基于通路擾動(dòng)相似性建模的抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥對(duì)分子協(xié)同組合發(fā)現(xiàn)及機(jī)制分析＊

孫繼佳，王睿瑞，張磊，劉保成＊＊，呂愛平，3，4＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)健康協(xié)同創(chuàng)新中心上海201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)數(shù)學(xué)與物理教研室上海201203；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院上海201203；4.香港浸會(huì)大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中國香港999077）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種發(fā)生在滑膜關(guān)節(jié)及其他器官系統(tǒng)的慢性、全身性、炎癥性疾病，也是一種慢性進(jìn)行性自身免疫性疾病[1]。近年來隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)的研究發(fā)展，顯示RA的發(fā)病機(jī)制與遺傳因素、細(xì)菌和病毒因素、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、細(xì)胞因子以及其他免疫細(xì)胞等的改變和影響有關(guān)[2]。RA的發(fā)病率隨著年齡的增長而增加，全世界每年約有0.3%-1.0%的人受其影響[3]，以35-50歲成年人多見，且女性發(fā)病率為男性的3倍左右[4]。目前，臨床上治療RA的藥物仍以西藥為主，但往往存在毒副作用較大[5-7]、治療費(fèi)用較高等特點(diǎn)，因此進(jìn)一步提高抗RA藥物的有效性、安全性以及降低治療成本，是當(dāng)前亟需解決的問題。

中醫(yī)藥治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎歷史悠久，積累了豐富的臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)，RA屬于中醫(yī)“痹證”的范疇，具有痹癥共有的病因[8-9]。《素問·痹證論》曰：“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也”，指出風(fēng)寒濕是引起痹證的主要因素。RA中醫(yī)辨證分型主要有脾腎虧虛、風(fēng)寒濕痹、痰濕阻絡(luò)、濕瘀痹阻等4種證型[10-11]，并認(rèn)為肝腎不足、氣血虧虛是RA發(fā)生的內(nèi)在因素，而風(fēng)寒濕是RA發(fā)生的誘發(fā)因素。目前，中藥及復(fù)方在治療RA的過程中，許多有效成分之間存在的組合機(jī)制尚不完全清楚，有效成分之間的協(xié)同性很少能夠從分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)角度進(jìn)行更為精準(zhǔn)地進(jìn)行定量描述；因此，需要建立更為適合的研究方法和技術(shù)，發(fā)現(xiàn)治療中起決定作用的主要成分，同時(shí)能夠篩選出具有協(xié)同治療作用的有效成分組合，以實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥及復(fù)方成分的進(jìn)一步“優(yōu)化”，進(jìn)而為中藥新組分開發(fā)提供理論和方法學(xué)上的支持。

藥對(duì)是中醫(yī)臨床遣藥組方常用的配伍形式，是歷代醫(yī)家逐漸積累經(jīng)驗(yàn)而來的精妙應(yīng)用形式，藥對(duì)通過協(xié)同增效、相制減毒、相反相成等形式應(yīng)用，介于中藥和方劑之間，是一個(gè)值得研究的群體[12-14]。那么，如何從分子機(jī)制角度深入探索藥對(duì)中不同成分之間的協(xié)同組合效應(yīng)并進(jìn)一步分析其作用機(jī)制，是亟需解決的實(shí)際問題。鑒于此，本研究從治療RA的典型藥對(duì)出發(fā)，綜合運(yùn)用生物信息學(xué)、化學(xué)信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等理論和技術(shù)，并創(chuàng)新性地提出一種基于通路譜擾動(dòng)相似性的計(jì)算方法，闡明不同藥對(duì)中有效成分在抗RA中的協(xié)同組合特征；同時(shí)，進(jìn)一步挖掘和分析藥對(duì)中有效成分作用的分子機(jī)制及功能，旨在為中藥藥對(duì)作用分子機(jī)理闡明及新組分開發(fā)提供有力的方法學(xué)上的支持。

