中藥復方腦泰方藥理藥效及有效組分關(guān)聯(lián)分析＊

米招娣，蘭 斌，成紹武，廖 君，王國佐，葛金文

（湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點實驗室 長沙410208）

腦梗死又稱缺血性中風，因腦動脈阻塞和血流灌注不足導致大腦缺血缺氧所致，約占總腦卒中病例的87%[1]。該病具有高發(fā)病率、高死亡率、高復發(fā)率及高致殘率的特點，是全球第2大死亡原因[2]。腦梗死屬中醫(yī)學“中風”范疇，臨床病癥復雜多樣，氣、血、痰、瘀、虛皆可引起腦梗死，在病機方面，氣虛血瘀是腦梗死主要病機特點之一。中醫(yī)藥在治療腦梗死方面有其獨特的優(yōu)勢，以其多層次、多靶點的整體調(diào)節(jié)作用，在改善腦梗死患者的臨床癥狀、提高生活質(zhì)量、延長生存周期等方面顯示出獨特的優(yōu)勢，越來越受到人們的關(guān)注。

中藥復方腦泰方是在中醫(yī)藥理論指導下，以清代醫(yī)家王清任《醫(yī)林改錯》中的“補陽還五湯”為基礎(chǔ)，結(jié)合臨床經(jīng)驗化裁，運用現(xiàn)代藥理及制劑工藝研制而成，是本研究團隊負責人葛金文教授防治中風的專利處方（專利號：ZL201110178359.4）。該方由黃芪、川芎、僵蠶和地龍組成，具有益氣活血、化痰通絡(luò)之功效，是治療氣虛血瘀型腦梗死的有效方劑[3]，本研究團隊自2001年起研究其抗腦缺血損傷的作用機理。隨著腦泰方相關(guān)生物信息學研究的不斷推進，運用網(wǎng)絡(luò)藥理學技術(shù)、蛋白芯片技術(shù)對腦泰方有效物質(zhì)基礎(chǔ)進行系統(tǒng)分析，初步探討了其作用機理，揭示了腦泰方起效的核心靶點、生物基因組表達及蛋白質(zhì)功能特質(zhì)，但是并未從中藥復方整體角度對抗腦缺血損傷有效性及組方合理性進行探討。本文通過對中藥復方腦泰方整體功效、有效組分和現(xiàn)代藥理研究的文獻調(diào)研，利用cytoscape進行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，剖析腦泰方各有效組分之間的關(guān)聯(lián)性及“君、臣、佐、使”配伍關(guān)系的合理性，探討其對“氣虛血瘀證”疾病網(wǎng)絡(luò)的干預效應，為后續(xù)進一步研究做鋪墊?；凇皬头?藥物-有效組分-信號通路-基因-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)分析其藥效及藥物的體內(nèi)動力學過程，對腦泰方有效組分、主要功效及體內(nèi)作用過程中主要靶點進行系統(tǒng)分析，將中藥傳統(tǒng)理論與現(xiàn)代醫(yī)藥信息技術(shù)研究相結(jié)合，為今后中藥復方研究和開發(fā)提供借鑒與參考。

1 中藥復方腦泰方的傳統(tǒng)功效及應用

腦泰方由黃芪、川芎、地龍、僵蠶四味藥物組成?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》云：“氣行則血行，氣滯則血凝”，方中黃芪性微溫，味甘，歸脾、肺經(jīng)，大補脾胃元氣，令氣旺則血活，血活則瘀除，以治其本為君藥；川芎味辛、溫，歸肝、膽、心包經(jīng)，活血行氣，氣行則血行，血中之氣藥為臣；地龍性寒，味咸，歸肝、脾、膀胱經(jīng)，善走竄，通經(jīng)活絡(luò)，周行全身，以行藥力；僵蠶性平，味咸、辛，歸肝、肺、胃經(jīng)，息風止痙化痰。地龍僵蠶均為佐藥，息風止痙，通絡(luò)有利氣、血運行。諸藥配合，協(xié)同作效，使氣虛得補，經(jīng)絡(luò)得通，補氣而不壅滯，共奏益氣活血、化痰通絡(luò)之效。臨床適用于氣虛血瘀型腦梗死之半身不遂、偏身麻木、眩暈耳鳴、舌紫苔膩、脈細滑等。

