基于UPLC-Q-Orbitrap-MS整合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究藏藥大三果化學(xué)成分及作用機(jī)制＊

張秋楠，常子豪，葉 婷，梁林金，梁文儀，張?zhí)m珍

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京100102）

藏藥大三果（Triphala）由訶子Terminalia ChebulaRetz.，毛訶子Terminalia Billerica(Gaertn.)Roxb.與余甘子Phyllanthus emblicaL.的成熟果實(shí)按比例組成，以它們?yōu)橹魉幣湮闉槿麥?，三果湯等劑型，?jiǎn)稱(chēng)大三果[1-2]。1995年版藏藥部頒標(biāo)準(zhǔn)將其收載，具有清熱、調(diào)和氣血、化解壞血的功效[3]，臨床上多用于治療咽喉腫痛、咳嗽哮喘、消化不良、貧血、肝功能障礙和心血管疾病等，為藏藥眾多方劑的基礎(chǔ)方[4]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)大三果及其單味藥余甘子、訶子、毛訶子進(jìn)行了化學(xué)成分、藥理作用和臨床應(yīng)用方面的研究，結(jié)果表明大三果富含鞣質(zhì)、酚酸、皂苷、脂質(zhì)、萜類(lèi)化合物、黃酮類(lèi)、谷甾醇、強(qiáng)心苷和各種碳水化合物[5]，在抗疲勞、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗炎等方面均表現(xiàn)出一定的治療和預(yù)防保健作用[6-9]，但對(duì)其成分、靶點(diǎn)、疾病、通路之間的相互聯(lián)系還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究在鑒定大三果化學(xué)成分的基礎(chǔ)上，首次對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)藥理學(xué)的機(jī)制作用研究，為該藥的臨床合理用藥、質(zhì)量控制以及新藥研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)和有力保障[10]。

本研究采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UHPLC-Q-Orbitrap-MS）對(duì)大三果醇提取中主要化學(xué)成分進(jìn)行鑒定與表征分析。同時(shí)，利用生物信息學(xué)等方法構(gòu)建和分析多元生物網(wǎng)絡(luò)，以網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)為切入點(diǎn)進(jìn)一步探討其主要作用機(jī)制，為該藥的臨床合理用藥、質(zhì)量控制提供依據(jù)[10]。

1 材料

1.1 儀器與軟件

UPLC-Q-Orbitrap液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)：Ultimate 3000型超高效液相色譜儀（Dionex公司）串聯(lián)Thermo Q Exactive型高分辨質(zhì)譜（Thermo FisherScientific公司）；Xcalibar 3.0工作站（Thermo Fisher Scientific公司）；Compound Discovery 3.0化合物分析鑒定軟件（Thermo Fisher Scientific公司；https://www.thermofisher.com/）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；KQ 5200E型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Cytoscape 3.7.2軟 件（Cytoscape Consortium;https://cytoscape.org/）；R語(yǔ)言4.0.2程序包（The R Foundation;https://www.r-project.org/）；Chembiodraw Ultra 14.0軟件（PerkinElmer公司；https://www.chemdraw.com.cn/）等。

1.2 試劑

沒(méi)食子酸（批號(hào)MUST-17022801）、柯里拉京（批號(hào)MUST-17052603）、鞣花酸（批號(hào)MUST-17052603），以上對(duì)照品純度≥98%，均購(gòu)于成都曼斯特生物科技有限公司；沒(méi)食子酸甲酯（批號(hào)TN1127CA14，純度≥98%），購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；色譜級(jí)甲醇和乙酸購(gòu)于Fisher公司；純凈水購(gòu)于杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

余甘子、訶子和毛訶子藥材均購(gòu)于北京藏醫(yī)院（產(chǎn)地尼泊爾），經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定系劉春生教授鑒定，分別為大戟科植物余甘子Phyllanthus emblicaL.、使君子科植物訶子Terminalia chebulaRetz.及毛訶子Terminalia bellirica(Gaertn.）Rox.的干燥成熟果實(shí)。

