肝細(xì)胞癌中miR-574-5p的表達(dá)與作用及其與預(yù)后的關(guān)系

李乾，郭清皓

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院急診創(chuàng)傷外科，湖北武漢430000）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第六大惡性腫瘤，是癌癥相關(guān)死亡的第二大原因，每年在全球范圍內(nèi)造成近70 萬例患者死亡。HCC 發(fā)病有明顯的地域分布特點(diǎn)，以東南亞居多[1]。雖然得益于手術(shù)及靶向療法的發(fā)展，但是高復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率仍是影響HCC 術(shù)后預(yù)后不佳的主要原因。據(jù)報(bào)道[2]肝癌切除術(shù)后復(fù)發(fā)率在前2年約為50%，在5年內(nèi)增加至75%。深入闡述HCC 發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制，對篩選新型分子診斷標(biāo)志物、治療靶點(diǎn)及提升診治水平至關(guān)重要[3-4]。miRNA 是一類短鏈非編碼RNA，長度為18～22 個(gè)核苷酸，在轉(zhuǎn)錄后水平與靶基因mRNA 的3'-非翻譯區(qū)堿基配對，是一種調(diào)節(jié)基因表達(dá)的關(guān)鍵分子[5-6]。miRNA參與各種細(xì)胞生物學(xué)過程，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡和代謝[7-8]。miRNA 的異常表達(dá)可通過調(diào)節(jié)特定基因在腫瘤發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。miR-574-5p是最新鑒定的miRNA 分子，其在結(jié)直腸癌[10]中表達(dá)上調(diào)并通過Wnt/β-catenin 信號通路參與腫瘤進(jìn)展。miR-574-5p 在甲狀腺癌中上調(diào)表達(dá)，并與預(yù)后密切相關(guān)[11]。盡管如此，miR-574-5p 在HCC 中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系尚不清楚。本研究旨在評估m(xù)iR-574-5p 在HCC 中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本

收集2014年1月—2018年1月接受肝癌切除術(shù)的130 例HCC 患者的癌及癌旁組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴所有患者均接受肝癌切除術(shù)且經(jīng)病理確診為HCC[12]；⑵根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟第6 版腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（TNM）分類確定腫瘤TNM 分期；⑶患者按NCCN 指南標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行治療；⑷除肝癌外，患者不存在其他部位腫瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床及隨訪資料不全者。所有患者的組織標(biāo)本在手術(shù)切除后立即保存于-80 ℃冰箱直至統(tǒng)一檢測，HCC 組織選擇為癌組織，癌旁組織選擇為距離肝癌邊緣3 cm 的非癌肝組織。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意實(shí)施。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

正常肝細(xì)胞系L-02、HCC 細(xì)胞系HepG2 和MHCC-97H 購自中國科學(xué)院細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心（中國上海），所有細(xì)胞系均在37 ℃、5%CO2的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.3 研究方法

1.3.1 隨訪資料隨訪內(nèi)容包括肝癌切除術(shù)后每3 個(gè)月檢測血清甲胎蛋白（AFP）水平、腹部超聲檢查和胸部X 線檢查。當(dāng)懷疑腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)，進(jìn)行計(jì)算機(jī)斷層掃描或/和磁共振成像掃描以確認(rèn)診斷?？偵嫫诙x為手術(shù)日期與患者死亡日期或最后1 次隨訪日期間的時(shí)間間隔。無瘤生存期定義為從手術(shù)日期到腫瘤復(fù)發(fā)日期的時(shí)間，如果沒有證據(jù)表明腫瘤復(fù)發(fā)，則在最后1 次隨訪或死亡時(shí)進(jìn)行檢查。隨訪時(shí)間截止至2020年1月，共5 例患者失訪，在生存曲線上表示為截?cái)嘀怠?/p>

1.3.2 miR-574-5p 表達(dá)與臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系采 用 X-tile3.6.1（Yale University School of Medicine，USA）軟件，并基于Kaplan-Meier 法及Log-rank 檢驗(yàn)確立最佳截?cái)嘀?.25，將130 例患者癌組織分成miR-574-5p 高表達(dá)組（n=66）和miR-574-5p 低表達(dá)組（n=64），分析miR-574-5p 高低表達(dá)組與臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系。

