基于網(wǎng)絡藥理學探討大補脾湯治療肝癌的作用機制＊

駱亞莉，安方玉，顏春魯，馮彩琴，劉永琦，李研，王碧雯

（1.甘肅中醫(yī)藥大學甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉(zhuǎn)化重點實驗室蘭州730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學敦煌醫(yī)學與轉(zhuǎn)化教育部重點實驗室蘭州730000；3.甘肅中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院蘭州730000）

在我國與癌癥相關死亡的常見原因中，肝癌在男性排列第2位（15.2%），在女性排列第五位（8.9%）[1,2]，目前臨床療效有限，且進展迅速，因此亟待開發(fā)有效治療肝癌的藥物。中醫(yī)藥以其多靶點起效、毒副反應小在治療惡性腫瘤方面已經(jīng)顯現(xiàn)出獨特優(yōu)勢。

大補脾湯源自敦煌卷子《輔行訣臟腑用藥法要》，在敦煌出土醫(yī)方著作中較為完整，為治療脾氣虛弱兼陰液亦損證所設。記載主要成分為人參、甘草、干姜、白術(shù)、麥門冬、五味子、旋覆花[3]。人參、麥門冬、五味子益氣養(yǎng)陰斂汗，旋覆花降逆止嘔，白術(shù)、甘草合用補氣健脾調(diào)中，干姜鼓動脾胃陽氣以助運化。大補脾湯已運用于脾胃疾病的臨床治療并顯示出良好的效果[4-5]，但目前未見治療肝癌的報道。中醫(yī)認為，脾虛是肝癌發(fā)生發(fā)展的重要因素[6]，通過調(diào)養(yǎng)脾胃而長養(yǎng)肝木之臟，扶正助肝脾生養(yǎng)發(fā)陳以祛除毒邪，達到治療肝癌的功效[7-9]。長期以來，運用中藥干預治療肝癌的實驗研究工作不少，但是以“一個基因、一個藥物、一個疾病”為主導范式的傳統(tǒng)藥物研發(fā)模式存在明顯不足。作者前期預實驗發(fā)現(xiàn)大補脾湯對于治療荷瘤小鼠肝癌具有一定療效，但作用機制還有待探索。網(wǎng)絡藥理學基于“疾病-基因-靶標-藥物”相互作用網(wǎng)絡，系統(tǒng)觀察藥物對疾病網(wǎng)絡的干預與影響，可有效預測藥物的功效或特定功效對應的藥物[10-11]。本研究首次利用網(wǎng)絡藥理學方法對大補脾湯治療肝癌的可能靶點進行預測分析，為進一步開展大補脾湯的作用機理及抗癌候選藥物的研發(fā)提供思路。

1 研究方法

1.1 大補脾湯化學成分的整理和篩選

《輔行訣臟腑用藥法要》記載大補脾湯的主要成分為人參、甘草、干姜、白術(shù)、麥門冬、五味子、旋覆花[3]。通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫和中國臺灣中醫(yī)藥資料庫（http://tcm.cmu.edu.tw/zh-tw/）對大補脾湯的化學成分進行搜集與整理。

1.2 大補脾湯主要成分的靶點預測

1.2.1 Lipinski規(guī)則、類藥性、口服生物利用度篩選

Lipinski規(guī)則（Lipinski rule，LR）是藥物分子設計和藥物篩選的常用規(guī)則之一，可以比較準確地預測藥物中化合物的吸收或滲透性能，有助于篩選出有效藥物成分，降低藥物開發(fā)成本[12]。LR規(guī)則包括：①分子量不超過500 Da（MWT≤500）；②氫鍵供體的成分不超過5個（H-bond donors≤5）；③氫鍵受體不超過10個（H-bond acceptors≤10）；④脂水分配系數(shù)不超過5（CLogP≤5）。違背了這些規(guī)則中的2條以上，便有90%以上的把握預測這些化合物的口服吸收差，根據(jù)LR規(guī)則對數(shù)據(jù)庫分析出的大補脾湯化學成分進行篩選。根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫的建議及綜合文獻考慮[13]，選擇類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%為篩選條件。