2 方法

2.1 色譜和質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μm（2.1×100 mm,Column；Part No：186003539；Serial No：0246325825758）；保護(hù)柱：ACQUITY HSS T3 1.8 μm VANGUARD Pre-Col（Part No：186003976；Serial No：0210382710）；柱溫：30℃；流動(dòng)相：0.1%乙酸(A)-甲醇(B)；流速：0.3 mL·min-1；波長(zhǎng)：260 nm、270 nm；流動(dòng)相梯度如下：0-2 min，3% B；2-10 min，3-13% B；10-15 min，13-25% B；15-22 min，25-30% B；22-32 min，30-60%B；32-45 min，60-95%B；45-55 min，95%B。

2.1.2 質(zhì)譜條件

ESI：負(fù)離子模式；霧化氣流：1.5 L·min-1；離子源溫度：320℃；干燥氣壓力：100 kPa；質(zhì)量掃描范圍：m/z100-1500。毛細(xì)管溫度為350℃；鞘氣（氮）流量為30 arb；輔助氣體（氮?dú)猓┝髁繛?0 arb；源電壓為4.0 kV；毛細(xì)管電壓為-35 V；管透鏡電壓為-110 V。軌道阱質(zhì)量分析儀的分辨率設(shè)定為30000。隔離寬度為2 amu，歸一化碰撞能量（CE）設(shè)定為35%。碰撞誘導(dǎo)解離（CID）在LTQ中進(jìn)行，活化q為0.25，活化時(shí)間為30 ms。

2.2 大三果醇提物供試品和對(duì)照品溶液制備

精密稱(chēng)取余甘子、訶子以及毛訶子藥材粉末（過(guò)50目篩）各100 mg置于100 mL錐形瓶中，加入50%甲醇60 mL，稱(chēng)重，100 MHz超聲60 min，補(bǔ)足原重量，過(guò)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取上清液，即得供試品溶液。

分別精密稱(chēng)取沒(méi)食子酸、柯里拉京和沒(méi)食子酸甲酯對(duì)照品2.5 mg置于容量瓶中，用甲醇溶解后定容配制成0.5 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。稱(chēng)取鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品2.5 mg于5 mL容量瓶中，加入少量DMSO溶解后甲醇定容，配制成0.5 mg·mL-1的鞣花酸對(duì)照品溶液。分別取1 mL各對(duì)照品溶液，配制成的0.125 mg·mL-1混合對(duì)照品溶液，混勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取上清液，即得混合對(duì)照品溶液。

2.3 化合物鑒定解析

進(jìn)樣后，根據(jù)高分辨質(zhì)譜提供的準(zhǔn)分子離子等信息推測(cè)并得到一級(jí)質(zhì)譜的精確相對(duì)分子質(zhì)量，經(jīng)Xcalibar 3.0軟件進(jìn)行峰提取、峰匹配等處理并與Compound Discovery 3.0軟件匹配，依據(jù)對(duì)照品、參考文獻(xiàn)、Mass Bank數(shù)據(jù)庫(kù)（https://massbank.eu/MassBank/）提供的相對(duì)保留時(shí)間及碎片離子信息進(jìn)一步確認(rèn)定性化學(xué)成分[11]。

2.4 活性成分篩選

采用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMSP）[12]（http://lsp.nwu.edu.cn/index.php）分析平臺(tái)，檢索液質(zhì)鑒定出的化合物。以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，化合物類(lèi)藥性（drug-like，DL）≥0.18為指標(biāo)，篩選得到大三果中的活性成分[13]。

2.5 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（http://lsp.nwu.edu.cn/index.php）和Swiss Target Prediction平 臺(tái)（http://www.swisstargetprediction.ch/）搜索活性成分靶點(diǎn)，采用UniProt[14]數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.uniprot.org/）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，建立化合物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。再將化合物及相應(yīng)基因?qū)隒ytoscape軟件[15]，構(gòu)建活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（Component-Target network，C-T network）。

2.6 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選出的潛在靶點(diǎn)全部導(dǎo)入STRING網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)（https://string-db.org/），設(shè)置蛋白種類(lèi)為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設(shè)為高等置信度0.9“high confidence”，隱藏沒(méi)有相互作用的蛋白，進(jìn)行蛋白相互作用分析[16]。采用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化分析，采用CytoHubba插件采取最大集團(tuán)中心性（Maximal clique centrality，MCC）的拓?fù)渌惴êY選核心基因（hub gene）。

