地高辛和他莫昔芬協(xié)同抑制乳腺癌MCF-7細胞的增殖、遷移和侵襲

沈敬堃，朱海濤，梅珈彬，潘際剛，王 璐，王旭東

(1. 貴州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理學教研室, 貴州 貴陽 550025; 2.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院肝膽外科，貴州 貴陽 550004)

在中國，乳腺癌為女性發(fā)病率最高的癌癥(19.2%)，致死率為9.1%[1]。他莫昔芬是一種人工合成的化合物，其可與雌激素競爭性結合雌激素受體而發(fā)揮抗雌激素的作用，常用于雌激素受體陽性的乳腺癌的治療，可降低乳腺癌的復發(fā)率和死亡率，但他莫昔芬的長期使用產生的獲得性耐藥會導致療效降低[2]。地高辛(digoxin)是一種源自洋地黃的強心苷，主要用于治療充血性心力衰竭，其作用機制是抑制Na+/K+-ATP酶[3]。近年來，有文獻報道地高辛具有抗癌作用[4]。有研究發(fā)現地高辛可以逆轉MCF-7細胞對阿霉素的耐藥性[5]，表明地高辛具有提高其他抗癌藥療效的潛能，然而，地高辛聯(lián)合他莫昔芬對乳腺癌的增殖和凋亡的影響及其機制尚未見文獻報道。此外，乳腺癌造成的死亡大多與癌細胞的遷移相關，而癌細胞的遷移與上皮-間質轉化 (epithelial-mesencymal transition，EMT) 密切相關[6]。目前地高辛對乳腺癌細胞遷移、侵襲和EMT的影響以及地高辛和他莫昔芬聯(lián)合用藥是否能協(xié)同抑制乳腺癌細胞的遷移、侵襲和EMT尚未見文獻報道。

本研究測試了地高辛、紫杉醇、吉西他濱和阿霉素與他莫昔芬聯(lián)合用藥對乳腺癌MCF-7細胞增殖的抑制作用，檢測地高辛與他莫昔芬聯(lián)合用藥對MCF-7細胞遷移、侵襲和EMT的影響，并探索其對PI3K-AKT信號通路的影響，以期為臨床增強他莫昔芬的療效提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞 人乳腺癌細胞MCF-7購自中國科學院昆明細胞庫。

1.1.2主要試劑 DMEM(dulbecco’s modified eagle medium)培養(yǎng)基(C11995500BT，Gibco)、青霉素-鏈霉素雙抗(J180027)購自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)(1913444)購自Biological Industries公司；地高辛(HY-B1049)、他莫昔芬(HY-13757A)購自MedChemExpress公司，紫杉醇(MB1178)、阿霉素(MB1087)購自大連美侖公司，吉西他濱(G8970)、MTT噻唑藍(M8180)購自北京索萊寶公司；細胞凋亡試劑盒(KGA106)購自凱基生物公司；多克隆抗體PI3K(AP0230)、α-tubulin(BS1699)、二抗山羊抗兔(BS13278)、二抗山羊抗鼠(BS12478)購自Bioworld公司；多克隆抗體E-cadherin(20874-I-AP)、N-cadherin(22018-I-AP)、Vimentin(10366-I-AP)、caspase-3(66470-2-Ig)、caspase-9(10380-1-AP)、Bcl-2(12789-1-AP)、p-AKT(66444-I-Ig)購自Proteintech公司；多克隆抗體AKT(Gb111114)購自Servicebio公司，單克隆抗體p-PI3K(17366S)購自Cell Signaling公司；Immobilon Western HRP底物(WBKLS0500)購自EMD Millipore公司。

1.1.3儀器 恒溫CO2細胞培養(yǎng)箱(2001HY-6003，美國Thermo Fisher Scientific 公司)；超凈工作臺(SW-CJ-2D，蘇州凈化設備有限公司)；Epoch型全波長酶標儀(美國Bio-Tek 公司)；Novoexpress 流式細胞儀(美國艾森生物公司)；多功能成像系統(tǒng)(ChemiDoc MP,美國Bio-Rad公司)；倒置顯微鏡(Olympus 公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與藥液配置 乳腺癌MCF-7細胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基(高糖，含4.5 g·L-1葡萄糖、10% FBS和1%青霉素-鏈霉素)中，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。他莫昔芬、地高辛、紫杉醇、吉西他濱、阿霉素分別用DMSO配置為10 mmol·L-1的母液。