1 材料與方法

1.1 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）差異基因篩選

在GEO（Gene Expression Omnibus，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）[15]數(shù) 據(jù)庫中，輸 入“Rheumatoid Arthritis”查詢和收集類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)的基因表達(dá)譜芯片，獲得GSE55235、GSE55457和GSE77298這3個(gè)與RA有關(guān)的表達(dá)譜數(shù)據(jù)；其中，GSE55235的平臺(tái)為GPL96[HG-U133A]Affymetrix Human Genome U133A Array，包含10個(gè)正常樣本與10個(gè)RA樣本；GSE55457的平臺(tái)為GPL96[HG-U133A]Affymetrix Human Genome U133A Array，包含10個(gè)正常樣本和13個(gè)RA樣本；GSE77298的平臺(tái)為GPL570[HG-U133_Plus_2]Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array，包含7個(gè)健康樣本和16個(gè)RA樣本。

利用R軟件GEOquery包下載所有3個(gè)表達(dá)譜數(shù)據(jù)芯片，并對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化、校正和基因名注釋等預(yù)處理；使用limma包對(duì)GSE55235、GSE55457和GSE77298分別進(jìn)行差異表達(dá)基因分析（differentially expressed genes，DEGs），并根據(jù)|logFC|>1.0及校正adj.p.value<0.05篩選出每組芯片數(shù)據(jù)中的上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)基因。

1.2 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)收集

我 們 依 次 從TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）[16]、DrugBank（https://www.drugbank.ca/）[17]數(shù)據(jù)庫收集與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)；在TTD中輸入“Rheumatoid Arthritis”輸入查找找出與RA相關(guān)的基因；在DrugBank中也同樣通過輸入“Rheumatoid Arthritis”搜索與治療RA相關(guān)的已認(rèn)證藥物及其作用的靶點(diǎn)。

再將基于GEO的差異基因分析篩選后的結(jié)果和通過數(shù)據(jù)庫查詢得到的靶點(diǎn)基因進(jìn)行合并、去除重復(fù)；通過UniProt（https://www.uniprot.org/）[18]數(shù)據(jù)庫對(duì)所有收集到靶點(diǎn)信息進(jìn)行確認(rèn)，組成一個(gè)RA疾病相關(guān)靶點(diǎn)基因集合SRA。

1.3 抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）典型藥對(duì)數(shù)據(jù)收集

根據(jù)課題組以往的文獻(xiàn)整理和分析，選擇了治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的兩種較為常見的藥對(duì)，即：肝腎不足型的典型藥對(duì)，獨(dú)活-桑寄生、濕熱痹阻型的典型藥對(duì)，黃柏-蒼術(shù)，以此進(jìn)行下一步研究和分析。

從TCMID 2.0（http://www.megabionet.org/tcmid/）[19]、ETCM數(shù) 據(jù) 庫（http://www.nrc.ac.cn:9090/ETCM/index.php/Home/Index/）[20]分別收集到與這4種中藥相關(guān)的化學(xué)成分和靶點(diǎn)數(shù)據(jù)，所有的中藥成分化學(xué)信息以及Canonical SMILES通過PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得。

1.4 藥對(duì)成分潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)與識(shí)別

藥對(duì)成分的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)主要由SEA（http://sea.bkslab.org/）[21]、HitPick（http://mips.helmholtz-muenchen.de/proj/hitpick）[22]以及ETCM數(shù)據(jù)庫來確定。根據(jù)藥對(duì)成分所對(duì)應(yīng)的Canonical SMILES，通過SEA和HitPick在線系統(tǒng)對(duì)抗RA藥對(duì)有效成分進(jìn)行潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，其中，選取SEA數(shù)據(jù)庫中評(píng)分值Max Tc>0.6，HitPick在線預(yù)測(cè)系統(tǒng)Precision值>50%的預(yù)測(cè)結(jié)果作為藥對(duì)成分的潛在作用靶點(diǎn)；ETCM中根據(jù)潛在候選靶點(diǎn)（Candidate Target Genes）評(píng)分值大于0.9，篩選出相應(yīng)成分的靶點(diǎn)，根據(jù)靶點(diǎn)基因集SRA，使用Venny 2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）工具進(jìn)行取交集，識(shí)別出藥對(duì)小分子潛在的抗RA靶點(diǎn)。

1.5 藥物小分子結(jié)構(gòu)相似性計(jì)算

一般認(rèn)為，如果兩個(gè)藥物小分子A和B的化學(xué)結(jié)構(gòu)越相似，則具有協(xié)同組合治療的可能性就越大；因此，我們先通過DRAGON 7（http://www.talete.mi.it/index.htm）軟件計(jì)算出藥物小分子1024維的分子指紋，再利用Tanimoto相似性系數(shù)（Tanimoto Coefficientbased Similarity）計(jì)算藥物小分子之間的結(jié)構(gòu)相似性即：

