miR-200a-3p在膽囊癌中的表達(dá)及其作用與機(jī)制

孔祥海，胡敏，王笛樂，王李理，何濤

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院普通外科，湖北武漢430014）

膽囊癌是一種來源于膽囊上皮的惡性腫瘤，約占全部膽道腫瘤的80%～95%[1-2]。全球腫瘤流行病學(xué)調(diào)查顯示，2018年約有22 萬例新發(fā)患者和超過15 萬例患者死于膽囊癌[3]。與其他消化道腫瘤相比,膽囊癌起病隱匿,早期可通過直接浸潤、淋巴結(jié)和血液擴(kuò)散轉(zhuǎn)移[4-5]。由于腫瘤篩查不足和缺乏特異性腫瘤標(biāo)志物，大多數(shù)患者在確診時已進(jìn)入中晚期，5年生存率低于5%[6]。深入研究膽囊癌的發(fā)病機(jī)制對提高診治水平具有重要的意義。microRNA（miRNA）是一種長度為17～25 nt 的短鏈高度保守的非編碼RNA，其主要通過與靶基因mRNA 的3'-UTR 端互補(bǔ)序列結(jié)合以降解或抑制靶基因mRNA 而沉默基因表達(dá)[7-8]。文獻(xiàn)[9]報道m(xù)iRNA 可通過調(diào)節(jié)下游特定靶基因抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和增殖。miR-200a-3p 是新鑒定的miRNA 分子，基因位于22 號染色體上，在非小細(xì)胞肺癌[10]、胃癌[11]、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤[12]、腎細(xì)胞癌[13]中發(fā)揮抑癌基因的作用，但是在卵巢癌[14]中卻扮演癌基因的角色。盡管如此，miR-200a-3p 在膽囊癌中的表達(dá)情況，及對增殖和侵襲的影響及機(jī)制鮮見報道。本研究旨在探討膽囊癌患者癌組織和細(xì)胞系中miR-200a-3p 表達(dá)情況及對細(xì)胞增殖和侵襲的影響，并探討可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 臨床組織標(biāo)本采集

本研究納入我院普外科于2016年1月—2020年12月收治并接受膽囊癌切除術(shù)的32 例患者，其中男18 例，女14 例；平均年齡（58.9±5.0）歲。采集膽囊癌患者術(shù)后癌及癌旁組織并保存于-80 ℃冰箱待測。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴通過病理和影像學(xué)診斷為膽囊癌的患者；⑵均接受膽囊癌切除術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴存在其他部位的腫瘤患者；⑵臨床檢驗資料不全者。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)并符合赫爾辛基宣言。

1.2 主要儀器和試劑

膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD、SGC-996、NOZ，及正常人膽囊上皮細(xì)胞系HGBEC 由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院肝膽胰外科實驗室贈予。Notch2、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)分子（E-cadherin、vimentin）、GAPDH 一抗和HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 二抗購自美國Abcam 公司。RIPA 試劑盒、BCA蛋白試劑盒、ECL 試劑盒、胰蛋白酶和Lipofectamine ? 3000 轉(zhuǎn)染試劑購自美國Thermo Scientific 公司。TransScript II Green 兩步法qRT-PCR SuperMix（AQ301-01）和TransScript Green miRNA 兩步法qRT-PCR SuperMix（AQ202-01）試劑盒購自廣州銳博生物公司。MTT 細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司。Transwell 試劑盒購自美國Gibco 公司。RT-PCR 儀購自美國BD 公司。上海吉瑪公司負(fù)責(zé)miR-200a-3p 模擬物序列、miR-200a-3p抑制物序列及陰性對照序列的設(shè)計和合成。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

膽囊癌細(xì)胞系（GBC-SD、SGC-996、NOZ）及正常人膽囊上皮系HGBEC 在含有10%FBS、青霉素-鏈霉素DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在37 ℃和5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine?3000 試劑盒，對GBC-SD 及NOZ 細(xì)胞系按試劑盒說明書轉(zhuǎn)染miR-200a-3p 模擬物（miR-200a-3p 過表達(dá)組）、miR-200a-3p 抑制物（miR-200a-3p 沉默組）、陰性對照序列（陰性對照組），轉(zhuǎn)染成功后行后續(xù)實驗。