1.2.2 治療靶點預測

應用瑞士靶點預測數(shù)據(jù)庫Swiss Target Prediction（http://www.Swisstarget prediction.ch/），根據(jù)化合物2D and 3D相似性方法查找1.2.1篩選所得的大補脾湯活性成分的相關靶點[14]，Organism選擇Homo Sapiens，整理以上各化合物對應的靶點，入選預測概率≥0.5的分子作為可能的靶點。同時，應用治療靶標數(shù)據(jù)庫（Therapeutic Target Database，TTD）（https://db.idrblab.org/ttd/），將1.2.1篩選所得的大補脾湯活性成分分別錄入“Search for Drugs”中進行檢索，查找以上化合物對應的靶點。將Swiss Target Prediction和TTD預測的靶點結(jié)果進行合并，去除重復，建立大補脾湯治療作用靶點數(shù)據(jù)庫。

1.3 大補脾湯治療肝癌靶點的搜集

應用Liverome數(shù)據(jù)庫（http://liverome.kobic.re.kr/）和肝癌數(shù)據(jù)庫OncoDB.HCC（http://oncodb.hcc.ibms.sinica.edu.tw/）搜索目前已經(jīng)研究報道的肝癌的治療靶點。收集標準為OncoDB.HCC數(shù)據(jù)庫實驗驗證的基因。建立肝癌靶點數(shù)據(jù)庫。利用韋恩圖分析軟件VENNY2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）將預測的大補脾湯治療作用靶點與肝癌靶點進行合并，取其交集，建立大補脾湯治療肝癌的預測靶點庫。

1.4 大補脾湯治療肝癌預測靶點的生物過程與通路的富集分析

應用David數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）對輸入基因進行生物過程和通路的富集分析。對上述交集基因進行GO分析，分別從生物過程、細胞組分、分子功能三個方面進行分析。對作用靶點進行GO注釋分析及KEGG通路分析。并按照每個條目涉及的靶點數(shù)目進行排序，篩選排名靠前的生物過程和通路，采用GraphPad Prism分析軟件（Version 7.0）軟件對結(jié)果進行可視化[15]。

1.5 大補脾湯治療肝癌作用靶點蛋白的功能歸屬分析

為進一步探索上述大補脾湯治療肝癌作用靶點（交集基因）之間的相互關系，利用String數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/，Version 11.0）和Cytoscape分 析 軟 件（Version 3.6.1）建立上述交集基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡。將大補脾湯治療肝癌的預測靶點導入String數(shù)據(jù)庫，應用Multiple proteins工具，限定物種為“人”，建立蛋白互作關系并以TSV格式保存文件。將文件信息導入Cytoscape軟件，形成蛋白互作網(wǎng)絡。

1.6 “活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡構(gòu)建與分析

歸納整理大補脾湯的活性成分與其對應的作用靶點，建立藥物成分與作用靶點的對應關系。將大補脾湯的活性成分、治療肝癌靶點和代謝通路數(shù)據(jù)導入Cytoscape3.6.1軟件。采用Merge工具構(gòu)建大補脾湯“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡模型。根據(jù)各成分對應通路及相應degree值篩選大補脾湯治療肝癌的主要藥效成分及作用靶點和重要通路。

2 研究結(jié)果

2.1 大補脾湯活性成分的篩選

大補脾湯共有810個化合物。其中，甘草含化合物數(shù)量最多，麥冬含化合物數(shù)最少。分析810個化合物，滿足LR規(guī)則的化合物在甘草中數(shù)量最多，麥冬中數(shù)量最少；滿足OB≥30%和DL≥0.18規(guī)則的化合物在甘草中數(shù)量最多，干姜中數(shù)量最少。