2 中藥復方腦泰方的現(xiàn)代研究

2.1 腦泰方單味藥的活性成分及生物活性

以黃芪、川芎、地龍、僵蠶、化學成分為中文檢索詞，以Astragalus、Ligusticum chuanxiong、Earthworm、Bombyx Batryticatus為英文檢索詞，在萬方數(shù)據(jù)知識服務平臺、PubMed、VIP、CNKI進行檢索，結(jié)合中國天然產(chǎn)物化學成分庫的數(shù)據(jù)，對獲得文獻數(shù)據(jù)[4-12]進行系統(tǒng)分析。基于腦泰方網(wǎng)絡(luò)藥理學研究分析，與腦梗死作用靶點相對接，篩選出4味藥物具有的生物活性（表1）。

表1 腦泰方中單味藥的生物活性成分

2.2 腦泰方的有效組分及現(xiàn)代藥理作用

2.2.1 腦泰方的有效組分

經(jīng)過對文獻調(diào)研的活性成分分析篩選，得到每味藥物的有效組分：黃芪中的黃芪多糖、黃芪皂苷、黃芪黃酮，川芎中的川芎嗪、阿魏酸，地龍中的蚓激酶、地龍多肽、琥珀酸、蚯蚓素、蚯蚓抗菌肽、蚯蚓解熱堿，僵蠶中的草酸銨、白僵菌素、槲皮素、山奈酚。根據(jù)對腦泰方藥理作用的研究可知，黃芪多糖、黃芪甲苷、川芎嗪、阿魏酸、蚓激酶、草酸銨、白僵菌素作用顯著。

2.2.2 腦泰方的現(xiàn)代藥理作用

經(jīng)過對腦泰方的現(xiàn)代藥理學研究進行文獻調(diào)研后發(fā)現(xiàn)，腦泰方對神經(jīng)系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)均有顯著的影響[13-42]，如表2所示。

表2 腦泰方的現(xiàn)代藥理作用研究

3 中藥復方腦泰方傳統(tǒng)功效與現(xiàn)代藥理的關(guān)聯(lián)性分析

3.1 腦泰方現(xiàn)代藥理與傳統(tǒng)功效的關(guān)聯(lián)

根據(jù)大量文獻調(diào)研[43-67]，結(jié)合氣虛與血瘀機制及蛋白質(zhì)組學研究分析，可發(fā)現(xiàn)具有益氣活血功效的藥物有效組分。腦泰方有效組分現(xiàn)代藥理與益氣活血傳統(tǒng)功效的關(guān)聯(lián)見表3。

表3 腦泰方有效組分現(xiàn)代藥理與益氣活血傳統(tǒng)功效的關(guān)聯(lián)

