基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接方法探討黃山藥干預(yù)冠心病的作用機(jī)制研究＊

但文超，劉紅旭，何慶勇，婁 妍2，，蔣燕君2，，連妍潔2，＊＊

（1.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院 北京100053；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 北京100029；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院 北京100010；）

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心?。┦怯蓜用}粥樣硬化（atherosclerosis，AS）引起管腔狹窄，導(dǎo)致心肌缺血、缺氧或壞死，又稱缺血性心臟病，是最常見的心血管疾病之一。隨著社會人口年齡結(jié)構(gòu)分布的改變，冠心病發(fā)病率逐年攀升，根據(jù)《中國心血管病報(bào)告2018》概要[1]，估算我國心血管病現(xiàn)患人數(shù)2.9億，其中冠心病患者數(shù)量高達(dá)1100萬，居各類心臟病之首。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）評估報(bào)告表明[2]，截止2030年全球?qū)⒂?3.3億人左右死于冠心病。心血管疾病，尤其是缺血性心臟病，仍然是世界范圍內(nèi)主要的死亡原因和長期發(fā)病率的重要原因[3]?？梢?，世界人群的冠心病患病率已成重大公共衛(wèi)生問題。

黃山藥為我國特有的薯蕷科薯蕷屬植物，是國家級（五類）新藥地奧心血康軟膠囊（成都地奧制藥集團(tuán)有限公司，批號0603024，DAXXK）的主要藥源。地奧心血康具有活血化瘀、行氣止痛、宜痹通陽等功效，有關(guān)臨床研究顯示地奧心血康可緩解患者心肌缺血癥狀，并改善心臟血流動力學(xué)指標(biāo)[4-7]，部分基礎(chǔ)研究亦顯示地奧心血康具有抗氧化損傷、抑制細(xì)胞凋亡、降低炎性因子的表達(dá)[8-10]，延長凝血酶原時(shí)間和抑制纖維蛋白[11]的作用。有Meta分析結(jié)果顯示，地奧心血康膠治療冠心病心絞痛，在單用或與常規(guī)藥物聯(lián)合運(yùn)用的情況下，在提高總療效、改善心電圖方面具有更大的優(yōu)勢，且藥物安全性較好[12]。研究表明[13]黃山藥含有多種甾體皂苷類物質(zhì)及活性多糖等有效成分，具有改善心血管功能、抗血小板聚集、降血脂等多種藥理作用，但目前對于黃山藥干預(yù)冠心病的藥理學(xué)作用機(jī)制的研究相對匱乏。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是運(yùn)用高通量篩選、網(wǎng)絡(luò)可視化及分析技術(shù)揭示藥物、靶點(diǎn)、疾病之間復(fù)雜的生物網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，分析、預(yù)測藥物的藥理學(xué)機(jī)制的研究方法[14]。李梢教授等[15]利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從生物網(wǎng)絡(luò)調(diào)控角度對中藥方劑現(xiàn)代研究的方證關(guān)系、病證關(guān)系和方劑的多靶點(diǎn)作用等問題進(jìn)行了探索并取得了有意義的結(jié)果。分子對接是預(yù)測蛋白與配體親和能力和結(jié)合模式的強(qiáng)有力的工具，對于給定的蛋白質(zhì)和配體（蛋白質(zhì)、DNA/RNA、小分子），可通過預(yù)測它們的結(jié)合模式及結(jié)合自由能，進(jìn)而對其功能及作用機(jī)制進(jìn)行研究?；诜肿訉臃椒ǖ奶摂M篩選已成為針對特定靶蛋白藥物研發(fā)的必備流程之一[16]。

為更好地了解黃山藥干預(yù)冠心病的作用機(jī)制，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接的方法，在分子的水平上，從化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)和信號傳導(dǎo)通路對黃山藥干預(yù)冠心病的作用機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究，以期為進(jìn)一步揭示黃山藥的藥理作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，研究流程圖見圖1。