同時滿足LR、OB和DL全部規(guī)則的化合物，即大補脾湯潛在的活性成分共有118個。其中，甘草中數(shù)量最多達82個，占甘草全部化合物的30%；其次為旋覆花（12個，27%）和人參（10個，5%），而五味子（6個）、白術(shù)（5個）、干姜（2個）和麥冬（1個）均較少，結(jié)果見表1。

表1 大補脾湯活性成分分布及預測結(jié)果

2.2 大補脾湯活性化合物的靶點預測

按照上述篩選所得大補脾湯118個活性成分，利用Swiss數(shù)據(jù)庫進一步預測其作用靶點，結(jié)果顯示，共找到68個成分，對應5505個作用靶點，預測概率≥0.5的靶點共112個。同時，利用TTD數(shù)據(jù)庫預測結(jié)果顯示，干姜、白術(shù)、麥冬和五味子中無對應的成分及作用靶點。人參有1個成分，對應9個作用靶點；甘草有7個成分，對應13個作用靶點；旋覆花有3個成分，對應4個作用靶點。去除重復，共找到11個成分，作用靶點為16個。

合并Swiss數(shù)據(jù)庫與TTD數(shù)據(jù)庫預測結(jié)果，去除重復的8個靶點，得到大補脾湯作用靶點共120個。

2.3 肝癌基因靶點庫建立

利用Onco數(shù)據(jù)庫搜集肝癌基因靶點為394個，利用Liver數(shù)據(jù)庫搜集肝癌基因靶點為241個。合并兩數(shù)據(jù)庫搜集結(jié)果，去除重復的58個靶點，得到肝癌基因靶點共576個。

2.4 大補脾湯治療肝癌潛在靶點篩選

將上述預測的大補脾湯作用靶點120個與肝癌基因靶點576個進行合并，取交集后，得到大補脾湯治療肝癌的可能靶點共29個。包括：ABCB1、ABCG2、AKR1B10、AKR1C2、AKR1C3、ALDH2、AR、ARG1、CA1、CA2、CA3、EGFR、ESR1、IL2、MCL1、MET、MMP12、MMP2、MMP3、MMP9、NEK6、PARP1、PLK1、PTGS2、PTK2、SRC、TERT、TOP2A和TTR（圖1、表2）。

圖1 大補脾湯治療肝癌的潛在靶點

2.5 靶點基因功能注釋

運用David軟件中Functional Annotation Tool工具，對29個靶點基因進行功能注釋（表2）。

表2 大補脾湯治療肝癌的潛在靶點

2.6 靶點基因GO富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果

運用David軟件對29個靶點基因進行GO富集分析，分別從生物過程、細胞組分、分子功能三個方面進行分析。其中，生物過程中排名靠前的有內(nèi)在凋亡信號通路的負調(diào)控、一氧化碳代謝過程、表皮生長因子受體信號通路、肽-酪氨酸自動磷酸化、整合素介導的信號通路等（圖2a）。在細胞組成分析中靠前的主要是細胞外基質(zhì)、細胞膜的胞質(zhì)側(cè)外部成分（圖2b）。分子功能分析靠前的主要是碳酸氫酶活性、鋅離子結(jié)合、金屬異位酶活性、ATP結(jié)合、非膜生成蛋白酪氨酸激酶活性等（圖2c）。

圖2 靶點基因GO富集分析

KEGG通路分析比較靠前的是：癌癥中的微小RNA、雌激素信號通路、膀胱癌、癌癥中的蛋白聚糖、氮代謝、癌癥相關通路、膽汁分泌、黏附連接、GNRH信號通路、TNF信號通路等（圖3）。