綜上，黃芪、川芎、地龍、僵蠶四味藥共同發(fā)揮益氣活血之效，四味藥物有效組分的藥效作用具有“共性”。黃芪甲苷、川芎嗪二者不僅共同上調(diào)BDNF、VEGF的表達，促進血管新生及神經(jīng)干細胞增殖，也共同調(diào)節(jié)血腦屏障緊密連接蛋白ZO-1的表達，改善血腦屏障通透性，下調(diào)NF-κB表達，減輕炎癥反應，同時均能調(diào)節(jié)抑制細胞內(nèi)鈣離子超載，抑制小膠質(zhì)細胞活化，減輕神經(jīng)功能損傷；黃芪多糖、黃芪甲苷、川芎嗪三者均能上調(diào)Bcl-2表達，下調(diào)Bax表達，減輕神經(jīng)元凋亡，下調(diào)IL-1β、TNF-α表達，減輕腦缺血后炎癥反應，保護神經(jīng)功能，同時三者共同降低MDA含量，提高GSH和SOD活性，清除氧自由基，縮小梗死面積，減輕腦組織損傷；黃芪甲苷、阿魏酸二者均能調(diào)節(jié)血腦屏障緊密連接蛋白ZO-1表達，上調(diào)occludin蛋白表達，抑制MMP-9、AQP4的表達進而保護血腦屏障的完整性；黃芪多糖、川芎嗪均可上調(diào)c-fos mRNA表達，下調(diào)P53、caspase-1表達，共同減輕神經(jīng)細胞凋亡；黃芪甲苷、蚓激酶均能調(diào)節(jié)JAK1/STAT1途徑實現(xiàn)對腦缺血的保護。這些成分通過上述機制共同發(fā)揮其對腦神經(jīng)元保護的藥理作用，增強神經(jīng)細胞抗氧化能力，減輕氧化應激損傷，提高神經(jīng)元細胞活力，保護神經(jīng)功能。與此同時，川芎嗪、蚓激酶均能增強cAMP活性，下調(diào)血小板胞漿內(nèi)的Ca2+濃度，降低全血粘度，改善血液流變性，進而改善微循環(huán)；黃芪甲苷、川芎嗪、蚓激酶均可下調(diào)ICAM-1含量，降低白細胞的黏附和浸潤，從而減輕炎癥反應，改善微循環(huán)障礙；川芎嗪、阿魏酸、蚓激酶二者均能調(diào)節(jié)TXA2-PGI2系統(tǒng)，抑制血小板聚集，防止血栓形成；黃芪多糖、阿魏酸、蚓激酶能降低TG、TC及LDL-C含量；蚓激酶、草酸銨能增強t-PA活性。這些組分通過各種方式協(xié)同發(fā)揮活血化瘀的輔助作用。

除各有效組分之間的“共性”，其有效組分在神經(jīng)保護方面還具有諸多“個性”成分。川芎嗪能增強Glu攝取，降低Glu興奮性毒性對神經(jīng)元的損傷，抑制HIF-1α和NOX2的蛋白表達，降低ROS水平，促進ERK1/2的蛋白磷酸化及降低p38的蛋白磷酸化，激活MAPK信號通路，上調(diào)體內(nèi)抗氧化酶HO-1水平；黃芪多糖可下調(diào)NLRP3、ASC表達；黃芪甲苷能促進腦缺血自噬水平，減少神經(jīng)元凋亡；阿魏酸能夠增加谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶和醌還原酶的活性；蚓激酶可抑制JNK1的磷酸化，抑制血小板Ps的表達水平的升高；草酸銨能夠抑制內(nèi)源性及外源性凝血系統(tǒng)。以上有效組分在“個性”中通過多種機制抗腦缺血后損傷，加強神經(jīng)元的保護作用，協(xié)同發(fā)揮益氣活血的藥理作用。

3.2 腦泰方有效組分配伍結(jié)構(gòu)的關(guān)聯(lián)性研究

“君、臣、佐、使”是中藥方劑組成的基本原則?！端貑枴ぶ琳嬉笳摗罚骸爸鞑≈^君，佐君之謂臣，應臣之謂使”[68]。腦泰方中黃芪為君藥，在腦泰方中發(fā)揮補氣功效，藥力居方中之首，川芎為臣藥，輔助君藥加強治療主病和主癥的藥物，方中具有活血行氣之效，為血中之氣藥，地龍、僵蠶為佐藥，用于治療次要兼證，具有化痰通絡(luò)之效。為剖析腦泰方中各有效成分是不是滿足“君、臣、佐、使”組方結(jié)構(gòu)，本研究使用Scifinder數(shù)據(jù)庫從每味藥物有效成分發(fā)揮功效的方面來進行分析。腦泰方的主要有效組分分別為黃芪多糖（Astragalus polysaccharides）、黃芪甲苷（Astragaloside）、川芎嗪（Ligustrazine）、阿魏酸（Ferulic acid）、蚓激酶（Lumbrokinase）、白僵菌素（Beauvericin），在Scifinder（http://scifinder.cas.org）網(wǎng)站上搜索各有效成分的英文名來查詢其作用靶點。進入該網(wǎng)站后，選擇Categorize選項，依次按照Genetics&protein chemistry、proteins&peptides的順序獲得蛋白質(zhì)及肽類的靶點信息。在收集信息的過程中，因阿魏酸文獻數(shù)量過于龐大，無法查詢其靶點數(shù)目，因此選取2015-2020年的文獻信息進行靶點收集及分析（表4）。