其中，F(xiàn)P(A)和FP(B)分別為藥物小分子A和B的分子指紋，SFPd(A,B)為分子結(jié)構(gòu)相似度。

1.6 基于通路擾動(dòng)相似性的中藥小分子協(xié)同組合機(jī)制發(fā)現(xiàn)

如果兩種藥物所作用的靶點(diǎn)屬于同一條信號(hào)通路，那么這兩種藥物分子協(xié)同組合的可能性就越高；根據(jù)現(xiàn)有方法，可以將每個(gè)藥物小分子所作用的靶點(diǎn)富集到所對(duì)應(yīng)的信號(hào)通路上，構(gòu)建藥物作用靶點(diǎn)的通路向量，以此來計(jì)算不同藥物分子作用通路的協(xié)同值。

雖然，這種評(píng)估方法相對(duì)簡單，但沒有考慮到小分子對(duì)每個(gè)通路的擾動(dòng)程度；因此，本文我們先利用clusterProfiler包[23]將藥物小分子作用的靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，按p.value<0.05和q.value<0.05得到相關(guān)通路；根據(jù)注釋得到的相應(yīng)通路集{TPk∣k=1,2,…,n}（n為通路個(gè)數(shù)）構(gòu)建一個(gè)由包含所有注釋通路所構(gòu)成的向量，即：通路向量TP=(tp1,tp2,…,tpn)，再根據(jù)以下流程（如圖1所示）構(gòu)建協(xié)同組合評(píng)價(jià)模型：

圖1 基于通路擾動(dòng)相似性方法的小分子協(xié)同機(jī)制發(fā)現(xiàn)方法示意圖

如果藥物小分子A作用的靶點(diǎn)集T(A)中的靶點(diǎn)屬于某一條通路TPk，那么通路譜TP對(duì)應(yīng)位置上對(duì)這條通路的藥物擾動(dòng)強(qiáng)度值為tpk(A)，否則為0，其中，tpk由下式計(jì)算得到，即：其中，l為通路TPk的靶點(diǎn)個(gè)數(shù)，m為靶點(diǎn)集T(A)的個(gè)數(shù)，dij為靶點(diǎn)之間在RA疾病相關(guān)PPI網(wǎng)絡(luò)上的最短路徑距離；由此得到藥物小分子A的靶點(diǎn)通路擾動(dòng)向量TP(A)；同理，得到藥物小分子B作用的靶點(diǎn)通路擾動(dòng)向量TP(B)。

根據(jù)所得到的向量TP(A)和TP(B)，就可以計(jì)算兩種藥物分子之間的通路譜擾動(dòng)相似性評(píng)分STPd(A,B)，另外，為防止出現(xiàn)分母為0的情況，利用改進(jìn)余弦距離公式進(jìn)行計(jì)算，即：

1.7 GO功能注釋與KEGG Pathway富集分析

基因本體（Gene Ontology，GO）數(shù)據(jù)庫是GO組織（GO Consortium）在2000年構(gòu)建的一個(gè)結(jié)構(gòu)化的標(biāo)準(zhǔn)生物模型，涵蓋了基因的生物過程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）和細(xì)胞分組（Cellular Component，CC）。一個(gè)生物過程或通路通常是由一組基因共同參與，而不是由單個(gè)基因完成的，富集分析的主要依據(jù)是：如果一個(gè)生物學(xué)過程或通路在已知的研究中發(fā)生異常，則共同發(fā)揮功能的基因極可能被選擇出來作為與這一過程或通路相關(guān)的基因集合。

本文，我們進(jìn)一步利用clusterProfiler工具包對(duì)所有藥對(duì)的潛在作用RA疾病的靶點(diǎn)集進(jìn)行GO功能和KEGG Pathway富集分析，按照p.value<0.05和q.value<0.05進(jìn)行篩選。

2 結(jié)果

2.1 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病基因收集及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