圖1 研究流程圖

1 材料與方法

1.1 黃山藥相關(guān)成分及靶點(diǎn)篩選

通 過ETCM（The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine）數(shù)據(jù)庫[17]（http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/）并結(jié)合查閱文獻(xiàn)對黃山藥的化學(xué)成分信息進(jìn)行收集，將收集的化學(xué)成分逐一通過Pubchem數(shù)據(jù)庫[18]獲得成分的分子結(jié)構(gòu)圖并以3Dsdf的格式存儲。將所獲取化合物結(jié)構(gòu)輸入SwissADME平臺[19]（http://www.swissadme.ch/）。設(shè)置潛在核心化合物的標(biāo)準(zhǔn)為：①腸胃吸收（gatrointestinal absortion;GIabsortion）為“High”，表明成分具備良好口服生物利用度，可被吸收②設(shè)置5類藥性預(yù)測（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）結(jié) 果 中 有2個(gè) 及2個(gè) 以 上 為“Yes”。其后通過文獻(xiàn)核查根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)所排除的化合物，若化合物藥理作用明顯且與研究主題相關(guān)，仍予以納入，最終獲得研究主題相關(guān)的潛在化合物。再利用基于藥效團(tuán)匹配法的PharmMapper數(shù)據(jù)庫[20]（http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/index.php）獲取潛在化合物的靶點(diǎn)，選擇Normalized Fit Score（NF）≥0.9的靶點(diǎn)蛋白，并根據(jù)已發(fā)表的藥物相關(guān)成分文獻(xiàn)報(bào)道，補(bǔ)充未預(yù)測到的活性化合物的已知靶點(diǎn)。

1.2 冠心病相關(guān)靶點(diǎn)篩選

為保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性與全面性，以“coronary heart disease”、“coronary disease”“coronary atherosclerotic heart disease”“CHD”等冠心病相關(guān)名詞為關(guān)鍵詞，搜索GeneCards數(shù) 據(jù) 庫[21]（https://www.genecards.org）、DisGeNet數(shù) 據(jù) 庫[22]（http://www.disgenet.org/home/）、OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man）數(shù)據(jù)庫[23]（http://www.omim.org）、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫[24]（https://www.drugbank.ca/）以獲得冠心病核心靶點(diǎn)。其中DRUGBANK數(shù)據(jù)庫基于臨床試驗(yàn)藥物證據(jù)構(gòu)建而成，提供了豐富的藥物數(shù)據(jù)與全面的藥物靶標(biāo)信息。OMIM、GeneCards、DisGeNet數(shù)據(jù)庫基于文獻(xiàn)構(gòu)建，各個(gè)數(shù)據(jù)庫之間各有優(yōu)勢、相互補(bǔ)充。將上述數(shù)據(jù)庫所獲取的靶點(diǎn)，刪除重復(fù)值后進(jìn)行合并。再根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)充未預(yù)測到的活性成分的已知靶點(diǎn)。使用UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫[25]（https://www.uniprot.org）將疾病靶點(diǎn)與藥物成分的潛在靶點(diǎn)統(tǒng)一規(guī)范為Gene Symbol，其后將兩者進(jìn)行映射，以獲得黃山藥潛在干預(yù)冠心病的靶點(diǎn)。

1.3 黃山藥成分-冠心病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI）是指從生物化學(xué)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和遺傳網(wǎng)絡(luò)的角度研究化合物和疾病相關(guān)蛋白質(zhì)分子之間的相關(guān)性。為闡明靶點(diǎn)蛋白在系統(tǒng)水平上的作用，將上述靶點(diǎn)上傳至STRING11.0數(shù)據(jù)庫[26]（https://string-db.org），選擇物種為“智人”，設(shè)置靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)的置信度為0.40，以獲得PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，并通過CytoScape3.7.2軟件[27]制作PPI網(wǎng)絡(luò)圖。利用CytoScape3.7.2中的MCODE插件[28]對蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系進(jìn)行分析，得到潛在蛋白質(zhì)功能模塊并分析相關(guān)功能。

1.4 黃山藥成分與冠心病靶點(diǎn)GO功能富集和KEGG通路富集

1.5 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將“1.4”項(xiàng)下的交集靶點(diǎn)與KEGG富集出生物通路的相互作用信息與“1.2”項(xiàng)下篩選出的藥物成分與交集靶點(diǎn)合并，上傳到Cytoscape3.7.2中構(gòu)建出藥物成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。利用CytoScape3.7.2內(nèi)置的Network Analyzer分析有效成分及靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，包括連接度（Degree）、介度（Betweenness）及緊密度（Closenesss）等，并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)判斷核心靶點(diǎn)及干預(yù)冠心病的主要活性成分。