1.3.3 qRT-PCR 測定使用Total RNA mini 試劑盒（Qiagen，美國）從HCC 組織和細(xì)胞系中提取總RNA。用Nanodrop 分光光度法測定總RNA 濃度和純度。使用高容量cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Applied Biosystems 公司）將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)制造商的說明，使用定量RT-PCR 檢測試劑盒（美國GeneCopoeia）進(jìn)行定量PCR。U6 用作miR-574-5p 檢測的內(nèi)參。PCR 引物序列如下：miR-574-5p 序列：正鏈：5'-TGC GGC AAC ACC AGT CGA TGG-3'，反鏈：5'-CCA GTG CAG GGT CCG AGG T-3'。U6 序列：正鏈：5'-GCT TCG GCA GCA CAT ATA AAA AAA T-3'，反鏈：5'-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT-3'。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.3.4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測將野生型FOG2 3'-UTR 和突變型FOG2 3'-UTR 插入PmirGLO 質(zhì)粒中。將pmirGLO-FOG2-wt/pmirGLO-FOG2-mut 和miR-574-5p 模擬物/siRNA 陰性對照共轉(zhuǎn)染到HepG2 細(xì)胞系中。轉(zhuǎn)染后24 h，應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)（Promega，美國）檢測熒光素酶活性。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.3.5 FOG2 蛋白表達(dá)及與miR-574-5p 的相關(guān)性通過Western blot 測定HCC 癌及癌旁組織中FOG2 蛋白表達(dá)水平。從上述癌組織中提取總蛋白并定量，通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。與FOG2 一抗（1∶300，美國Santa 公司）在4 ℃孵育過夜后，用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的驢抗山羊二抗（1∶500，美國Santa 公司）與PVDF 膜在37 ℃下孵育2 h。GAPDH 作內(nèi)參，最后，使用凝膠成像系統(tǒng)定量分析蛋白質(zhì)相對表達(dá)量。分析130 例癌組織中FOG2 蛋白表達(dá)與miR-574-5p 的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件包（SPSS，Chicago，IL）進(jìn)行，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，χ2檢驗(yàn)用于研究miR-574-5p 的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系，Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，Log-rank 檢驗(yàn)進(jìn)行比較。Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型用于單因素和多因素分析，Pearson 相關(guān)用于分析miR-574-5p 與FOG2 表達(dá)的相關(guān)性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-574-5p在HCC癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)

qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示，miR-574-5p 在癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織[（3.89±1.80）vs.(1.13±0.62)，P＜0.05]（圖1A）。 HCC 細(xì)胞系HepG2 及MHCC-97H 中miR-574-5p 表達(dá)量高于正常肝細(xì)胞系L-02[HepG2vs.L-02：(4.04±0.47)vs.(1.06±0.31)，P＜0.05；MHCC-97Hvs.L-02：(4.33±0.44)vs.(1.06±0.31)，P＜0.05]（圖1B）。

圖1 組織及細(xì)胞系中miR-574-5p 表達(dá)水平的比較A：miR-574-5p在HCC癌及癌旁組織中的表達(dá)比較；B：miR-574-5p在HCC細(xì)胞系及正常肝細(xì)胞系中的表達(dá)比較Figure 1 Comparison of the expression level of miR-574-5p in HCC tissues and cell linesA:Comparison of the expression of miR-574-5p in HCC and adjacent tissues;B:The expression of miR-574-5p in HCC cell lines and normal liver cell line

2.2 miR-574-5p表達(dá)水平與患者臨床病理因數(shù)的關(guān)系

X-tile 軟件確立miR-574-5p 表達(dá)量的最佳截?cái)嘀?.25，據(jù)此將130 例患者癌組織分成miR-574-5p高表達(dá)組（66 例）和miR-574-5p 低表達(dá)組（64 例）。分析結(jié)果顯示，miR-574-5p 表達(dá)與年齡、性別、AFP 濃度、腫瘤數(shù)目無明顯關(guān)系（均P＞0.05），miR-574-5p 表達(dá)與TNM 分期（P=0.002）和分化程度（P=0.000）有關(guān)（表1）。

表1 miR-574-5p的表達(dá)和臨床病理因數(shù)的關(guān)系[n（%）]Table 1 The relationship between the expression of miR-574-5p and clinicopathologic parameters[n(%)]

2.3 miR-574-5p 表達(dá)水平與HCC 患者總生存率及無瘤生存率的關(guān)系

Kaplan-Meier 生存曲線表明，miR-574-5p 高表達(dá)組1年總生存率為64.1%，3年總生存率為45.9%，5年總生存率為21.8%，miR-574-5p 低表達(dá)組1年總生存率為100%，3年總生存率為80.2%，5年總生存率為60.7%，miR-574-5p 高表達(dá)組總生存率低于miR-574-5p 低表達(dá)組（χ2=11.85，P＜0.01）；miR-574-5p 高表達(dá)組1年無瘤生存率為60.2%，3年無瘤生存率為41.5%，5年無瘤生存率為12.7%，miR-574-5p 低表達(dá)組1年無瘤生存率為90.3%，3年無瘤生存率為75.4%，5年無瘤生存率為56.1%，miR-574-5p 高表達(dá)組無瘤生存率低于miR-574-5p 低表達(dá)組（χ2=10.36，P＜0.01）（圖2A-B）。