經(jīng)過分析，GSE55235中篩選得到1071個(gè)差異基因，其中，上調(diào)基因599個(gè)、下調(diào)基因472個(gè)；GSE55457中篩選得到312個(gè)差異基因，其中，上調(diào)基因189個(gè)、下調(diào)基因123個(gè)；GSE77298中篩選得到432個(gè)差異基因，其中，上調(diào)基因237個(gè)、下調(diào)基因195個(gè)。另外，將只要同時(shí)出現(xiàn)在任意兩個(gè)芯片表達(dá)數(shù)據(jù)中的差異基因都列入RA疾病基因集，由此，共獲得與RA疾病相關(guān)的267個(gè)差異基因（圖2）。

從DrugBank數(shù)據(jù)庫中收集到與RA治療相關(guān)的73個(gè)已證實(shí)的藥物及其對(duì)應(yīng)的193個(gè)靶點(diǎn)基因；又從TTD數(shù)據(jù)庫中收集得到139個(gè)與RA疾病相關(guān)的靶點(diǎn)基因；再將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫所收集到的靶點(diǎn)集進(jìn)行合并去除重復(fù)后，共獲得309個(gè)與RA相關(guān)的靶點(diǎn)基因。

最后，再將上述兩種方法（基于差異基因分析和靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫收集）獲得的所有基因進(jìn)行合并后，總共得到555個(gè)與RA相關(guān)的靶點(diǎn)基因，即靶點(diǎn)基因集SRA；進(jìn)一步再將SRA所有555個(gè)靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫得到蛋白相互作用關(guān)系，其中，參數(shù)設(shè)置：Organism設(shè)為Homo Sapiens，Combine Score閾值設(shè)為0.7；同時(shí)，采用Gephi0.9.2軟件構(gòu)建靶點(diǎn)蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖2）。

圖2 基于差異基因分析和藥物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫的抗RA靶點(diǎn)基因收集及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.2 藥對(duì)數(shù)據(jù)收集及潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)與識(shí)別

從TCMID、ETCM數(shù)據(jù)庫以及PubChem數(shù)據(jù)庫分別收集和整理獲得獨(dú)活、桑寄生、黃柏、蒼術(shù)、等4種中藥成分及其相關(guān)的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)；其中，獨(dú)活148個(gè)、桑寄生16個(gè)、黃柏62個(gè)、蒼術(shù)95個(gè)；說明：為了便于后續(xù)分析，我們還對(duì)獨(dú)活-桑寄生藥對(duì)164個(gè)成分進(jìn)行一一編號(hào)DS1-DS164，黃柏-蒼術(shù)藥對(duì)157個(gè)成分也依次編號(hào)為HC1-HC157。

利用SEA、HitPick以及ETCM，經(jīng)過靶點(diǎn)預(yù)測(cè)和閾值篩選得到相關(guān)成分的潛在作用靶點(diǎn)，進(jìn)一步，通過靶點(diǎn)基因集SRA識(shí)別出抗RA有效成分及其潛在作用靶點(diǎn)；其中，獨(dú)活-桑寄生藥對(duì)有53個(gè)成分及其作用的52個(gè)潛在RA靶點(diǎn)，黃柏-蒼術(shù)藥對(duì)有32個(gè)成分及其作用的28個(gè)潛在RA靶點(diǎn)，合并得到67個(gè)潛在作用靶點(diǎn)信息（表1）；不同藥對(duì)的成分-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)（圖3）。

圖3 （B）黃柏-蒼術(shù)藥對(duì)成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

圖3 （A）獨(dú)活-桑寄生藥對(duì)成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

表1 兩種藥對(duì)所有67個(gè)潛在作用靶點(diǎn)信息

2.3 小分子協(xié)同組合評(píng)分結(jié)果

利用1.5所述，分別對(duì)兩種藥對(duì)中的小分子協(xié)同組合進(jìn)行計(jì)算分析，根據(jù)協(xié)同分值Sd(A,B)值的大小來判斷兩種小分子是否存在可能協(xié)同作用及其強(qiáng)度；Sd(A,B)值越大，則對(duì)這對(duì)小分子對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)的擾動(dòng)程度就越大、協(xié)同組合治療特征也越強(qiáng)；本文中，我們規(guī)定協(xié)同評(píng)分值Sd(A,B)≥0.15的小分子組合被認(rèn)為是具有潛在的協(xié)同治療作用，兩種藥對(duì)中具有協(xié)同治療特性的小分子組合結(jié)果，如圖4所示，所有具有協(xié)同治療作用的中藥小分子信息（表2）。