1.4 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）實驗

使用TRIzol 試劑盒提取細(xì)胞系、癌和癌旁組織中的總RNA，通過紫外分光光度計測定其濃度和純度，然后按照試劑盒指導(dǎo)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件：95 °C 15 min；95 °C 15 s；58 °C 30 s；72 °C 15 min，共35 個循環(huán)。每個標(biāo)本設(shè)3 個復(fù)孔，每個標(biāo)本測定3 次，以U6 作為miR-200a-3p 內(nèi)參。使用2-ΔΔct法計算miR-200a-3p 的相對表達(dá)量。miR-200a-3p引物序列正向引物：5'-TAA CAC TGT CTG GTA ACG ATGT-3'，逆向引物：5'-CAT CTT ACC GGA CAG TGC TGG A-3'。U6 引物序列正向引物：5'-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3'，逆向引物：5'-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3'。

1.5 細(xì)胞增殖測定

采用MTT 實驗測定細(xì)胞增殖能力，將轉(zhuǎn)染24 h的3 組細(xì)胞以4×106個細(xì)胞/孔置于96 孔板中，置入后0、24、48、72 h 每孔加入10 μL MTT 溶液和90 μL DMEM 培養(yǎng)液，然后37 ℃下培養(yǎng)2 h 后，通過酶標(biāo)儀測量每孔在490 nm 處的光密度值A(chǔ)490nm。

1.6 細(xì)胞侵襲測定

將轉(zhuǎn)染24 h 的3 組細(xì)胞以5×104個細(xì)胞/孔置于6 孔板上。將細(xì)胞和DMEM 培養(yǎng)液（200 μL）置于上隔室，將500 μL 含20% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液置于下隔室。37 ℃培養(yǎng)48 h 后，擦去未能穿膜的基質(zhì)和細(xì)胞。漂洗3 次，多聚甲醛固定10 min。穿膜的侵襲細(xì)胞用0.5%結(jié)晶紫染色，并在200×視野下用顯微鏡進(jìn)行計數(shù)分析。

1.7 Western blot檢測

收集各組培養(yǎng)細(xì)胞，RIPA 裂解提取總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度?？偟鞍淄ㄟ^12%SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上。加入Notch2（1∶300）、E-cadherin（1∶200）、vimentin（1∶300）及GAPDH（1∶500）一抗并在4 ℃下孵育過夜，漂洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶500）在室溫下孵育1 h。ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒用于檢測目標(biāo)蛋白條帶，掃描條帶灰度，通過Quantity One 計算其灰度值。目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 條帶灰度值。

1.8 miR-200a-3p靶基因預(yù)測和驗證

MiRBD/Targetscan7.2/starBase2.0/miRtarbase 網(wǎng)站用于預(yù)測miR-200a-3p 的下游靶基因。采用熒光素酶實驗驗證 miR-200a-3p 的靶基因，使用Lipofectamine?3000 試劑盒將miR-200a-3p 模擬物分別與PmirGLO-Notch2-3'UTR 野生型質(zhì)粒（WT）、pmirGLO-Notch2-3'UTR 突變型質(zhì)粒（MUT）共轉(zhuǎn)移到HEK293T 細(xì)胞中。熒光素酶活性用螢火蟲熒光素酶活性檢測試劑盒進(jìn)行檢測。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

本研究采用SPSS 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，GraphPad 7 進(jìn)行繪圖。多組比較通過方差分析進(jìn)行，在方差分析有意義的基礎(chǔ)上采用LSD-t檢驗行兩組間比較，多個時間點(diǎn)的數(shù)據(jù)通過重復(fù)測量方差比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-200a-3p在膽囊癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)

膽囊癌組織中miR-200a-3p 表達(dá)量低于癌旁組織[（1.63±0.65）vs.（4.38±1.13），P＜0.05]（圖1A）；膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD、SGC-996、NOZ中miR-200a-3p表達(dá)量分別為1.18±0.06、1.06±0.05、0.87±0.04，正常人膽囊上皮系HGBEC 中miR-200a-3p 表達(dá)量為3.54±0.12，膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD、SGC-996、NOZ中miR-200a-3p 表達(dá)量低于正常人膽囊上皮系HGBEC（均P＜0.05）（圖1B）。