2.7 GO功能富集分析與KEGG信號(hào)通路富集分析

采用人類(lèi)基因組注釋數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID6.8[17]（http://david.ncifcrf.gov/）對(duì)大三果醇提取的全部潛在靶點(diǎn)進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）信號(hào)通路富集分析和基因本體論（Gene ontology,GO）功能富集分析，以P<0.01進(jìn)行篩選，研究藥物靶點(diǎn)主要信號(hào)通路。

3 結(jié)果與分析

3.1 大三果醇提物化學(xué)成分分析

因大三果成分主要為酚酸和鞣質(zhì)類(lèi)化合物，提取液呈酸性，因此選用負(fù)離子模式進(jìn)行分析，得到總離子流圖，綜合表征出了85個(gè)化合物，包括酚酸類(lèi)、簡(jiǎn)單沒(méi)食子酰酯類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)（分為沒(méi)食子鞣質(zhì)、逆沒(méi)食子鞣質(zhì)）、脂肪酸類(lèi)、黃酮類(lèi)、萜類(lèi)及其他，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 大三果醇提取中化學(xué)成分UPLC-Q-Orbitrap-MS鑒定

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

此類(lèi)化合物共鑒定出8個(gè)，含有較多的酚羥基和羧基，在裂解時(shí)易失去H2O、CO、CO2及CH2等基團(tuán)[18]。Ellagic acid（化合物73，鞣花酸）的保留時(shí)間是29.74 min，分子離子峰為m/z300.999 0[M-H]-，經(jīng)碰撞解離，失去一個(gè)中性碎片CO（28 u）產(chǎn)生碎片m/z273.004 0[M-H-CO]-，再失去一個(gè)CO（28 u）產(chǎn)生碎片m/z245.009 1[M-H-2CO]-；失去一個(gè)中性碎片CO（244 u）產(chǎn)生碎片m/z257.009 3[M-H-CO2]-，再失去一個(gè)CO（28 u）產(chǎn)生碎片m/z229.014 3[M-H-CO2-CO]-；失去一個(gè)中性碎片H2O（18 u）產(chǎn)生碎片離子m/z283.996 5[M-H-H2O]-，推測(cè)分子式為C14H6O8[19]。

3.1.2 簡(jiǎn)單沒(méi)食子酰酯類(lèi)化合物分析

此類(lèi)化合物共鑒定出16個(gè)，主要含有沒(méi)食子?；诹呀鈺r(shí)易失去沒(méi)食子?；╣alloyl，152 u）而產(chǎn)生特征碎片。Ethyl gallate（化合物54，沒(méi)食子酸乙酯）的保留時(shí)間是20.10 min，分子離子峰為m/z197.045 6[M-H]-，經(jīng)碰撞解離，失去一個(gè)2CH2（48 u）產(chǎn)生碎片m/z169.014 3[M-H-2CH2]-，再失去一個(gè)CO2（44 u）產(chǎn)生碎片m/z125.024 4[M-H-C2H4-CO2]-，推測(cè)分子式為C9H10O5[20]。

3.1.3 沒(méi)食子鞣質(zhì)類(lèi)化合物分析

此類(lèi)化合物共鑒定出5個(gè)，水解后能生成沒(méi)食子酸和糖或多元醇，多為一取代或多取代的沒(méi)食子糖苷，因取代的位置不同具有多個(gè)同分異構(gòu)體，在裂解時(shí)易失去一系列沒(méi)食子?；╣alloyl，152 u）。Tetra?galloylglucose（化合物58）的保留時(shí)間是23.53 min，分子離子峰為m/z787.100 5[M-H]-，經(jīng)碰撞解離，可接連丟失沒(méi)食子?；鵪alloyl（152 u）產(chǎn)生碎片m/z635.091 5[M-H-galloyl]-和碎片m/z331.056 9[MH-3galloyl]-；丟失一個(gè)沒(méi)食子酸（170 u）產(chǎn)生碎片m/z617.078 8[M-H-gallic]-，再丟失一個(gè)沒(méi)食子酸（170 u）產(chǎn)生碎片m/z447.057 3[M-H-2gallic]-，再丟失一個(gè)沒(méi)食子?；鵪alloyl（152 u）產(chǎn)生碎片m/z465.068 0[M-H-gallic-galloyl]-，推測(cè)分子式為C34H28O22[21]。