圖3 靶點基因KEGG通路富集分析

2.7 大補脾湯治療肝癌潛在靶點對應的藥物成分

將上述大補脾湯治療肝癌靶點與對應的藥物成分進行歸納，表3結(jié)果顯示共計65個化合物，其中屬于甘草的化合物最多（30個）、屬于人參的化合物次之（21個）和旋覆花最少（14個）。甘草的化合物對應的作用靶點最多（24個），人參次之（21個），而旋覆花最少（11個），共計56個，去除重復即大補脾湯治療肝癌的可能靶點共29個。具體的藥物成分與對應靶點見表4。其中，作用于靶點ABCB1、ABCG2和CA2的中藥成分最多；而人參中的山奈酚（kaempferol）、甘草中的槲皮素（quercetin）和旋覆花中的木犀草素（luteolin）可針對多靶點發(fā)揮治療作用。

表3 大補脾湯治療肝癌的藥物成分及對應靶點數(shù)量

表4 大補脾湯藥物成分-治療肝癌潛在靶點對應關系

2.8 大補脾湯治療肝癌潛在靶點的蛋白相互作用

在此相互作用網(wǎng)絡中，共有節(jié)點29個，102條邊。平均節(jié)點度數(shù)為7.03，平均局部聚類系數(shù)0.654，PPI富集P值<1.0e-16（圖4）。

圖4 靶點基因相互作用網(wǎng)絡（string）

對29個基因的相互作用進行分析，基因TTR、CA3、AKR1B10以及ALDH2與其它基因的相互作用較弱。在其余25個互作基因當中，利用Cytoscape軟件中的cytoHubba插件按照degree將前十名關鍵基因進行篩選分別是：EGFR、SRC、PTGS2、MMP9、MMP2、MCL1、MET、AR、ESR1和IL2（圖5）。

圖5 靶點基因相互作用（Cytoscape）

2.9 成分-靶點-通路對應關系分析

用紅色圓點代表靶點，藍色菱形表示成分，對成分-靶點對應關系進行分析（圖6）。利用Cytoscape軟件中的cytoHubba插件進行篩選，按照degree分別將關鍵成分和靶點基因排序。按照度數(shù)排名前五位的成分分別是：山奈酚kaempferol、槲皮素quercetin、木犀草素luteolin、異刺芒柄花素HMO、喬松素Pinocembrin。按照度數(shù)排名前五位的靶點基因分別是：CA2、ESR1、ABCB1、ABCG2和ARG1。

圖6 成分-靶點對應關系

為全面客觀地揭示大補脾湯抗肝癌的可能有效成分及潛在的作用靶點及其通路，運用上述數(shù)據(jù)構(gòu)建“藥物-靶點-通路”交互網(wǎng)絡并進行可視化分析，呈現(xiàn)大補脾湯抗肝癌的復雜網(wǎng)絡關系，并對各靶點的相關參數(shù)進一步分析（圖7）。藍色菱形代表成分，綠色橢圓形表示通路，紅色圓點代表靶點。經(jīng)分析，篩選抗肝癌的主要活性成分為山奈酚、槲皮素、木犀草素等，主要靶點為EGFR、ESR1、SRC、MET等。涉及的主要通路包括微小RNA、雌激素信號通路、癌癥中的蛋白聚糖、癌癥相關通路等。

圖7 藥物成分-靶點-通路對應關系圖

3 討論

中醫(yī)認為，肝癌的產(chǎn)生是由于正氣虛損，痰瘀毒結(jié)而形成。而脾是氣血生化之源，是后天之本，故脾虛是肝癌發(fā)生發(fā)展的重要因素[6]，益脾養(yǎng)肝法可以通過調(diào)養(yǎng)脾胃而長養(yǎng)肝木之臟，調(diào)動肝木生發(fā)的機能，扶正助肝脾生養(yǎng)發(fā)陳以祛除毒邪，達到治療肝癌的功效。經(jīng)考證，大補脾湯為《傷寒論》之理中丸加減而成，遵循《素問·藏氣法時論》“脾欲緩，急食甘以緩之，用苦瀉之，甘補之”[3,16]。王道坤等[4-5]運用大補脾湯治療脾胃疾病取得了較滿意的療效。然而目前關于大補脾湯治療脾胃疾病的相關研究較少且以傳統(tǒng)研究方法為主，對其具體作用機制研究較少。本組以前期動物實驗研究為基礎，利用網(wǎng)絡藥理學研究方法手段的優(yōu)勢，期望彌補傳統(tǒng)藥物研發(fā)模式的不足，對大補脾湯治療肝癌的可能機制進行探索分析。