表4 腦泰方有效組分的配伍結(jié)構(gòu)及作用信號通路

圖1 腦泰方有效組分涉及的信號通路關(guān)聯(lián)

從收集的靶點信息進行信號通路的歸納總結(jié)分析可發(fā)現(xiàn)，這些有效組分均共同作用于JAK/STAT、PI3K/Akt和NF-κB信號通路，由此說明這三條通路可能是腦泰方發(fā)揮其益氣活血護腦功效的主要作用通路。綜合各單味藥物的影響作用、藥物含有量、作用靶點及相關(guān)信號通路4個方面的信息，可以發(fā)現(xiàn)黃芪在方中的劑量最多，其有效組分黃芪多糖和黃芪甲苷涉及的相關(guān)信號通路最多，是腦泰方中發(fā)揮補氣功效之先鋒，因而為君；川芎的有效組分川芎嗪、阿魏酸涉及的相關(guān)信號通路緊隨君藥黃芪之后，雖不及君藥，但其與作用靶點協(xié)同，強化君藥之效應，所以為臣；蚓激酶、白僵菌素在作用信號通路上較君藥、臣藥少，但二者與君藥、臣藥之間所關(guān)聯(lián)的信號通路有所重疊，與藥物劑量協(xié)同作效，故二者對君藥、臣藥有輔助作用，因此歸為佐藥。由此可見，從方中藥物影響效應、劑量含有量、作用靶點數(shù)目、相關(guān)作用通路的角度出發(fā)，是能夠解釋方中各味藥物之配伍及其各有效組分“君、臣、佐、使”的組方結(jié)構(gòu)。但是僅僅從單一角度分析是不足以得出肯定的結(jié)論，今后，隨著中醫(yī)現(xiàn)代化的不斷推進，未來將以多維的角度對組方結(jié)構(gòu)進行全面、系統(tǒng)地分析，以此更好地詮釋組方理論。

4 討論

辨證論治是中醫(yī)臨床診療的核心環(huán)節(jié)。腦梗死屬中醫(yī)學“中風”范疇，多因年老氣虛，無力推動血行，清陽不升，血行瘀滯，腦失所養(yǎng)，導致神機失用，動覺失司。《靈樞·刺節(jié)真邪》曰：“虛邪偏客于身半，其人深，內(nèi)居榮衛(wèi)，榮衛(wèi)稍衰．則真氣去，邪氣獨留，發(fā)為偏枯”，“營氣虛則不仁，衛(wèi)氣虛則不用”。指出了氣虛在中風發(fā)生過程中的重要作用。后代醫(yī)家王清任更為明確指出“元氣既虛，必不能達于血管，血虛元氣，必停留而瘀”，首創(chuàng)中風病氣虛血瘀病機理論，闡述氣虛、血瘀二者在中風發(fā)病機理中的關(guān)聯(lián)性?！皻馓撗觥笔悄X梗死主要病機特點，益氣活血是其治療的核心環(huán)節(jié)，即通過益氣以推動血液的運行,活血以加強氣血在全身的分布，進而促進大腦的血液循環(huán)。中藥復方腦泰方是治療腦梗死的有效方劑，該方以補為通(氣旺新血化生有源，氣行淤血化于脈中),以通助補(活血短而祛瘀通脈，久而化生新血載氣),益氣與活血交互作用、彼此協(xié)同。它能夠改善腦供血障礙，調(diào)節(jié)血液流變性，維持血栓素A2(TAX2)及前列環(huán)素(PGI2)的動態(tài)平衡，抑制腦缺血鐵死亡，抗氧化應激，減輕炎癥反應，保護血腦屏障，抗神經(jīng)細胞凋亡等，由此對腦缺血損傷具有神經(jīng)保護作用。