3.1.4 逆沒(méi)食子鞣質(zhì)類(lèi)化合物分析

所使用的日降水量數(shù)據(jù)來(lái)源于2001—2016年臨安國(guó)家基本站觀測(cè)數(shù)據(jù),以20時(shí)為日界,日降水量≥50 mm為一個(gè)暴雨雨日。本文中的季節(jié)劃分方式如下:春季為3—5月,夏季為6—8月,秋季為9—11月,冬季為12月—次年2月。

此類(lèi)化合物共鑒定出23個(gè)，由六羥基聯(lián)苯二酸或與其生源關(guān)系的酚羧酸與葡萄糖形成酯，水解后可產(chǎn)生逆沒(méi)食子酸（鞣花酸），主要分為鞣花鞣酸鞣質(zhì)類(lèi)成分和訶子次酸鞣質(zhì)類(lèi)成分。

鞣花鞣質(zhì)類(lèi)化合物的特征碎片是m/z301，這是由于結(jié)構(gòu)中含有六羥基二苯甲?；℉HDP），其在負(fù)離子模式下失去1個(gè)H產(chǎn)生的[22]。Punicalagin A（化合物22）和Punicalagin B（化合物30）的保留時(shí)間分別為10.67 min和13.85 min，分子離子峰為m/z1083.059 5[M-H]-，失去一個(gè)鞣花酸單元HHDP（302 u）產(chǎn)生碎片離子m/z781.053 6[M-H-ellagic acid]-，繼續(xù)失去一個(gè)葡萄糖（180 u）產(chǎn)生碎片離子m/z600.990 1[M-H-ellagic acid-glu]-，結(jié)合特征碎片離子m/z300.998 8，推測(cè)其分子式為C48H28O30，化合物22和30被推測(cè)為Punicalagin。反相色譜中，Punicalagin A比Punicalagin B先出峰，因此化合物22被推測(cè)為Punicalagin A，化合物30被推測(cè)為Punicalagin B[23]。

訶子次酸鞣質(zhì)類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)中含有HHDP存在生源關(guān)系的訶子酰基（chebuloyl，Che）。由訶子次鞣質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單元訶子次酸（Chebulic acid）分子內(nèi)失去一個(gè)H2O、CO2基團(tuán)產(chǎn)生碎片m/z337[Chebulic acid-H-H2O]-、m/z293[Chebulic acid-H-H2O-CO2]-是訶子次鞣質(zhì)類(lèi)化合物的特征碎片。Chebulanin（化合物49，訶子寧）的保留時(shí)間是19.19 min，分子離子峰為m/z651.083 8[M-H]-，經(jīng)碰撞解離，可丟失一個(gè)沒(méi)食子酸（170 u）產(chǎn)生碎片m/z481.063 7[M-H-gallic]-；可丟失一個(gè)沒(méi)食子?；鵪alloyl（152 u）產(chǎn)生碎片m/z499.070 3[M-H-galloyl]-；可丟失一個(gè)沒(méi)食子酰葡萄糖galloylglusoce（332 u）產(chǎn)生碎片m/z319.009 1[MH-galloyglusoce]-，再丟失CO（244 u）產(chǎn)生碎片m/z275.019 7[M-H-galloyglusoce-CO2]-和碎片m/z231.029 8[M-H-galloyglusoce-2CO2]-，再丟失一個(gè)CO（28 u）產(chǎn)生碎片m/z203.035 1[M-H-galloyglusoce-2CO2-CO]-，推測(cè)分子式為C27H24O19[24]。