表2 具有協(xié)同組合治療的2種藥對(duì)小分子信息

圖4 （B）黃柏-蒼術(shù)藥對(duì)協(xié)同小分子組合

圖4 （A）獨(dú)活-桑寄生藥對(duì)協(xié)同小分子組合

在獨(dú)活-桑寄生藥對(duì)中，我們發(fā)現(xiàn)存在15對(duì)具有通路協(xié)同治療特征的中藥小分子組合，其中，獨(dú)活中有4個(gè)小分子，分別為：DS51、DS75、DS120、DS137，桑寄生中有11個(gè)小分子，分別為：DS150、DS151、DS152、DS155、DS156、DS157、DS159、DS160、DS161、DS163、DS164。

在黃柏-蒼術(shù)藥對(duì)中，我們發(fā)現(xiàn)存在17對(duì)具有通路協(xié)同治療特征的中藥小分子組合，其中，黃柏中有14個(gè)小分子，分別為：HC9、HC16、HC23、HC24、HC33、HC39、HC60、HC9、HC16、HC23、HC24、HC33、HC39、HC60，蒼術(shù)中則有8個(gè)成分，分別是：HC66、HC70、HC71、HC126、HC66、HC70、HC71、HC126。

2.4 GO功能注釋與KEGG Pathway富集分析結(jié)果

利用clusterProfiler包進(jìn)一步對(duì)兩種藥對(duì)的作用靶點(diǎn)集進(jìn)行GO功能注釋和KEGG Pathway富集分析，其中，p.value<0.05和q.value<0.05，兩種藥對(duì)作用靶點(diǎn)的功能注釋與富集分析結(jié)果（圖5）。

圖5 （B）黃柏-蒼術(shù)藥對(duì)的作用靶點(diǎn)GO功能與KEGG通路富集分析結(jié)果

圖5 （A）獨(dú)活-桑寄生藥對(duì)的作用靶點(diǎn)GO功能與KEGG通路富集分析結(jié)果

獨(dú)活-桑寄生藥對(duì)作用靶點(diǎn)的GO功能注釋結(jié)果顯示，所涉及的BP功能有526個(gè)，主要包括：有機(jī)陰離子運(yùn)輸（GO:0015711）、類固醇激素反應(yīng)（GO:0048545）、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)（GO:0050727）、營養(yǎng)水平反應(yīng)（GO:0031667）、有機(jī)酸運(yùn)輸（GO:0015849）等；所涉及的MF功能有74個(gè)，主要包括：跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性（GO:0022804）、核受體活性（GO:0004879）、轉(zhuǎn)錄因子活性（GO:0098531）、類固醇激素受體活性（GO:0003707）、一元羧酸結(jié)合性（GO:0033293）等；所涉及的CC功能有19個(gè)，主要包括：轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體（GO:0005667）、神經(jīng)細(xì)胞體（GO:0043025）、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物（GO:0090575）、核轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體（GO:0044798）、膜筏（GO:0045121）等。KEGG通路富集分析顯示，獨(dú)活-桑寄生藥對(duì)作用靶點(diǎn)主要富集在14個(gè)相關(guān)信號(hào)通路，分別為：膽汁分泌通路（hsa04976）、乙肝通路（hsa05161）、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)通路（hsa02010）、花生四烯酸代謝通路（hsa00590）、PPAR信號(hào)通路（hsa03320）、利什曼 病 通 路（hsa05140）、PD-L1和PD-1通 路（hsa05235）、GnRH信號(hào)通路（hsa04912）、IL-17信號(hào)通路（hsa04657）、胰腺分泌通路（hsa04972）、甲狀旁腺激素通路（hsa04928）、Th17細(xì)胞分化信號(hào)通路（hsa04659）、葉酸生物合成通路（hsa00790）和抗葉酸通路（hsa01523）等。