1.6 分子對接評估

選擇分析得到黃山藥成分-冠心病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中度值排名為前6的靶點(diǎn)。通過RCSB數(shù)據(jù)庫[30]（htp://www.rcsb.org/pdb）下載靶點(diǎn)蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)，并以pdb格式進(jìn)行保存。將候選化合物的3D化學(xué)結(jié)構(gòu)通 過Open Babel3.1.1[31]（http://openbabel.org/wiki/Main_Page）轉(zhuǎn)換為pdb格式文件。采用Autodock Tools1.5.6[32]（http://autodock.scripps.edu/resources/tools）進(jìn)行除水、加氫，計(jì)算Gasteiger電荷，儲存為pdbqt格式文件。對潛在核心成分配體進(jìn)行能量最小化處理，賦予配體原子類型、計(jì)算電荷，儲存為pdbqt格式。利用MOE2019[33]進(jìn)行分子對接操作，以對接評分Affinity來篩選結(jié)合活性較好的活性成分與靶點(diǎn)，其中對接評分Affinity<-4.25 kcal·mol-1可認(rèn)為配體與靶點(diǎn)之間具有結(jié)合活性，得分<-5.0表明結(jié)合活性較佳，得分<-7.0 kcal·mol-1兩者之間有強(qiáng)烈的對接活性[34]。

2 結(jié)果

2.1 黃山藥的主要活性成分靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果

綜合查閱文獻(xiàn)[35-39]，包括2015年版《中華人民共和國藥典》（第十版）、高效液相色譜法研究、綜述進(jìn)展等共獲得黃山藥相關(guān)的30種化合物結(jié)構(gòu)，其有效成分主要為甾體皂苷類物質(zhì)，包括偽原薯蕷皂苷、薯蕷皂苷元、異螺甾烷醇類皂苷、呋甾烷醇類及其他類皂苷等成分，還包括少數(shù)非甾體皂苷成分，如棕櫚酸。通過SwissADME篩選出11種活性最高的成分，結(jié)構(gòu)見表1。利用PharmMapper預(yù)測并選擇NF≥0.9的靶點(diǎn)，去除所有重復(fù)基因后共計(jì)139個(gè)預(yù)測靶點(diǎn)。

表1 黃山藥11種活性最高的成分

續(xù)表

2.2 黃山藥干預(yù)冠心病相關(guān)靶點(diǎn)獲取

在Genecards數(shù)據(jù)庫中得到冠心病相關(guān)作用靶點(diǎn)6810個(gè)，選擇相關(guān)度得分Score≥20.48的靶點(diǎn)作為冠心病的潛在靶點(diǎn)，獲得1703個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)。結(jié)合DisGeNet、OMIM、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫補(bǔ)充相關(guān)靶點(diǎn)，除重后合并，最終得到1975個(gè)冠心病相關(guān)靶點(diǎn)。將黃山藥有效成分的139個(gè)靶點(diǎn)與1975個(gè)冠心病相關(guān)靶點(diǎn)取交集，獲得62個(gè)共同靶點(diǎn)，并通過R3.6.1繪制VENN圖（圖2）。

圖2 藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)VENN圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將62個(gè)交集靶點(diǎn)上傳至String11.0數(shù)據(jù)庫，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)信息并利用Cytoscape 3.7.2重新構(gòu)建靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)（圖3）。得到PPI網(wǎng)絡(luò)后，運(yùn)用CytoScape3.7.2中的MCODE插件，對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行進(jìn)一步分析，得到潛 在Module（圖4），推 測MPK1、MPK8、MPK14、PIK3R1等為主要靶點(diǎn)。根據(jù)P值，分別保留PPI網(wǎng)絡(luò)與Module中3個(gè)最佳評分的生物學(xué)進(jìn)程并描述其功能（表2）。

圖3 黃山藥-冠心病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 黃山藥-冠心病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)中的Module