本研究結(jié)果顯示，大補脾湯7種中藥中甘草的化合物數(shù)量最多，甘草所含的有效成分數(shù)量最多，在同時滿足LR、OB和DL全部規(guī)則的化合物中，甘草多達82個，其次為旋覆花和人參。提示大補脾湯發(fā)揮藥效的活性成分可能主要來源于甘草、旋覆花和人參。

研究結(jié)果顯示，篩選所得人參、甘草、旋覆花含有65個成分可能具有治療肝癌的作用。近年已開展上述三種中藥抗腫瘤的相關研究，人參皂苷可有效地抑制肝癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[17]，復方甘草酸成分具有保護肝細胞膜，減輕肝損傷的作用[18-19]，旋覆花中的倍萜類和甾體類化合物大多數(shù)顯示出顯著的抗腫瘤作用[20]。研究結(jié)果提示山奈酚、槲皮素及木犀草素等可能是大補脾湯治療肝癌的主要成分。

本研究結(jié)果顯示，表皮生長因子受體EGFR可能是肝癌的治療靶點之一，與目前的研究報道一致[21]。EGFR過度表達或突變與肝癌的形成、侵襲性生長等有密切關聯(lián)，并且低分化肝癌的預后與其過量表達有關[22]，因此是良好的肝癌檢測指標和治療靶點[23]。報道顯示山奈酚可能通過調(diào)控EGFR的表達作用對肺癌等發(fā)揮治療作用[24]，但對肝癌的治療還未見報道，本研究結(jié)果提示EGFR可能是山奈酚治療肝癌的靶點之一。本研究結(jié)果提示，槲皮素治療肝癌的作用靶點包括EGFR、MMP等。研究顯示，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP對于肝癌的發(fā)生發(fā)展具有促進的作用[25]。Baby B等[26]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素與酪氨酸激酶的ATP結(jié)合位點具有良好的結(jié)合能力和相互作用，可通過EGFR/VEGFR-2途徑抑制乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、血管生成和侵襲性[27]，也可抑制MMP介導EGFR過度表達的頭頸部鱗狀細胞癌轉(zhuǎn)移[28]。是否在肝癌的發(fā)生發(fā)展中EGFR與MMP之間存在通路上、下游分子的關聯(lián)，以及槲皮素可否通過對二者可實現(xiàn)同時或同步調(diào)控還有待于進一步的研究證實。

本研究結(jié)果顯示，SRC也可能是大補脾湯治療肝癌的重要靶點之一，SRC與惡性腫瘤之間的關系正在引起學者們的重視[29-30]。中藥成分可通過靶向整合素αVβ3和介導αVβ3/SRC/E2F1信號抑制肝癌細胞侵襲性形成，從而發(fā)揮抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[31]。Chen R等[32]研究認為SRC激酶信號抑制物1（SRCIN1）具有抑制人肝癌HepG2細胞增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用。山奈酚可通過SRC、SYK、IRAK1和IRAK4等分子靶點介導抗炎反應[33]，是否對肝癌具有抑制作用未見報道。報道顯示，槲皮素和木犀草素可能通過抑制SRC/STAT3/S100A7的信號轉(zhuǎn)導來治療腫瘤[34]。本研究結(jié)果初步顯示大補脾湯的主要成分山奈酚、槲皮素等可能以SRC為靶點抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展，但有待實驗研究證實。