1.2.2MTT法檢測細胞活力 取對數生長期的MCF-7細胞(4×103個/孔) 接種于96孔板，每孔100 μL；培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。待細胞貼壁后，分別加入他莫昔芬(0、1、2.5、5、10 μmol·L-1)、地高辛(0、10、15、20、25 nmol·L-1)、紫杉醇(0、100、200、300、400 nmol·L-1)、吉西他濱(0、1、5、10、25 μmol·L-1)、阿霉素(0、1、5、10、25 μmol·L-1)以及上述濃度的他莫昔芬與地高辛、紫杉醇、吉西他濱、阿霉素聯(lián)合用藥，每組設置6個復孔。各組培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL MTT試劑，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中避光孵育4 h后用酶標儀在490 nm處檢測OD值。細胞增殖率/% = (試驗組OD值-空白組OD值) /(對照組OD 值-空白組OD 值) × 100%。用金氏公式[7]計算協(xié)同作用，q=E(A + B) /(EA +(1-EA) ·EB)，其中E(A + B)為藥物聯(lián)合作用的抑制率， EA、EB 分別為單獨藥物作用組的抑制率，q>1.15為協(xié)同作用，q=0.85-1.15為相加作用，q<0. 85為拮抗作用;實驗獨立重復3次。

1.2.3平板克隆實驗檢測細胞增殖能力 取對數生長期的MCF-7 細胞(1×103個/孔) 接種于6孔板中，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱。分為等體積DMSO(對照組)、他莫昔芬10 μmol·L-1單藥處理組、地高辛10 nmol·L-1單藥處理組和聯(lián)合用藥組，每組3個復孔，每組獨立重復實驗3次。待14 d后吸去6孔板中的培養(yǎng)基，用4%的多聚甲醛溶液固定細胞30 min，再用結晶紫常溫下染色30 min，烘箱烤干，拍照，計數各組的克隆形成數。

1.2.4劃痕愈合實驗檢測細胞遷移能力 取對數生長期的MCF-7細胞接種于6孔板中，每孔接種1×106個細胞，培養(yǎng)至90%-100%融合度，用200 μL槍頭在6孔板底做輕柔劃痕，劃一條豎線和一條橫線，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞2次，將6孔板放在倒置顯微鏡下觀察，在豎線和橫線交界處附近拍照，拍照后加藥，加藥分組為5 μmol·L-1他莫昔芬單藥組、10 nmol·L-1地高辛單藥組、聯(lián)合用藥組和等體積DMSO對照組，24 h后在相同的位置再次拍照。使用ImageJ軟件測量劃痕寬度，遷移率/%=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。每個加藥組設置3個復孔，實驗獨立重復3次。

1.2.5Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力 將無血清的DMEM培養(yǎng)基和Matrigel放在4 ℃冰箱預冷，按培養(yǎng)基：Matrigel=11 ∶1的比例配制基質膠，Transwell小室放置于24孔板中，每個Transwell小室均勻鋪100 μL基質膠，放回培養(yǎng)箱中靜置3 h，使其成為膠狀，取出24孔板，棄去上清液后加入PBS，靜置15 min后除去PBS。Transwell上室中加入200 μL細胞懸液使每個小室細胞數為2×104個，下室每孔加入600 μL含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，加藥分組為5 μmol·L-1他莫昔芬單藥組、10 nmol·L-1地高辛單藥組、聯(lián)合用藥組和等體積DMSO對照組，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，吸去上室和下室中的培養(yǎng)基，使用甲醇固定15 min，PBS清洗小室2遍，加入結晶紫染色30 min，PBS清洗2遍，棉簽輕輕擦去上室中未穿膜的細胞，放入烘箱烘干，取出置于倒置顯微鏡下觀察，隨機選取5個視野拍照并計數。每個加藥組設置3個復孔，實驗獨立重復3次。

1.2.6流式細胞術檢測細胞凋亡 取對數生長期的MCF-7細胞接種于6孔板中，每孔接種1×106個細胞，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜，待細胞完全貼壁后加藥，分為他莫昔芬10 μmol·L-1單藥處理組、地高辛50 nmol·L-1單藥處理組、聯(lián)合用藥組、等體積DMSO對照組，加藥24 h后，用不含EDTA的胰酶消化并收集細胞，加入5 μL的異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate isomer，Annex V-FITC)和5 μL的碘化丙啶(propidium iodide，PI)室溫避光反應15 min后進行流式細胞儀的檢測。實驗獨立重復3次。