續(xù)表

黃柏-蒼術(shù)藥對(duì)作用靶點(diǎn)的GO功能注釋結(jié)果顯示，所涉及的BP功能有373個(gè)，主要包括：細(xì)胞對(duì)外部刺激反應(yīng)（GO:0071496）、化學(xué)突觸傳遞的調(diào)節(jié)（GO:0050804）、突觸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控（GO:0099177）、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)（GO:0015711）、多細(xì)胞生物體內(nèi)平衡（GO:0048871）等；所涉及的MF功能有36個(gè)，主要包括：嘌呤 能 受 體 活 性（GO:0035586）、激 素 結(jié) 合（GO:0042562）、ATPase偶聯(lián)活性（GO:0042623）、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性（GO:0022804）、ATP酶活性（GO:0016887）等；所涉及的CC功能有27個(gè)，主要包括：神經(jīng)細(xì)胞體（GO:0043025）、膜筏（GO:0045121）、膜微區(qū)（GO:0098857）、膜區(qū)（GO:0098589）、樹突棘（GO:0043197）等。KEGG通路富集分析顯示，黃柏-蒼術(shù)藥對(duì)作用靶點(diǎn)主要富集在10個(gè)相關(guān)信號(hào)通路，分別為：神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路（hsa04080）、膽汁分泌通路（hsa04976）、鞘脂信號(hào)通路（hsa04071）、cAMP信號(hào)通路（hsa04024）、cGMP-PKG信 號(hào) 通路（hsa04022）、VEGF信 號(hào) 通 路（hsa04370）、腎 細(xì) 胞 癌 通 路（hsa05211）、胰腺癌通路（hsa05212）、氮素代謝通路（hsa00910）、近端小管碳酸氫鹽回收通路（hsa04964）等。

3 討論

近年來，許多學(xué)者從不同角度，尤其是基于對(duì)文獻(xiàn)的整理[24]、統(tǒng)計(jì)分析[25]、關(guān)聯(lián)規(guī)則挖掘[26]的方法來總結(jié)和歸納治療RA的核心藥對(duì)組合，發(fā)現(xiàn)川烏-桂枝、當(dāng)歸-川芎、當(dāng)歸-黃芪、黃柏-蒼術(shù)、獨(dú)活-桑寄生等藥對(duì)都具有較高使用頻率的用藥規(guī)律；此外，也有研究者利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[27]、實(shí)驗(yàn)手段[28,29]來分析和闡述抗RA藥對(duì)的藥理作用機(jī)制，進(jìn)一步揭示了藥對(duì)配伍的特點(diǎn)。

藥對(duì)小分子協(xié)同組合評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，獨(dú)活-桑寄生藥對(duì)中的DS51（4-Methoxyacetophenone）與DS163（Quercitrin-7-olate）具有最高的協(xié)同性評(píng)分值，且DS51與桑寄生中的其他7個(gè)成分（DS160、DS157、DS159、DS152、DS161、DS156、DS164）等都存在一定的通路協(xié)同作用機(jī)制。王友慶[30]等人研究證實(shí)，槲皮素（DS150，Quercetin）可通過抑制NF-κB激活，減弱炎癥環(huán)境下軟骨細(xì)胞內(nèi)MMP-13產(chǎn)生、基質(zhì)降解和細(xì)胞凋亡，起到保護(hù)軟骨的作用，而通過計(jì)算結(jié)果顯示，槲皮素可能與DS120這個(gè)小分子化合物具有協(xié)同治療作用。鄧?yán)騕31]等人研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α能促進(jìn)成纖維樣滑膜細(xì)胞IL-6及IL-1β的表達(dá)和分泌，并促進(jìn)p38MAPK的磷酸化及NF-κB核轉(zhuǎn)位，而齊墩果酸（DS152，Oleanolic acid）呈濃度依賴性抑制TNF-α誘導(dǎo)的HFLS炎癥因子的表達(dá)（IL-6及IL-1β），并抑制TNF-α誘導(dǎo)p38MAPK的磷酸化及NF-κB核轉(zhuǎn)位，而計(jì)算結(jié)果也提示4-Methoxyacetophenone可能在藥對(duì)中與齊墩果酸具有組合治療效應(yīng)。黃柏-蒼術(shù)藥對(duì)中的H24（28-Isofucostanol）與HC126化合物具有最高的協(xié)同評(píng)分，蒼術(shù)中的HC71（Icariside F2）與黃柏中的其他5個(gè)成分（HC33、HC16、HC9、HC39、HC60）均存在潛在的協(xié)同組合治療作用。研究顯示[32]，鹽酸藥根堿（HC9，Jatrorrhizine）能夠抑制體外滑膜細(xì)胞的增殖，遷移和分泌，并改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的大鼠模型；還有研究顯示[33]，Jatrorrhizine能抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成并防止磨損顆粒誘導(dǎo)的溶骨，已經(jīng)具有發(fā)展成為治療RA的新型治療劑的巨大潛力。綠原酸（HC23，Chlorogenic acid）能夠通過下調(diào)核因子κB配體誘導(dǎo)的活化T細(xì)胞c1表達(dá)的受體激活劑來抑制破骨細(xì)胞分化和骨吸收，可能是破骨細(xì)胞相關(guān)疾病伴發(fā)炎性骨破壞的潛在治療選擇[34,35]；另有研究也證明[36]，綠原酸和木犀草素（Luteolin）通過調(diào)節(jié)NF-κB和JAK/STAT信號(hào)通路的活化，協(xié)同抑制白介素1β誘導(dǎo)的成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖。桑寄生中的兒茶素（HC66，Epicatechin）[37]具有抗氧化，抗炎，抗微生物，抗過敏，抗癌，抗血栓形成和保肝等治療作用。由此，可以發(fā)現(xiàn)，通過我們所提出的計(jì)算和分析方法，不僅可以找藥對(duì)中一些抗RA的主要活性成分，同時(shí)，也能夠發(fā)現(xiàn)藥對(duì)中的哪些其他成分與這些主要活性成分產(chǎn)生了“1+1>2”作用，從分子和定量角度揭示了中藥藥對(duì)配伍的特征。