表2 黃山藥-冠心病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)功能描述

2.4 GO功能富集和KEGG通路富集

利用Bioconductor中ClsuterProfiler程序包對黃山藥干預(yù)冠心病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行生物信息分析（圖5）。圖7-A表明黃山藥干預(yù)冠心病主要涉及生物學(xué)過程的對類固醇激素的反應(yīng)（response to steroid hormone）、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)（regulation of inflammatory response）、對營養(yǎng)水平的反應(yīng)（response to nutrient levels）。圖7-D為KEGG通路分析結(jié)果，圖中顯示了黃山藥干預(yù)冠心病排名前20的信號通路，關(guān)鍵通路包括絲裂原活化蛋白激酶信號通路（MAPK signaling pathway）、雌激素信號通路（Estrogen signaling pathway）、Ras信號通路（Ras signaling pathway）、PI3K-Akt信 號 通 路（PI3K-Akt signaling pathway）等。

圖5 黃山藥主要成分潛在靶點(diǎn)的富集分析

2.5 黃山藥成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

運(yùn)用CytoScape3.7.2構(gòu)建“黃山藥成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，并通過其內(nèi)置工具分析黃山藥干預(yù)冠心病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，得到核心成分及核心作用靶點(diǎn)。如圖6所示，此網(wǎng)絡(luò)由62個(gè)節(jié)點(diǎn)和215條邊構(gòu)成，紅色節(jié)點(diǎn)代表潛在靶點(diǎn)，橙色節(jié)點(diǎn)代表黃山藥中的活性成分，綠色節(jié)點(diǎn)代表潛在信號通路，連線代表三者之間的相互作用，圖中節(jié)點(diǎn)面積越大、顏色越深表明其對冠心病的影響越大。

圖6 黃山藥干預(yù)冠心病成分-靶點(diǎn)-通路圖

Cytoscape網(wǎng)絡(luò)分析中，每種活性成分對應(yīng)多個(gè)靶點(diǎn)，每個(gè)靶點(diǎn)連接多種成分，體現(xiàn)了黃山藥內(nèi)含的多種成分，可能通過多靶點(diǎn)干預(yù)冠心病。其中HSY-3（新甾體皂苷）度值為15，介度為0.127，緊密度為0.480，預(yù)測新甾體皂苷為黃山藥干預(yù)冠心病的主要成分，其次為HSY-8（胡蘿卜苷）（連接度為14，介度為0.107，緊密度為0.473），HSY-5（progeninⅢ）（連接度為8，介度為0.0446，緊密度為0.414）（表3）。MAPK1、MAPK10、MAPK8、MAP2K1、PIK3R1靶點(diǎn)基因的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度排位靠前，連接度分別為22、16、15、15、14，預(yù)測促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）家族為黃山藥干預(yù)冠心病的核心靶點(diǎn)，PIK3R1、EGFR、RAC1、PRKACA、IGF1亦為相對重要的靶點(diǎn)（表4）。由表5可知，通路與通路之間是通過共有靶點(diǎn)連接而非獨(dú)立分開的，表明黃山藥可通過各條通路之間可發(fā)揮協(xié)同作用起到干預(yù)冠心病的作用。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以表示，數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以[例(%)]表示，數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 黃山藥主要活性成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

表4 黃山藥主要活性成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

表5 黃山藥干預(yù)冠心病靶點(diǎn)通路富集結(jié)果

2.6 分子對接篩選

將11種核心澘在化合物與6個(gè)核心靶點(diǎn)ALB（PDBID:6RQ7）、EGFR（PDBID:5GTY）、MAPK1（PDBID:1PME）、SRC（PDBID:4U5J）、IGF1（PDBID:3LVP）、CASP3（PDBID:1NMS）進(jìn)行分子對接，最終得到60組受體-配體對接結(jié)果。在60組受體-配體結(jié)果中，其 中Affinity<-5 kcal·mol-1的 組 合 共 有59組，Affinity<-7 kcal·mol-1的 有30組，占50%。在 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的組合有15個(gè)，平均值為-7.641 kcal·mol-1，其中對接得分最高的為：EGFR-新甾體皂苷（3β,26-二醇-25(R)-?5,20(22)-二烯-呋甾-26-O-β-D-吡喃葡萄糖苷），分值為-8.728kcal·mol-1，對接得分最低的為ALB-panthogenin-B，分值為-6.551 kcal·mol-1，這表明所篩選的的潛在核心化合物與核心靶點(diǎn)之間可能具有較好的結(jié)合活性。網(wǎng)外45個(gè)組合排名前三的 組 合 有：daucosterol-ALB（-9.356 kcal·mol-1），trillin-EGFR（-9.051 kcal·mol-1），daucosterol-EGFR（-8.937 kcal·mol-1）。網(wǎng)外組合平均值為-7.080 kcal·mol-1，分值均小于-4.25 kcal·mol-1，提示均有良好的對接活性。對接結(jié)果可為今后進(jìn)一步開展相關(guān)中藥及成分的實(shí)驗(yàn)篩選設(shè)計(jì)提供數(shù)據(jù)支撐，分子對接結(jié)果見圖7，部分核心化合物對接模式見圖8。