1.2.7Western blot法檢測PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved-caspase-3、caspase-9、cleaved-caspase-9、N-cadherin、E-cadherin、Vimentin及tubulin蛋白的表達 取對數生長期的MCF-7細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)細胞至70%-80%融合度后加藥，采用與劃痕實驗相同的藥物濃度和分組，用以檢測EMT相關蛋白(N-cadherin、E-cadherin和Vimentin)的表達。采用與流式實驗相同的藥物濃度和分組，用以檢測凋亡相關蛋白(Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved-caspase-3、caspase-9和cleaved-caspase-9)和PI3K-AKT信號通路相關蛋白(PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT)的表達，加藥后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入RIPA細胞裂解液(使用前，先加1%的苯甲基磺酰氟混勻)，放置于冰上裂解20 min，收集含蛋白的裂解液于1.5 mL離心管中，4 ℃、12 000 r·min-1離心30 min后取上清液，BCA法定量蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，100 ℃煮5 min。每個泳道上30 μg蛋白樣品，SDS-PAGE電泳90 min分離蛋白，然后將蛋白電轉移至PVDF膜120 min，用5%的脫脂奶粉封閉2 h，分別加入PI3K、AKT、p-AKT、Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9、N-cadherin、E-cadherin、Vimentin(1 ∶1 000)及tubulin(1 ∶20 000)一抗，4 ℃孵育過夜，TBST清洗3次(10 min/每次)后再加入相應的二抗(1 ∶10 000)，室溫孵育2 h，TBST清洗3次(10 min/每次)，在膜上均勻滴加曝光液，后曝光顯影。以tubulin作為內參蛋白，目的蛋白(PI3K、p-PI3K、Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9、N-cadherin、E-cadherin、Vimentin)與內參蛋白條帶灰度值的比值為其相對表達量；p-AKT與AKT灰度值的比值為p-AKT的相對表達量。實驗獨立重復3次。

2 結果

2.1 紫杉醇、吉西他濱、阿霉素和地高辛聯(lián)合他莫昔芬對人乳腺癌細胞MCF-7增殖的影響MTT結果(Fig 1)顯示，紫杉醇、吉西他濱、阿霉素、地高辛、他莫昔芬單獨用藥對MCF-7細胞的活力均有顯著的抑制作用(P<0.05)，經金氏公式檢驗，各濃度紫杉醇、吉西他濱、阿霉素分別與他莫昔芬聯(lián)合用藥對MCF-7細胞活力的抑制作用均無協(xié)同效應(q值均小于1.15)，而各濃度的地高辛與他莫昔芬聯(lián)合用藥對MCF-7細胞活力的抑制作用均有明顯的協(xié)同效應(q值均大于1.15)。

2.2 地高辛和他莫昔芬聯(lián)合用藥對人乳腺癌細胞MCF-7克隆形成的影響克隆形成實驗結果(Fig 2)顯示，溶劑對照組、他莫昔芬單藥組、地高辛單藥組、聯(lián)合用藥組中MCF-7細胞克隆形成數分別為(355±9)個、(237±7)個、(215±7)個、(50±4)個。各用藥組與對照組相比差異均有顯著性(P<0.05)，藥物聯(lián)合組與各單獨用藥組相比，差異均有顯著性(P<0.01)。

2.3 地高辛與他莫昔芬聯(lián)合用藥對MCF-7 細胞的凋亡的影響流式細胞術結果(Fig 3)顯示，對照組、他莫昔芬組、地高辛組和聯(lián)合用藥組的凋亡率分別為(0.58±0.05)%、(1.33±0.08)%、(7.42±0.22)%、(22.59±0.87)%，各用藥組與對照組相比，差異均有顯著性(P<0. 05)；聯(lián)合用藥組和單藥組相比，差異均有顯著性(P<0.01)。

2.4 地高辛與他莫昔芬聯(lián)合用藥對凋亡相關蛋白的影響Western blot結果(Fig 4)表明，與對照組相比，他莫昔芬、地高辛和聯(lián)合用藥對caspase-3、caspase-9無明顯影響；促凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9的表達明顯增多(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達明顯減少(P<0.05)，和單獨用藥組相比，聯(lián)合用藥組的變化更為明顯(P<0.05)。