圖2 miR-574-5p的表達(dá)與HCC患者預(yù)后的關(guān)系A(chǔ)：總生存曲線；B：無瘤生存曲線Figure 2 The relationship between the expression of miR-574-5p and the prognosis of HCC patientsA:Overall survival curve;B:Tumor-free survival curve

2.4 HCC預(yù)后的影響因素分析

Cox 回歸單因素分析顯示，III～I(xiàn)V 期、中低分化及miR-574-5p 高表達(dá)為影響HCC 總生存率的因素（均P＜0.05），III～I(xiàn)V 期及miR-574-5p 高表達(dá)為影響無瘤生存率的因素（均P＜0.05）（表2）。Cox 回歸多因素分析顯示，miR-574-5p 高表達(dá)、III～I(xiàn)V 期及中低分化程是影響HCC 患者總生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（均P＜0.05），III～I(xiàn)V 期及miR-574-5p 高表達(dá)是影響HCC 患者無瘤生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（均P＜0.05）（表3）。

表2 影響HCC預(yù)后的單因素分析Table 2 Univariate analysis of factors for the prognosis of HCC

表3 影響HCC預(yù)后的多因素分析Table 3 Multivariate analysis of factors for the prognosis of HCC

2.5 miR-574-5p靶基因分析

TargetScan 軟件發(fā)現(xiàn)FOG2 存在和miR-574-5p 直接結(jié)合靶點(diǎn)（圖3A）。雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明，與FOG2-WT-3'-UTR 野生型質(zhì)粒和miR-574-5p模擬物共轉(zhuǎn)染的螢光素酶活性明顯降低（P＜0.05）。但FOG2-MUT-3'-UTR 和miR-574-5p 模擬物共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性沒有變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖3B）。上述結(jié)果表明FOG2 是miR-574-5p的直接靶基因。

圖3 miR-574-5p的靶基因分析A：FOG2與miR-574-5p存在結(jié)合靶點(diǎn)；B：雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證FOG2是miR-574-5p的靶標(biāo)Figure 3 Analysis of the target genes of miR-574-5pA:Binding site between FOG2 and miR-574-5p; B:Dual luciferase assay verifying that FOG2 is the target of miR-574-5p

2.6 FOG2 在HCC 中的表達(dá)及其與miR-574-5p 的關(guān)系

Western blot 結(jié)果顯示，F(xiàn)OG2 在癌中的表達(dá)量低于癌旁組織（圖4A）；Pearson 相關(guān)分析示，HCC癌組織中miR-574-5p 與FOG2 蛋白表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.499，P＜0.05）（圖4B）。

圖4 FOG2的表達(dá)及其與miR-574-5p表達(dá)的關(guān)系A(chǔ)：Western blot檢測FOG2在HCC及癌旁組織中的表達(dá)；B：FOG2表達(dá)與miR-574-5p的相關(guān)性分析Figure 4 FOG2 expression and its relation with miR-574-5p expressionA:Western blot experiment shows the expression of FOG2 in cancer and adjacent tissues;B:Correlation analysis of FOG2 expression and miR-574-5p

3 討論

HCC 是常見的惡性腫瘤之一，HCC 發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素是HBV 慢性持續(xù)感染，HCC 在亞太地區(qū)，尤其是中國，發(fā)病率較高[13-14]。2018年11月國家癌癥中心發(fā)布最新數(shù)據(jù)表明，我國癌譜構(gòu)成中，雖然肝癌病死率趨勢略有下降，但其發(fā)病率仍高居惡性腫瘤的第4 位，腫瘤相關(guān)死亡位居第2 位[14-16]。肝癌的主要治療方法為手術(shù)切除、放化療及分子靶向治療。近年來，盡管放化療、栓塞治療和免疫治療取得了長足進(jìn)步，但鑒于轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，HCC 患者預(yù)后仍較差[17-19]。闡述HCC 發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制對于深入探尋HCC 的發(fā)生機(jī)制和開發(fā)新的治療靶點(diǎn)具有重要的意義。