圖1 qRT-PCR檢測miR-200a-3p的表達(dá)A：miR-200a-3p在膽囊癌組織與癌旁組織中的表達(dá)；B：miR-200a-3p在膽囊癌細(xì)胞系與膽囊上皮細(xì)胞系中的表達(dá)Figure 1 Expression of miR-200a-3p determined by qRT-PCRA:Expressions of miR-200a-3p in gallbladder cancer and adja-cent tissues; B:Expressions of miR-200a-3p in gallbladder cancer cell lines and normal human gallbladder epithelial cell line

2.2 轉(zhuǎn)染效率檢測

GBC-SD 及NOZ 細(xì)胞系經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-200a-3p 模擬物及抑制物序列后，行qRT-PCR 檢測，結(jié)果顯示，兩種細(xì)胞的miR-200a-3p 過表達(dá)組miR-200a-3p 表達(dá)量均高于各自的陰性對照組（均P＜0.05），兩種細(xì)胞的miR-200a-3p 沉默組miR-200a-3p 表達(dá)量均低于各自的陰性對照組（均P＜0.05），提示轉(zhuǎn)染成功，可行下步實驗（圖2）。

圖2 qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率Figure 2 Determination of transfection efficiency by qRT-PCR

2.3 miR-200a-3p對膽囊癌細(xì)胞增殖的影響

MTT 實驗顯示，轉(zhuǎn)染24 h 后，兩種細(xì)胞各組的A490nm值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），轉(zhuǎn)染48、72 及96 h 后，兩種細(xì)胞的miR-200a-3p 過表達(dá)組A490nm值均明顯低于各自的陰性對照組（均P＜0.05），兩種細(xì)胞的miR-200a-3p 沉默組A490nm值均明顯高于各自的陰性對照組（均P＜0.05）（圖3）。

圖3 miR-200a-3p對膽囊癌細(xì)胞增殖的影響Figure 3 Influence of miR-200a-3p on proliferation of gallbladder cancer cells

2.4 miR-200a-3p對膽囊癌細(xì)胞侵襲能力的影響

GBC-SD 及NOZ 細(xì)胞系經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-200a-3p 模擬物及抑制物序列后，Transwell 實驗顯示，兩種細(xì)胞的miR-200a-3p 過表達(dá)組侵襲細(xì)胞數(shù)均少于各自的陰性對照組（均P＜0.05），兩種細(xì)胞的miR-200a-3p沉默組侵襲細(xì)胞數(shù)均多于各自的陰性對照組（均P＜0.05）（圖4）。

圖4 miR-200a-3p對膽囊癌細(xì)胞侵襲能力的影響Figure 4 Influence of miR-200a-3p on invasion abilities of gallbladder cancer cells

2.5 miR-200a-3p靶基因預(yù)測

在線預(yù)測網(wǎng)站（Targetscan 7.2/starBase 2.0/miRBD/miRtarbase）檢索分析顯示miR-200a-3p 和Notch2 存在潛在結(jié)合位點(diǎn)（圖5A）。熒光素酶實驗發(fā)現(xiàn)，miR-200a-3p 導(dǎo)致Notch2 野生型質(zhì)粒pmirGLO-Notch2-3'UT WT 熒光素酶活性明顯降低，而 miR-200a-3p 對 Notch2 突變型質(zhì)粒pmirGLO-Notch2-3'UTR MUT 的熒光素酶活性沒有影響（圖5B）。

圖5 miR-200a-3p的靶基因預(yù)測A：在線網(wǎng)站預(yù)測miR-200a-3p與Notch2存在靶向結(jié)合位點(diǎn)；B：熒光素酶實驗驗證Notch2為miR-200a-3p的靶基因Figure 5 Prediction of target genes of miR-200a-3pA:Binding sites between miR-200a-3p Notch2 predicted by online website analysis;B:Luciferase assay verification showing Notch2 is the target gene of miR-200a-3p