圖7 分子對接結(jié)果

圖8 黃山藥部分核心化合物分子對接模式

3 討論

祖國醫(yī)學(xué)中雖無冠心病的病名，但古代醫(yī)籍中早有其典型臨床表現(xiàn)的記載，當(dāng)屬于“胸痹”、“心痛”、“真心痛”的范疇，《素問》云：“心痹者，脈不通”。中醫(yī)認(rèn)為氣滯、血瘀、痰濁、寒凝，以及氣血陰陽的不足為主要致病因素，進(jìn)而導(dǎo)致心脈痹阻而發(fā)病，病變于心，屬本虛標(biāo)實(shí)之證，活血化瘀法是治療冠心病的重要法則[40-42]?，F(xiàn)代臨床研究表明[43]冠心病患者存在血液流變性異常，血流動力學(xué)改變，微循環(huán)障礙等病理改變，其主要病理學(xué)基礎(chǔ)為動脈粥樣硬化和血脂代謝異常。黃山藥性溫，味微辛，可通過擴(kuò)張冠狀動脈血管，減小血液黏稠度以及血小板的聚集率來改善血循環(huán)[44]，研究顯示，以黃山藥為主要藥源的地奧心血康具活血化瘀、行氣止痛、擴(kuò)張冠脈血管和改善心肌缺血等功效，廣泛運(yùn)用于臨床干預(yù)心血管疾病。

3.1 潛在有效成分分析

地奧心血康主要成分為薯蕷皂苷元（diosgenin）和偽原薯蕷皂苷（pseudoprotodioscin）[45]。薯蕷皂苷元是一種重要的甾體皂苷元，廣泛存在于薯蕷科等多種植物中，楊柏等人研究發(fā)現(xiàn)[46]薯蕷皂苷元可抑制PARP/p53和p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）表達(dá)而減輕冠心病模型豬的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。馬海英等[47]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)薯蕷皂苷元在體外有明顯的抗血小板聚集活性。薯蕷皂苷元的分子結(jié)構(gòu)與雌激素類似，亦有基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)[48]表明其能夠顯著上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子A（VEGF-A），這種作用是經(jīng)由雌激素受體相關(guān)的PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)的。此外，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步篩選出黃山藥干預(yù)冠心病的主要活性成分尚有新甾體皂苷（3β,26-二醇-25(R)-?5,20(22)-二烯-呋甾-26-O-β-D-吡 喃 葡 萄 糖 苷）、胡 蘿 卜 苷(daucosterol)、延齡草苷（trillin）、panthogenin-A等。AS是導(dǎo)致冠心病主要危險(xiǎn)因素，炎癥反應(yīng)是AS形成中的一個(gè)重要因素[49]，故降低炎癥反應(yīng)的作用更有利于減少AS形成，并起到保護(hù)心血管的作用。胡蘿卜苷是一種廣泛存在于植物中的植物甾醇糖苷，HUNG等[50]在研究胡蘿卜苷的藥理作用時(shí)，證實(shí)胡蘿卜苷可抑制MAPK、JNK等相關(guān)炎癥反應(yīng)信號通路的活化。阿司匹林作為冠心病的一級預(yù)防藥物[51]，具有抗血小板聚集的作用，可顯著減少主要心血管事件。KOO等[52]發(fā)現(xiàn)胡蘿卜苷抗2-5 μg·L-1膠原誘導(dǎo)的血小板聚集作用約為阿司匹林的2倍，證明胡蘿卜苷有良好的抗血小板聚集作用。NO可通過促使氧化應(yīng)激損傷、能量代謝障礙、炎癥反應(yīng)發(fā)展發(fā)生等加重心肌損傷。延齡草苷具有明顯的抗高脂血癥和抗氧化作用[53]，有研究發(fā)現(xiàn)[54]其能抑制NO的釋放，同時(shí)減少誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，降低TNF-α、IL-6、COX-2 mRNA等炎性基因的表達(dá)，并可通過上調(diào)Sirt1的表達(dá)、下調(diào)NF-Kβ和TNF-α的表達(dá)，從而提高抗氧化能力，降低炎癥因子損傷[55]。除此之外，存在一些尚未被報(bào)道的有效成分亦可能為黃山藥干預(yù)冠心病的主要有效成分，如3β,26-二醇-25(R)-?5,20(22)-二烯-呋甾-26-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、panthogenin-A等，預(yù)測這些有效成分的功效將成為未來研究黃山藥干預(yù)冠心病的潛在方向，其藥效學(xué)及作用機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