miRNA 是短鏈（18～22 個(gè)核苷酸）非蛋白質(zhì)編碼RNA 分子，可通過結(jié)合靶基因mRNA 來調(diào)控基因表達(dá)，依據(jù)靶基因的功能，參與細(xì)胞生物學(xué)功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、凋亡、增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等過程，發(fā)揮癌基因或抑癌基因的功能而參與腫瘤的發(fā)生或進(jìn)展[20-21]。miR-574-5p 最先在非小細(xì)胞肺癌中被鑒定，研究[22]發(fā)現(xiàn)miR-574-5p 在非小細(xì)胞肺癌患者血漿中表達(dá)水平增加，可作為非小細(xì)胞肺癌診斷標(biāo)志物。后續(xù)文獻(xiàn)報(bào)道在乳腺癌[23]中其可通過miR-574-5p-ZEB1 軸調(diào)控乳腺癌的發(fā)生和進(jìn)展。在甲狀腺癌中發(fā)現(xiàn)miR-574-5p 高表達(dá)可通過Wnt/β-catenin 信號途徑而調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡[24]。本研究首先檢測130 例HCC 癌組織和癌旁組織中miR-574-5p 表達(dá)水平，結(jié)果顯示HCC 癌組織中miR-574-5p 表達(dá)水平顯著高于癌旁組織。同時(shí)與正常肝細(xì)胞系（L-02）相比，肝癌細(xì)胞系（HepG2 和MHCC-97H）中miR-574-5p 表達(dá)水平顯著增加，上述研究結(jié)果顯示在HCC 癌組織和細(xì)胞系中，miR-574-5p 表達(dá)水平上調(diào)。

本研究將HCC 患者分為miR-574-5p 高、低表達(dá)兩組，發(fā)現(xiàn)miR-574-5p 高表達(dá)組患者存在較高的TNM 分期（III～I(xiàn)V）和中低分化程度，表明miR-574-5p 高表達(dá)與HCC 患者惡性程度密切相關(guān)，提示miR-574-5p 高表達(dá)可能促進(jìn)HCC 的惡性進(jìn)展。文獻(xiàn)[25]報(bào)道在結(jié)直腸癌中，長鏈非編碼RNA MFI2-AS1 可調(diào)節(jié)miR-574-5p/MYCBP 軸而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，其中miR-574-5p 呈高表達(dá)且與結(jié)直腸癌TNM 分期密切相關(guān)，這與本研究結(jié)果類似。本研究通過比較miR-574-5p 高低表達(dá)兩組患者隨訪期間無瘤生存率和總生存率，顯示miR-574-5p 低表達(dá)組患者的無瘤生存率和總生存率均優(yōu)于miR-574-5p 高表達(dá)組患者，Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型發(fā)現(xiàn)miR-574-5p 高表達(dá)是預(yù)測肝癌患者無瘤生存率和總生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，上述研究結(jié)果顯示miR-574-5p 高表達(dá)是HCC 患者預(yù)后的分子標(biāo)志物。

FOG2 是轉(zhuǎn)錄因子GATA 家族的共調(diào)節(jié)因子，其在人體組織中的腦、心臟、肝臟、肺、睪丸和骨骼肌等各種組織中廣泛表達(dá)，F(xiàn)OG2 生理功能多樣化。研究顯示其在冠狀血管發(fā)育、心臟形態(tài)、胰島素信號通路調(diào)節(jié)和脂質(zhì)代謝中發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)作用[26-27]。最近研究[28]表明，F(xiàn)OG2 可能是PI3K/Akt 信號通路的新型抑制劑。文獻(xiàn)[29]研究顯示在人肝星狀細(xì)胞中，miR-200c 通過靶向FOG2/PI3K 信號通路加速促進(jìn)肝星狀細(xì)胞誘導(dǎo)的肝纖維化。文獻(xiàn)[30]報(bào)道在HCC 細(xì)胞系中，沉默F(xiàn)OG2 表達(dá)可促進(jìn)HCC 細(xì)胞增殖和侵襲。本研究進(jìn)一步研究miR-574-5p 潛在的作用機(jī)制，雙熒光素報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示FOG2 是miR-574-5p 的直接靶基因。同時(shí)在HCC 癌組織中FOG2 表達(dá)水平與miR-574-5p 表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，上述研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了miR-574-5p 和FOG2 存在重要的調(diào)節(jié)關(guān)系，miR-574-5p 高表達(dá)的HCC 患者預(yù)后差的機(jī)制可能與下調(diào)FOG2 表達(dá)，而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲有關(guān)。

由于本研究僅探討了miR-574-5p 在HCC 癌組織中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系，miR-574-5p 與FOG2的靶向相關(guān)關(guān)系，尚存在一定的不足。首先，miR-574-5p 在HCC 細(xì)胞系中的功能如何，對細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移的影響尚不得而知；其次，miR-574-5p 在裸鼠動(dòng)物模型中的功能也值得進(jìn)一步探討，也是本研究后期的研究方向。

綜上，HCC 組織和細(xì)胞系中miR-574-5p 表達(dá)水平上調(diào)，miR-574-5p 是HCC 不良預(yù)后的分子標(biāo)志物，miR-574-5p 可通過靶向FOG2 而參與HCC 的發(fā)生和進(jìn)展，是HCC 潛在治療和預(yù)后的靶向標(biāo)志物。