積累，又可通過主動降低自身自噬活性，減少因自噬引起的細(xì)胞死亡[15]。本研究發(fā)現(xiàn)益生菌可能通過激活A(yù)MPK通路，負(fù)調(diào)控mTOR，促進(jìn)肝細(xì)臟自噬，改善肥胖小鼠脂代謝紊亂。進(jìn)一步探討發(fā)現(xiàn)益生菌對肥胖小鼠肝細(xì)臟自噬的促進(jìn)作用及對脂代謝的改善作用可被AMPK抑制劑Dorsomorphin逆轉(zhuǎn)，進(jìn)一步揭示益生菌可能通過AMPK/mTOR通路提高自噬，改善肥胖小鼠脂代謝紊亂。

1.control group; 2.model group; 3.probiotics group; 4.inhibitor group; 5.probiotics+inhibitor group;*P<0.05 compared with the control group; #P<0.05 compared with the model group; △P<0.05 compared with the probiotics group; ▲P<0.05 compared with the inhibitor group

綜上所述，益生菌可能通過激活肥胖小鼠肝臟組織中AMPK，進(jìn)而負(fù)調(diào)控mTOR通路，促進(jìn)自噬，減輕肝臟脂質(zhì)積累，改善脂代謝紊亂。但是益生菌對肥胖小鼠脂代謝紊亂的作用機制較復(fù)雜，尚需后續(xù)深入研究。