2.5 地高辛與他莫昔芬聯(lián)合用藥對乳腺癌MCF-7細胞遷移的影響劃痕實驗結果(Fig 5)顯示，對照組、他莫昔芬單藥組、地高辛單藥組、聯(lián)合用藥組的遷移率分別為(80.42±1.46)%、(64.15±1.19)%、(55.93±1.59)%、(31.08±4.17)%。與對照組相比，他莫昔芬、地高辛單藥組遷移率均明顯下調(P<0.05)，和單藥組相比，聯(lián)合用藥組遷移率明顯下調(P<0.05)。

Fig 1 Effects of different concentrations of tamoxifen combined with paclitaxel, gemcitabine, adriamycin and digoxin on proliferation of MCF-7 cells in vitro n=18)

Fig 2 Effect of tamoxifen, digoxin and combination treatment on cell colonies of MCF-7 cells n=9)

2.6 地高辛與他莫昔芬聯(lián)合用藥對乳腺癌MCF-7細胞侵襲的影響Transwell小室實驗結果(Fig 6)顯示對照組、他莫昔芬單藥組、地高辛單藥組和聯(lián)合用藥組發(fā)生侵襲的細胞數分別為(406.00±9.16)個、(226.67±11.71)個、(211.67±10.59)個、(54.33±4.04)個。與對照組相比，單藥組侵襲細胞數均顯著下調(P<0.01)，與單藥組相比，聯(lián)合用藥組侵襲細胞數明顯下調(P<0.01)。

Fig 3 Effect of tamoxifen, digoxin and combination treatment on apoptosis of MCF-7 cells n=3)

2.7 地高辛與他莫昔芬聯(lián)合用藥對乳腺癌MCF-7細胞中EMT相關蛋白水平的影響Western blot結果(Fig 7)表明，與對照組相比，間質表型指標蛋白N-cadherin和Vimentin的表達明顯減少，上皮表型指標蛋白E-cadherin的表達均明顯增多(P<0.05)，與單藥組對比，聯(lián)合用藥組的變化更為明顯(P<0.05)。

2.8 地高辛與他莫昔芬聯(lián)合用藥對PI3K-AKT信號通路的影響Western blot結果(Fig 8)顯示，和對照組對比他莫昔芬、地高辛和聯(lián)合用藥對AKT的表達無明顯影響，PI3K、p-PI3K和p-AKT的表達明顯降低(P<0.05)，與單藥組對比，聯(lián)合用藥組的變化更為明顯(P<0.01)。

Fig 4 Effect of tamoxifen, digoxin and combination treatment on expression of Bax, Bcl-2, caspase-3, cleaved-caspase-3, caspase-9 and cleaved-caspase-9 proteins in MCF-7 cells detected by Western blot n=3)

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，大約有70%的乳腺癌是雌激素受體陽性的[8]。他莫昔芬是雌激素受體陽性的乳腺癌最常用的內分泌治療藥物，可降低乳腺癌的復發(fā)率和死亡率，但乳腺癌細胞對他莫昔芬的耐藥性，成為降低他莫昔芬治療效果的主要原因之一[2]。因此有必要尋求增強他莫昔芬療效的方法，近年已有研究表明法他斯汀(Fatostatin)和沒食子酸月桂酯(Lauryl Gallate)等藥物與他莫昔芬聯(lián)合應用可以有效提高他莫昔芬的療效[9-10]。因此，他莫昔芬與其他藥物聯(lián)合應用可能成為提高療效的一種可行方法。

有研究發(fā)現服用地高辛的心臟病患者癌癥發(fā)病率降低，Na+/K+-ATP酶抑制劑可以在前列腺癌、乳腺癌、肺癌和白血病等疾病中發(fā)揮抗癌作用，一些Na+/K+-ATP酶抑制劑已在臨床前研究和臨床研究中發(fā)揮了很強的抗癌活性，這些結果表明了Na+/K+-ATP酶可能在腫瘤發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，其抑制劑的抗癌活性值得研究[11]。近年來，有研究發(fā)現地高辛可與順鉑和阿霉素等抗癌藥協(xié)同作用[12-13]，表明地高辛具有增強其他抗癌藥物療效的潛在價值。