目前，運用現(xiàn)代化技術(shù)將中醫(yī)藥客觀化、微觀化，是中醫(yī)藥現(xiàn)代化的創(chuàng)新路徑。中醫(yī)藥學與現(xiàn)代醫(yī)學、分子生物學、計算機信息技術(shù)等多種學科體系相互融合、相互借鑒、相互發(fā)展，多學科交叉融合、中西醫(yī)協(xié)同發(fā)展成為中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展的重要趨勢。中藥復方在現(xiàn)代臨床運用廣泛，也取得較好的治療效果，在疾病治療方面有其獨特的優(yōu)勢和特色。然而，許多中藥復方發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及組方原理所知甚少，在某種程度上成為中藥復方在臨床上廣泛推廣的阻礙。中藥復方并不等同于幾味藥物或幾種化合物成分的簡單配比，而是一個綜合作用體系。目前中藥研究集中于單一的活性篩選體系，無法反應中藥的綜合藥理效應。中藥作為復方形式在臨床配伍應用，利用中藥復方中各有效組分的個體作用闡述中藥復方的整體作用，對有效組分君臣佐使進行系統(tǒng)歸類，揭示傳統(tǒng)中醫(yī)理論與現(xiàn)代藥理之間的關(guān)聯(lián)性，是中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展的重要路徑。

本文通過對中藥復方腦泰方中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論和現(xiàn)代藥理成分的文獻調(diào)研，利用現(xiàn)代生物信息技術(shù)將中醫(yī)傳統(tǒng)藥理論及現(xiàn)代藥理論相關(guān)聯(lián)，將各藥物有效組分影響的作用信號通路相溝通，對腦泰方在復方、有效組分、作用靶點3個層面進行深入挖掘分析。在傳統(tǒng)中醫(yī)方面，腦泰方遵循虛則補之的組方原則，具有益氣活血之功效，主治氣虛血瘀型腦梗死；在現(xiàn)代藥理方面，腦泰方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)為黃芪多糖、黃芪甲苷、川芎嗪、阿魏酸、蚓激酶、草酸銨和白僵菌素等。通過分析可知，腦泰方各有效組分之間存在“共性”，即共同發(fā)揮益氣護腦的主要功效，同時，各有效組分利用其“個性”發(fā)揮活血化瘀的輔助功效，“共性”結(jié)合“個性”，共同發(fā)揮其益氣活血之功效。

課題組前期網(wǎng)絡(luò)藥理學研究[69]發(fā)現(xiàn)，腦泰方有效組分的作用靶點、作用途徑均是多靶點多途徑協(xié)同起效，其作用機制與多條信號通路均有關(guān)聯(lián)，各信號通路既互相聯(lián)系，又互相獨立，形成復雜的協(xié)同效應，而這種治療作用恰恰吻合中醫(yī)藥治療疾病的整體觀。本文基于“復方-藥物-有效成分-信號通路-基因-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)分析腦泰方各成分間的相互作用，通過系統(tǒng)歸納總結(jié)腦泰方中藥物組成的中醫(yī)傳統(tǒng)理論和現(xiàn)代藥理成分，揭示了二者之間的關(guān)聯(lián)性和相通性。利用現(xiàn)代科學技術(shù)手段，分析腦泰方中的藥效物質(zhì)與機體生物分子之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，挖掘其內(nèi)在的綜合效應。以傳統(tǒng)中藥方劑學理論君臣佐使配伍為依托，分析各有效組分的功能和含有量，闡述腦泰方組方原則及對其有效組分進行君臣佐使的歸類,進而進一步揭示腦泰方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機理，闡明傳統(tǒng)配伍理論的科學內(nèi)涵及潛在規(guī)律，從而促進腦泰方中醫(yī)辨證微觀化及現(xiàn)代化臨床應用。此項研究也為今后中藥復方進行新藥研究及中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展提供借鑒與參考。