3.1.5 黃酮類(lèi)化合物分析

此類(lèi)化合物共鑒定出12個(gè)。Rutin（化合物69，蘆?。┑谋Ａ魰r(shí)間是29.11 min，分子離子峰為m/z609.146 7[M-H]-，經(jīng)碰撞解離，可丟失一個(gè)蕓香糖（308 u）形成碎片m/z301.033 4[M-H–C12H20O9]-，再丟失一個(gè)H（1 u）產(chǎn)生碎片m/z300.027 6[M-2HC12H20O9]-，或失去一個(gè)中性碎片H2CO（30 u）產(chǎn)生碎片m/z271.02 4[M-H-C12H20O9-H2CO]-。碎片m/z301.033 4通過(guò)RDA裂解形成碎片m/z151.003 6特征碎片離子，推測(cè)分子式為C27H30O16[25]。

3.1.6 萜類(lèi)化合物分析

此類(lèi)化合物共鑒定出4個(gè)。Arjungenin（化合物85，阿江欖仁素）的保留時(shí)間是37.22 min，分子離子峰為m/z503.338 6[M-H]-，經(jīng)碰撞解離，可丟失一個(gè)H2O（18 u）基團(tuán)產(chǎn)生碎片m/z485.328 6[M-H-H2O]-,再丟失一個(gè)COOH（45 u）和CH2OH（31 u）基團(tuán)產(chǎn)生碎片m/z409.312 0[M-H-H2O-COOH-CH2OH]-；可丟失兩個(gè)CH（315 u）基團(tuán)產(chǎn)生碎片m/z473.327 6[MH-2CH3]-，推測(cè)分子式為C30H48O6[26]。

3.1.7 其他化合物分析

此他類(lèi)化合物共鑒定出的17個(gè)。Mucic acid（化合物1，粘酸）的保留時(shí)間為0.96 min，分子離子峰為m/z209.030 0[M-H]-，經(jīng)碰撞解離，可失去一個(gè)H2O（18 u）基團(tuán)產(chǎn)生碎片離子m/z191.020 0[M-H2O-H]-，也可失去一個(gè)CO（244 u）基團(tuán)產(chǎn)生碎片離子m/z147.030 0[M-CO2-H]-，推測(cè)分子式為C30H48O61[27]。

3.2 大三果醇提物網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

3.2.1 大三果醇提物活性成分和靶點(diǎn)篩選分析

根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)ADME過(guò)篩標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出12個(gè)符合條件的潛在活性成分，具體信息見(jiàn)表2。

表2 根據(jù)ADME篩選的12個(gè)成分

采用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和Swiss Target Prediction平臺(tái)搜索以上12個(gè)化合物的相關(guān)靶點(diǎn)，得到303個(gè)靶點(diǎn)。

3.2.2 主要活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

構(gòu)建大三果化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）。該網(wǎng)絡(luò)由315個(gè)節(jié)點(diǎn)（12個(gè)藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表大三果的活性成分，303個(gè)橙色節(jié)點(diǎn)代表相關(guān)靶點(diǎn)）與797條邊（代表化學(xué)成分與靶點(diǎn)的相互作用）組成，節(jié)點(diǎn)的大小表示Degree值的大小，節(jié)點(diǎn)越大對(duì)應(yīng)得Degree值越大。其中，Quercetin（Degree=231）、Kaempferol（Degree=155）、Luteolin（Degree=148）、Morin（Degree=116）、Ellagic acid（Degree=81）、Digallate（Degree=20）、3,6-Digalloylglucose（Degree=18）、Taxifolin（Degree=14）、Mucic acid 1,4-lactone 5-O-gallate（Degree=9）、(+)-Catechin（Degree=9）、Phyllanemblinin A（De?gree=8）和Chebulic acid（Degree=5）。每個(gè)潛在活性成分均能作用于多個(gè)靶點(diǎn)，體現(xiàn)了大三果的多成分、多靶點(diǎn)作用。