Fig 5 Effect of tamoxifen, digoxin and combination treatment on migration of MCF-7 cells using wound healing assay n=9)

Fig 6 Effect of tamoxifen, digoxin and combination treatment on invasion of MCF-7 cells using transwell assay n=9)

Fig 7 Effect of tamoxifen, digoxin and combination treatment on expression of N-cadherin, E-cadherin and vimentin proteins in MCF-7 cells detected by Western blot n=3)

Fig 8 Effect of tamoxifen, digoxin and combination treatment on expression of PI3K, p-PI3K, AKT and p-AKT proteins in MCF-7 cells detected by Western blot n=3)

本研究通過MTT實驗檢測了紫杉醇、吉西他濱、阿霉素和地高辛與他莫昔芬聯(lián)合用藥對乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響，MTT結果經金氏公式驗證，不同濃度的他莫昔芬與不同濃度紫杉醇、吉西他濱和阿霉素聯(lián)合用藥均無明顯的協(xié)同作用，而不同濃度的他莫昔芬與不同濃度的地高辛聯(lián)合用藥對乳腺癌MCF-7細胞增殖的抑制作用均大于兩者單用之和，具有較明顯的協(xié)同作用。進一步細胞克隆實驗觀察確證了他莫昔芬聯(lián)合地高辛能協(xié)同抑制MCF-7細胞的增殖活動。

細胞凋亡是細胞在生理或病理條件下發(fā)生的自發(fā)的、程序性的死亡，它受到多種信號通路的調節(jié)。有研究表明，PI3K-Akt信號通路在乳腺癌中異?；罨痆14]，而PI3K-Akt信號通路可以通過多種途徑抑制腫瘤細胞的凋亡，其主要途徑有：促進抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，阻止Bax的活化而降低其促凋亡作用[15]。在應激刺激下，細胞的凋亡取決于抗凋亡的Bcl-2和促凋亡的Bax的比例，有利于凋亡的蛋白失衡將導致線粒體膜通透性的增加、細胞色素C的釋放，caspase的活化[16]。本研究通過流式細胞術發(fā)現，地高辛與他莫昔芬可以協(xié)同誘導MCF-7細胞的凋亡；Western blot實驗發(fā)現地高辛與他莫昔芬聯(lián)合用藥可以協(xié)同抑制PI3K蛋白表達和PI3K、AKT蛋白磷酸化，同時協(xié)同促進促凋亡蛋白如Bax的表達及caspase-3/9活化，并協(xié)同抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，這與流式細胞術實驗結果一致，提示地高辛可以協(xié)同他莫昔芬促進細胞凋亡，這可能是減少細胞增殖的重要原因。此外，有文獻報道地高辛可下調雌激素受體[17]，這可能與地高辛顯著增強他莫昔芬療效相關，具體機制有待進一步探討。

乳腺癌的轉移是乳腺癌患者生存的主要威脅之一，乳腺癌的轉移和EMT密切相關，EMT過程促進N-cadherin、vimentin等蛋白的表達，抑制E-cadherin等蛋白的表達[18]。目前，地高辛與其他抗癌藥聯(lián)合應用抑制癌細胞的增殖的研究較多，但關于地高辛聯(lián)合其他抗癌藥對癌癥細胞的遷移、侵襲和EMT的作用的研究較少。本研究通過劃痕愈合和Transwell小室實驗，發(fā)現地高辛與他莫昔芬在較低濃度的聯(lián)合用藥可在不明顯影響細胞活性的前提下，協(xié)同抑制MCF-7細胞的遷移和侵襲能力。與劃痕愈合及Transwell小室實驗結果一致，我們發(fā)現地高辛與他莫昔芬聯(lián)合用藥可協(xié)同抑制間質細胞標志蛋白N-cadherin和vimentin的表達，同時促進上皮細胞標志物E-cadherin的表達，提示地高辛與他莫昔芬可協(xié)同抑制乳腺癌細胞EMT。

綜上所述，地高辛可以協(xié)同他莫昔芬通過抑制PI3K-AKT信號通路，誘導乳腺癌MCF-7細胞的凋亡、抑制增殖。此外，地高辛與他莫昔芬在較低濃度時，可通過抑制乳腺癌MCF-7細胞的EMT而抑制遷移和侵襲。