從藥對(duì)所作用靶點(diǎn)富集的通路來看，獨(dú)活-桑寄生作用靶點(diǎn)所富集通路中，如已有研究報(bào)道IL-17能夠調(diào)節(jié)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中SHP-2和IL-17RA/STAT-3所依賴的Cyr61、IL-23和GM-CSF的表達(dá)以及RANKL介導(dǎo)的成纖維細(xì)胞樣滑膜破骨細(xì)胞的生成，并可能揭示RA的發(fā)病機(jī)理的新機(jī)制[38]。已有報(bào)道還顯示[39]，可以通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞中花生四烯酸的代謝以對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的起到治療作用。黃柏-蒼術(shù)藥對(duì)中，例如，VEGF信號(hào)通路，目前已經(jīng)明確報(bào)道與RA疾病多種發(fā)病分子機(jī)制有關(guān)[40,41]；還有研究顯示[42]，可以通過調(diào)節(jié)MMP14和VEGF介導(dǎo)的間充質(zhì)細(xì)胞表達(dá)miRNA-150-5p外來體來治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。

此外，我們還發(fā)現(xiàn)獨(dú)活-桑寄生藥對(duì)主要涉及14個(gè)相關(guān)信號(hào)通路，黃柏-蒼術(shù)藥對(duì)則涉及10個(gè)相關(guān)信號(hào)通路，而兩種藥對(duì)中只有一個(gè)信號(hào)通路Bile secretion（hsa04976）是相同的，提示中醫(yī)在RA治療中針對(duì)不同證型采用不同的中藥配伍，因此，涉及到對(duì)不同信號(hào)通路的作用調(diào)控，從一定程度上反映了中醫(yī)“同病異治”的特征。

綜上所述，本文我們綜合了生物信息、化學(xué)信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及計(jì)算建模等多種手段，通過GEO差異基因分析篩選RA關(guān)鍵基因，再結(jié)合已知數(shù)據(jù)庫中的RA的相關(guān)靶點(diǎn)信息，構(gòu)建了一個(gè)較為可靠的RA疾病PPI網(wǎng)絡(luò)；選取了兩種不同證型的經(jīng)典藥對(duì)：獨(dú)活-桑寄生和黃柏-蒼術(shù)，整理得到了兩種藥對(duì)的主要成分?jǐn)?shù)據(jù)，并預(yù)測(cè)其潛在作用靶點(diǎn)；通過我們所提出的基于通絡(luò)擾動(dòng)的相似性計(jì)算建模方法，挖掘出了不同藥對(duì)中具有協(xié)同組合治療的小分子組合；本文所提出的研究方法，從一個(gè)全新角度揭示了中藥藥對(duì)內(nèi)在成分的作用機(jī)制和規(guī)律，為后續(xù)深入開展實(shí)驗(yàn)研究提供技術(shù)上有力的支持。