2.6 miR-200a-3p 表達(dá)與Notch2 及EMT 相關(guān)分子蛋白表達(dá)的關(guān)系

GBC-SD 及NOZ 細(xì)胞系經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-200a-3p 模擬物及miR-200a-3p 抑制物序列后，兩種細(xì)胞的miR-200a-3p 過表達(dá)組E-cadherin 蛋白表達(dá)量高于各自的陰性對照組、vimentin 蛋白表達(dá)量低于各自的陰性對照組、Notch2 蛋白表達(dá)量低各自的于陰性對照組（均P＜0.05）。兩種細(xì)胞的miR-200a-3p 沉默組E-cadherin 蛋白表達(dá)量低于各自的陰性對照組、vimentin 蛋白表達(dá)量高于各自的陰性對照組、Notch2 蛋白表達(dá)量高于各自的陰性對照組（均P＜0.05）（圖6）。

圖6 miR-200a-3p的表達(dá)對Notch2及EMT相關(guān)分子蛋白表達(dá)的影響Figure 6 Effects of miR-200a-3p on the expressions of Notch2 protein and EMT-associaed molecules

3 討論

膽囊癌患者病死率高的原因主要在于其起病隱匿，無明顯早期臨床特征，易于忽視；已診斷的膽囊癌常處于晚期，不適合手術(shù)，放化療效果差；膽囊癌患者缺乏有效的篩查手段[15-16]。臨床上缺乏針對膽囊癌特異性的腫瘤標(biāo)志物，因此尋找對膽囊癌具有特異性的腫瘤標(biāo)志物顯得尤為重要。

miRNA 是不具有編碼蛋白質(zhì)功能的短鏈RNA，其主要功能是與靶基因mRNA 的3'-UTR 末端結(jié)合而調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，起到抑制或降解靶基因的作用[17]。miR-200 家族共有5 組成員，包括miR-200a家族、miR-200b 家族、miR-200c 家族、miR-429 家族及miR-141 家族[18-19]。miR-200a-3p 屬于miR-200 家族，基因定位于染色體22q21.12 上，在炎癥反應(yīng)[20]、心肌缺血再灌注損傷[21]和腫瘤中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。在腦損傷誘導(dǎo)的膿毒癥中，miR-200a-3p可通過誘導(dǎo)活性氧促進(jìn)炎癥反應(yīng)[20]。依據(jù)miR-200a-3p 結(jié)合的靶標(biāo)分子功能不同，miR-200a-3p 在不同的腫瘤中發(fā)揮抑癌或促癌作用。在非小細(xì)胞肺癌[10]中，miR-200a-3p 呈低表達(dá)，且miR-200a-3p低表達(dá)與預(yù)后差相關(guān)，上調(diào)miR-200a-3p 可抑制胰島素受體底物2（insulin receptor substrate 2，IRS2）表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖、遷移及侵襲過程。在胃癌[11]中，miR-200a-3p 起抑癌基因的作用，miR-200a-3p 可靶向調(diào)節(jié)Krüppel 樣因子12（KLF12）表達(dá)，且上調(diào)miR-200a-3p 可抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤[12]中，miR-200a-3p 可通過介導(dǎo)PI3K-Akt/MAPK-ERK 信號通路抑制細(xì)胞增殖、侵襲及EMT 過程。在腎細(xì)胞癌[13]中，miR-200a-3p 在癌組織中呈低表達(dá)，過表達(dá)miR-200a-3p 通過靶向結(jié)合E3 泛素蛋白連接酶，抑制腎細(xì)胞癌細(xì)胞增殖及遷移過程，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然而，miR-200a-3p 在卵巢癌[14]卻是促癌基因，miR-200a-3p 高表達(dá)與腫瘤大小、轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)，并可促進(jìn)細(xì)胞增殖、克隆形成及侵襲過程。本研究發(fā)現(xiàn)miR-200a-3p 在膽囊癌組織中表達(dá)水平較正常癌旁組織顯著降低，提示miR-200a-3p 可能發(fā)揮抑癌基因功能。為探究miR-200a-3p 參與膽囊癌發(fā)病的分子機(jī)制，在體外細(xì)胞實驗中過表達(dá)及沉默膽囊癌細(xì)胞系（GBC-SD、NOZ）中miR-200a-3p 表達(dá)水平，進(jìn)行細(xì)胞增殖及侵襲實驗，發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-200a-3p 表達(dá)后，GBC-SD 及NOZ 細(xì)胞系細(xì)胞增殖能力受抑制，侵襲細(xì)胞數(shù)減少；反之，下調(diào)miR-200a-3p 表達(dá)后，可促進(jìn)GBC-SD 細(xì)胞系細(xì)胞增殖能力，侵襲細(xì)胞數(shù)增加。表明miR-200a-3p在膽囊癌中可能扮演抑癌基因的角色。這與非小細(xì)胞肺癌[10]、胃癌[11]、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤[12]、腎細(xì)胞癌[13]中的結(jié)果一致，但與卵巢癌[14]中的結(jié)果相反?？赡芘c腫瘤的異質(zhì)性及與miR-200a-3p 結(jié)合的靶基因所扮演的不同功能有關(guān)。