圖1 大三果化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

3.2.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與hub基因篩選

將303個(gè)藥物相關(guān)靶點(diǎn)構(gòu)建蛋白相互作用關(guān)系繪制PPI網(wǎng)絡(luò)（圖2）。該網(wǎng)絡(luò)由258個(gè)節(jié)點(diǎn)和1276條相互作用連線(xiàn)構(gòu)成關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，節(jié)點(diǎn)的大小表示Degree值的大小，節(jié)點(diǎn)越大對(duì)應(yīng)得Degree值越大。MCC算法計(jì)算前10個(gè)關(guān)鍵基因（CXCL8，APP，CHRM2，CXCL2，CXCL10，ADCY2，CXCR1，CXCL11，PTGER3，ADO?RA1），提示這些關(guān)鍵基因在大三果藥理機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用（圖3）。

圖2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）分析

圖3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵基因（hub）基因篩選

3.2.4 GO生物過(guò)程富集分析

將303個(gè)藥物相關(guān)靶點(diǎn)通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO生物過(guò)程富集分析（P<0.01），共得到524條生物過(guò)程。結(jié)果顯示，生物過(guò)程（Molecular function，MF）共富集得到386條，主要涉及對(duì)藥物的反應(yīng)、細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)控、蛋白的自磷酸化與磷酸化和細(xì)胞增殖的正調(diào)控；細(xì)胞組分（Cellular components，CC）共富集得到48條，主要涉及胞漿、細(xì)胞外間隙、質(zhì)膜、胞外體和核漿；分子生物（Biological process，BP）共富集得到90條，主要涉及酶結(jié)合、碳酸鹽脫水酶活性、蛋白激酶活性與結(jié)合和與蛋白質(zhì)結(jié)合（圖4）。

圖4 生物學(xué)過(guò)程（GO）富集分析

3.2.5 KEGG信號(hào)通路富集結(jié)果

將303個(gè)藥物相關(guān)靶點(diǎn)通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG生物過(guò)程富集分析（P<0.01），共得到103條信號(hào)通路，進(jìn)一步篩選出前20條，分別為癌癥相關(guān)途徑，乙型肝炎，膀胱癌，前列腺癌，胰腺癌，非小細(xì)胞肺癌，膠質(zhì)瘤，HIF-1信號(hào)通路，PI3K-Akt信號(hào)通路，慢性粒細(xì)胞白血病，TNF信號(hào)通路，小細(xì)胞肺癌，F(xiàn)oxO信號(hào)通路，黑色素瘤，氮代謝，癌癥中的蛋白多糖，p53信號(hào)通路，ErbB信號(hào)通路和孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟通路（圖5）。由此可見(jiàn)，在藥物成分對(duì)應(yīng)的靶基因下，富集的信號(hào)通路主要集中在對(duì)炎癥、癌癥、免疫等方面，其與大三果的清熱、調(diào)和氣血、化解壞血的主要功效高度吻合，表明了本研究的科學(xué)性和合理性。

圖5 KEGG信號(hào)通路富集

4 討論

大三果最初記錄在阿育吠陀文本《Charaka Samhita》中，并已被用于各種疾病數(shù)千年[28]。在隋唐時(shí)期經(jīng)印度傳入我國(guó)，最早見(jiàn)于藏醫(yī)藥《四部醫(yī)典》，主治瘟疫、紊亂熱癥、新舊熱癥、促使熱癥成型[29]。至唐朝，大三果的單味藥訶子、毛訶子和余甘子均被錄入我國(guó)首部古藥典《唐·新修本草》[30]。在藏醫(yī)臨床中，用藥多以成方制劑或不同藏藥制劑進(jìn)行配伍使用，而在藥品標(biāo)準(zhǔn)所收載的藏藥制劑中，毛訶子與余甘子、訶子所組成的藏藥大三果約占19%[4]。大三果具有清熱、祛濕、調(diào)和氣血的功效，并常與其他清熱溫中、活血行氣的藥物配伍使用，用以治療熱性、疼痛性或血液性疾病[31]。近年來(lái)科學(xué)研究驗(yàn)證了其自由基清除，抗氧化，抗炎，抗菌以及潛在抗腫瘤的作用[32]。目前，大三果體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)以及臨床研究證明可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞信號(hào)通路，包 括ERK、MAPK、NF-κB、Akt、c-Myc、VEGFR、mTOR、p53、cyclin D1，促凋亡和抗凋亡蛋白等[33]，但物質(zhì)基礎(chǔ)、作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制仍然不清楚。因此本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為切入點(diǎn)，探討大三果的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)以及主要作用靶點(diǎn)與機(jī)制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整合系統(tǒng)生物學(xué)、生物信息學(xué)等新興的交叉學(xué)科，從“疾病-基因-靶標(biāo)-藥物”生物網(wǎng)絡(luò)的角度全面分析，進(jìn)而闡述藥物與機(jī)體的功能關(guān)系[34]。這與中醫(yī)“整體觀”、“辨證論治”的概念理論和中藥及其復(fù)方多成分、多通路、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的原理相一致。數(shù)據(jù)庫(kù)是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的前提和基礎(chǔ)，此外，通過(guò)組學(xué)技術(shù)或中藥化學(xué)成分分析等實(shí)驗(yàn)方法獲得的數(shù)據(jù)也是生物網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)的重要來(lái)源，具有真實(shí)性和可靠性等優(yōu)點(diǎn)，廣泛地應(yīng)用在中醫(yī)藥現(xiàn)代化的研究。