分子對接結(jié)果顯示，黃山藥中的核心化合物胡蘿卜苷、延齡草苷、新甾體皂苷、progeninⅢ等與主要靶點(diǎn)（ALB、EGFR、SRC、MAPK1）的結(jié)合活性較強(qiáng)，這在側(cè)面反映了網(wǎng)絡(luò)預(yù)測結(jié)果的可靠性。故今后在設(shè)計(jì)相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)或臨床研究時(shí)可重點(diǎn)關(guān)注胡蘿卜苷、延齡草苷、新甾體皂苷等在干預(yù)冠心病相關(guān)機(jī)制中的作用。

3.2 靶點(diǎn)分析

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)成分篩選、靶點(diǎn)預(yù)測和網(wǎng)絡(luò)分析，可發(fā)現(xiàn)占據(jù)網(wǎng)絡(luò)中心位置的主要為白蛋白（ALB）、表皮生長因子受體（EGFR）、有絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs），包 括MAPK1、MAPK2、MAPK8、MAPK10等，這些靶點(diǎn)在黃山藥干預(yù)冠心病的生物過程中可能起關(guān)鍵作用。既往研究表明[56]ALB減低可能是冠心病事件風(fēng)險(xiǎn)和短期死亡率增加的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。ALB有抑制血小板活化和聚集，減少血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用，在血小板誘導(dǎo)冠心病的發(fā)展過程中起到調(diào)節(jié)作用[57]，與冠心病嚴(yán)重程度的指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)[58]；EGFR分布于所有血管上皮細(xì)胞，可通過參與RAS/RAF/MEK/MAPK，PI3K/PDK1/AKT兩條主要途徑發(fā)揮干預(yù)細(xì)胞生長、分化、增殖等作用，EGFR與配體（EGF）特異性結(jié)合后可促進(jìn)心血管系統(tǒng)中ROS的形成并有助于血管收縮，李偉新等[59]研究發(fā)現(xiàn)EGFR可能是肥胖相關(guān)心血管疾病的治療靶點(diǎn)，與心肌炎癥、纖維化、凋亡和功能障礙相關(guān)；MAPKs屬于酪氨酸激酶系統(tǒng)，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下可被激活[60]。MAPK1作為炎癥常用通路中的一員為重要的炎癥評價(jià)指標(biāo)，與炎癥的嚴(yán)重程度有密切關(guān)系[61]，可參與冠心病的炎性反應(yīng)，還可影響冠心病的脂代謝和凝血功能[62]。MAPK8是MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途經(jīng)中重要的信號分子，當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)促進(jìn)炎癥因子TNF-α、IL-1β的活化[63]。

3.3 生物富集分析

通過GO功能富集分析可知，生物學(xué)進(jìn)程包括對類固醇激素的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)、對營養(yǎng)水平的反應(yīng)等，主要涉及內(nèi)肽酶活性、類固醇激素受體活性、類固醇結(jié)合等方面的功能，通過KEGG富集分析可推斷，黃山藥干預(yù)冠心病的信號通路主要與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)相關(guān)，例如MAPK信號通路、雌激素信號通路、Ras信號通路、PI3K/Akt信號通路等。