EMT 是指上皮細(xì)胞失去原有極性，從而獲得抗凋亡和較強(qiáng)的遷移及侵襲能力，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞的過程，在上皮源性腫瘤中發(fā)揮重要作用[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-200a-3p 后，代表上皮的標(biāo)志物E-cadherin 蛋白表達(dá)水平上調(diào)，而代表間質(zhì)的標(biāo)志物vimentin 卻下調(diào)表達(dá)，抑制miR-200a-3p表達(dá)后，E-cadherin 蛋白下調(diào)表達(dá)，而vimentin 上調(diào)表達(dá)，提示miR-200a-3p 過表達(dá)可抑制EMT 過程，這可能是miR-200a-3p 發(fā)揮抑癌作用的機(jī)制之一。

Notch2 是一種編碼跨膜蛋白的基因，作為膜結(jié)合配體的受體并與相鄰細(xì)胞發(fā)生相互作用[24]。Notch2 的改變通常與癌癥特別是膀胱尿路上皮癌密切相關(guān)[25]。Notch 信號通路廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物中，可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、分化及組織器官發(fā)育過程[26]。Notch 可通過PI3K/Akt 及Wnt/β-catenin 信號通路發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化、抗凋亡的作用[27]。Notch 通路在EMT 中起關(guān)鍵作用，Notch2 是Notch 信號通路中的重要因子之一，在卵巢上皮癌中，Notch2 分子被外泌體miR-34b 分子調(diào)控，并參與卵巢癌的EMT 過程[28]。研究發(fā)現(xiàn)miR-146a-5p 通過靶向Notch2 介導(dǎo)食管鱗狀細(xì)胞癌的EMT 過程[29]。本研究通過在線網(wǎng)站預(yù)測和熒光素酶實驗發(fā)現(xiàn)miR-200a-3p 靶基因是Notch2。對膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD 及NOZ 轉(zhuǎn)染miR-200a-3p 模擬物序列上調(diào)miR-200a-3p 表達(dá)后，Notch2 蛋白表達(dá)受抑制。反之，轉(zhuǎn)染miR-200a-3p 抑制物序列下調(diào)miR-200a-3p 表達(dá)后，Notch2 蛋白表達(dá)量上調(diào)，這進(jìn)一步驗證了Notch2 為miR-200a-3p 的靶標(biāo)分子。在本研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-200a-3p 表達(dá)后，Western blot 結(jié)果顯示EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)量發(fā)生變化，且Notch2 為miR-200a-3p 作用的靶基因，提示上調(diào)miR-200a-3p表達(dá)可能通過下調(diào)Notch2 分子抑制EMT 過程，進(jìn)而發(fā)揮抑癌功能。

由于本研究是在體外細(xì)胞系中的初步研究，尚存在一定不足之處，比如：上調(diào)miR-200a-3p 同時上調(diào)Notch2 對癌細(xì)胞表型及下游分子改變的影響，miR-200a-3p 表達(dá)與膽囊癌患者術(shù)后預(yù)后的關(guān)系等，都值得進(jìn)一步研究。

綜上，miR-200a-3p 可抑制膽囊癌細(xì)胞增殖和侵襲過程，發(fā)揮抑癌基因功能，機(jī)制可能與下調(diào)Notch2 及抑制EMT 過程有關(guān)。