本實(shí)驗(yàn)中大三果三個(gè)單味藥的配比采用印度傳統(tǒng)醫(yī)藥1:1:1比例進(jìn)行分析，為了更大程度提取主要成分，根據(jù)主要化合物極性采用70%乙醇提取樣品，定性了85個(gè)化學(xué)成分，主要成分是鞣質(zhì)類(lèi)化合物和黃酮化合物。進(jìn)一步得到12個(gè)活性成分進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，其中，Chebulic acid（訶子次酸、Ellagic acid（鞣花酸）和Morin（桑色素）主要具有抗炎作用；Taxifolin（花旗松素）具有抗炎與保護(hù)心血管作用；Quercetin（槲皮素）、Kaempferol（山奈酚）和Luteolin（木犀草素）具有抗炎與免疫調(diào)節(jié)作用；(+)-Catechin（(+)-兒茶素）同時(shí)具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)和保護(hù)心血管的作用。Chebulic acid（訶子次酸）具有抗氧化活性和對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的保護(hù)作用[35]，可以通過(guò)改善晚期糖基化產(chǎn)物誘導(dǎo)的炎癥和氧化應(yīng)激，增強(qiáng)ERK/Nrf2的解毒防御通路，減輕了血管功能障礙[36]。Quercetin（槲皮素）可抑制白血病細(xì)胞生長(zhǎng)而不抑制正常的造血功能[37]，還可通過(guò)Nrf2/HO-1通路抑制H2O2誘導(dǎo)人肝細(xì)胞LO2凋亡和損傷[38]。(+)-Catechin（兒茶素）可減少氧化應(yīng)激物的產(chǎn)生，預(yù)防血管炎性和血栓生成[39]，此外，還可抑制多種癌癥細(xì)胞[30]。這些成分之間相互配合、相互作用共同發(fā)揮大三果“清熱、調(diào)和氣血、化解壞血”的功效，為快速確定大三果藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。

首先，12個(gè)活性成分作用于303個(gè)靶點(diǎn)，依據(jù)PPI分析得到的前10位核心靶點(diǎn)中，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵靶點(diǎn)主要?dú)w屬于炎癥因子（CXCL8、CXCL2、CXCL10、CXCL11），免疫相關(guān)靶點(diǎn)（CXCR1、ADORA1），心血管相關(guān)靶點(diǎn)（CHRM2，PTGER3），膜受體靶點(diǎn)（ADCY2）等。其中，CXCL8、CXCL2、CXCL10、CXCL11是炎癥細(xì)胞因子家族中的趨化因子，主要參與免疫反應(yīng)、造血功能和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，對(duì)炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生了重要作用[40-41]。CXCR1和ADORA1都可以通過(guò)提高免疫活性來(lái)發(fā)揮對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用[42]。PTGER3主要參與了水鹽代謝、血壓的調(diào)節(jié)以及誘發(fā)發(fā)熱、痛覺(jué)、炎癥等機(jī)體活動(dòng)[43]。CHRM2是調(diào)節(jié)心臟活動(dòng)的主要受體，其失衡與心臟結(jié)構(gòu)和功能的病理改變有關(guān)[44]。ADCY2是一種膜相關(guān)酶，催化環(huán)腺苷單磷酸的形成，有研究表明該基因是肝細(xì)胞癌5年生存期有關(guān)的關(guān)鍵基因[45]。由此可見(jiàn)，大三果的治療作用主要是通過(guò)以上基因發(fā)揮抗炎、抗癌、免疫調(diào)節(jié)的功能實(shí)現(xiàn)的。