全身炎癥是CHD的一個(gè)重要病理生理因素。在KEGG富集分析中，MAPK信號通路是富集基因最多的信號通路且與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，因此推測MAPK通路可能是通過抗炎干預(yù)冠心病的關(guān)鍵通路。MAPK信號通路可介導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生各種反應(yīng)，Logatkina等[64]發(fā)現(xiàn)MAPK信號通路成分的增加可導(dǎo)致冠心病患者全血細(xì)胞持續(xù)炎癥激活。在MAPK信號通路中JUNK/p38MAPK通路是控制炎癥反應(yīng)最主要的MAPK家族成員之一，與細(xì)胞炎癥、凋亡、生長有關(guān)，其中p38MAPK與多種病理過程如心肌病變、心臟缺血/再灌注、動脈硬化的發(fā)生等相關(guān)[65]，激活p38MAPK信號通路可使血管平滑肌細(xì)胞從中膜進(jìn)入內(nèi)膜并發(fā)生增殖，促進(jìn)AS的發(fā)生和發(fā)展[66]。周茜等[67]研究表明通過促進(jìn)MAPK通路中ERK的活化、減少促凋亡通路中JNK和p38MAPK的激活，可減輕心肌纖維化，從而保護(hù)心肌靶器官。

基礎(chǔ)研究顯示[68-71]雌激素可通過調(diào)節(jié)凝血功能、抗炎作用及動員血管內(nèi)皮細(xì)胞，并促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血損傷后修復(fù)來實(shí)現(xiàn)保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，以達(dá)到防止AS，保護(hù)心血管系統(tǒng)的作用。王宇等[72]研究顯示雌激素主要通過與其受體結(jié)合后激活包括PKB/Akt、ERK1/2、p38-MAPK在內(nèi)的信號通路，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，保護(hù)心血管系統(tǒng)，從而防止As的發(fā)生。因此推測雌激素信號通路為黃山藥發(fā)揮抗炎、保護(hù)血管的一條潛在通路。

PI3K/Akt是調(diào)節(jié)心臟功能相關(guān)的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡、血管再生、促進(jìn)細(xì)胞能量代謝等影響冠心病的發(fā)生和發(fā)展[73-75]。Ravingerova等[76]通過大鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號通路的級聯(lián)反應(yīng)對大鼠心臟具有保護(hù)機(jī)制。PI3K/Akt信號通路還可以使糖原合酶激酶-3（glycogensynthase，GSK-3）磷酸化，降低GSK-3的活性，增加心肌對葡萄糖的攝取和脂代謝能力，從而保護(hù)心臟[77]。在Ras信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，Ras蛋白作為分子開關(guān)參與信息傳遞可激活下游信息傳遞途徑如MARK信號途徑、PI3K/Akt信號通路、GalGEF信號通路等，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、凋亡、增殖和分化。由此可以推測Ras信號通路、PI3K/Akt信號通路等在黃山藥干預(yù)冠心病過程中亦發(fā)揮重要作用。

綜上所述，已有相關(guān)報(bào)道的和冠心病相關(guān)的生物通路主要與炎癥、免疫反應(yīng)相關(guān)，提示黃山藥可能通過MAPK信號通路、雌激素信號通路、Ras信號通路、PI3K/Akt信號通路干預(yù)冠心病。

4 結(jié)語

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接的研究方法，通過靶點(diǎn)預(yù)測、蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)、GO富集分析和KEGG通路富集分析，提示黃山藥主要活性成分胡蘿卜苷、延齡草苷、新甾體皂苷等，可能通過ALB、EGFR、SRC、MAPKs等靶點(diǎn)，作用于MAPK、雌激素、Ras、PI3K/Akt等信號通路干預(yù)冠心病。需要注意的是，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是依據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫和已有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)的建模，由于原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、圖譜信息來源于不同的實(shí)驗(yàn)條件，故實(shí)驗(yàn)存在一定的假陽性率和假陰性率[78]。本文基于理論層面對黃山藥干預(yù)冠心病的作用機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測分析，預(yù)測分析結(jié)果與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不盡相同，希望本分析結(jié)果可為下一步深入研究提供新的思路，也期待更為豐富的研究結(jié)果。后續(xù)研究團(tuán)隊(duì)將持續(xù)關(guān)注黃山藥藥理研究進(jìn)展，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行動物或細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，以深入探討黃山藥干預(yù)冠心病的靶點(diǎn)及機(jī)制。