KEGG富集分析顯示，信號(hào)通路主要包括與癌癥有關(guān)的PI3K-Akt信號(hào)通路，TNF信號(hào)通路和p53信號(hào)通路和HIF-1信號(hào)通路。PI3K/Akt信號(hào)通路作為細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要紐帶，影響著腫瘤細(xì)胞的增殖分化、代謝、凋亡、血管生成等，有研究表明該通路中的PI3K和AKT基因在肝癌、結(jié)腸癌、胃癌及乳腺癌等惡性腫瘤中常常出現(xiàn)基因突變或基因增殖[46-48]。據(jù)報(bào)道，Akt下游有40多個(gè)靶點(diǎn)，其中p53是迄今發(fā)現(xiàn)與人類(lèi)腫瘤相關(guān)性最高的抑癌基因，超過(guò)50%的癌癥伴有p53基因的突變[49]。突變型p53將降低細(xì)胞對(duì)有絲分裂、細(xì)胞周期、糖酵解、核酸和脂質(zhì)合成的嚴(yán)格控制,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[50]。目前有研究表明，大三果在SKOV-3、HeLa和HEC-1B細(xì)胞，異種斑馬魚(yú)移植模型和胰腺癌Capan-2異種移植模型中，都可以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，減少Akt和p53的過(guò)表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了大三果通過(guò)抑制PI3K-Akt和p53信號(hào)通路發(fā)揮其抗腫瘤的作用[51-53]。此外，PI3K/Akt細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子激活后，將啟動(dòng)和調(diào)控下游細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)如TNF-α的基因轉(zhuǎn)錄[54]，引起或加重炎癥。TNF-α作為T(mén)NF信號(hào)通路重要細(xì)胞因子，在參與細(xì)胞增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡的同時(shí)，還參與機(jī)體免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)，是許多癌癥治療的有效靶點(diǎn)[55]。HIF-1信號(hào)通路也是與癌癥相關(guān)的重要信號(hào)通路。HIF-1由α和β兩個(gè)亞基組成，參與腫瘤糖酵解、血管生成、增殖與凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移、微環(huán)境pH調(diào)節(jié)[56]。在實(shí)體腫瘤早期階段，瘤內(nèi)細(xì)胞的缺氧環(huán)境可導(dǎo)致HIF-1α在腫瘤組織和外周血中的表達(dá)呈上升趨勢(shì)[57]。

此外，KEGG富集結(jié)果顯示，大三果還涉及膀胱癌，前列腺癌，非小細(xì)胞肺癌，膠質(zhì)瘤，慢性粒細(xì)胞白血病，小細(xì)胞肺癌，黑色素瘤，氮代謝，癌癥中的蛋白多糖，孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟等信號(hào)通路。這些網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果說(shuō)明大三果可以通過(guò)這些信號(hào)通路對(duì)特定疾病具有靶向作用，對(duì)研究開(kāi)發(fā)大三果新的適應(yīng)證具有指導(dǎo)意義。

綜上所述，大三果在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究下不斷展現(xiàn)出其廣泛的臨床方面的應(yīng)用潛力。本研究首次采用UHPLC-Q-Orbitrap-MS技術(shù)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合的方法，對(duì)大三果醇提取的化學(xué)表征、作用靶點(diǎn)及其信號(hào)通路進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)大三果主要通過(guò)抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)與血壓調(diào)節(jié)等作用，其作用機(jī)制可能與CXCL8、CXCL2、CXCL10、CXCL11、CXCR1、ADORA1、CHRM2、PTGER3、ADCY2、PI3K/AKT信號(hào)通路，TNF信號(hào)通路和p53信號(hào)通路有關(guān)，為大三果的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。