本研究結(jié)果顯示大補脾湯治療肝癌的部分潛在靶點MET、ABCB等與篩選的miRNAs通路之間也存在相互關聯(lián)，充分印證miRNA在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著錯綜復雜的調(diào)控機制。作為高度保守的內(nèi)源性非編碼小RNA，miRNAs與靶基因發(fā)生不完全性互補結(jié)合，導致靶基因降解或者抑制蛋白翻譯，對基因表達進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[35]。異常c-MET信號與多種癌癥的高增殖指數(shù)、低分化程度、血管侵襲及轉(zhuǎn)移等相關，miRNA也是激活c-MET的重要因素之一。通過調(diào)控c-MET的表達，miRNA可對肝癌細胞發(fā)揮抑制增殖、遷移和侵襲的作用。在肝癌中調(diào)控c-MET信號通路 的miRNAs包 括miR-181a-5p、miRNA-34家 族、miR-199a-3p、miR-148a、miR-363等[36，37]。miR-363的過表達可顯著抑制HepG2細胞的活力并誘導其發(fā)生凋亡，其機制可能與miR-363能下調(diào)肝癌HepG2細胞MCL-1蛋白的表達有關[38]。MiR-223可通過下調(diào)ABCB1的表達來調(diào)節(jié)肝癌細胞的多藥耐藥性[39]。大多數(shù)miRNAs不僅能夠靶向結(jié)合多個基因，而且能同時調(diào)控多條細胞通路來發(fā)揮對細胞生命活動過程的復雜調(diào)節(jié)作用。中藥成分若通過miRNAs相關通路來發(fā)揮防治腫瘤的作用，則具有良好的開發(fā)前景。Tao SF等[40]研究結(jié)果表明，槲皮素可下調(diào)miR-146a及EGFR的表達抑制乳腺癌細胞的侵襲。本研究結(jié)果提示，槲皮素不僅可將EGFR作為靶點，同時可能通過調(diào)控MMP2、MMP9以及miRNA等途徑來發(fā)揮治療腫瘤的作用，充分體現(xiàn)了大補脾湯主要成分多點顯效的作用優(yōu)勢。

除了miRNA調(diào)控通路，雌激素通路也可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，雌激素受體ESR是雌激素通路介導信號傳遞的關鍵環(huán)節(jié)[41]，本研究結(jié)果也顯示ESR可能參與肝癌的發(fā)生發(fā)展過程。但也有研究顯示[42]，ESR1基因SNP rs 9340772位點多態(tài)性與原發(fā)性肝癌的發(fā)生無關。對ESR發(fā)生變異的機制及其功能的深入研究將有助于更好地開展抗腫瘤新藥的研發(fā)工作。

綜上，本研究應用網(wǎng)絡藥理學方法通過預測分析顯示，大補脾湯中山奈酚、槲皮素、木犀草素等可能通過調(diào)控微小RNAs和雌激素信號通路等機制，作用于EGFR、ESR1、SRC、MET等靶點發(fā)揮治療肝癌的作用，為其抗癌的潛在候選藥物的研發(fā)工作提供相關理論依據(jù)。

對照最近發(fā)布的網(wǎng)絡藥理學評價方法指南[42]，本研究涉及的中藥研究和疾病研究數(shù)據(jù)庫等均為目前公認的權(quán)威數(shù)據(jù)庫，所用的研究方法及相關軟件目前均被廣泛應用于網(wǎng)絡藥理學分析檢測，但基于研究條件所限仍存在以下不足之處。本研究僅采用目前較為公認的研究中藥網(wǎng)絡藥理學的數(shù)據(jù)庫TCMSP等對大補脾湯進行了理論預測分析，可能存在化學成分收集以及靶點預測完整性不足、以及成分隨體內(nèi)外環(huán)境而發(fā)生變化等問題，后續(xù)研究還需聯(lián)合應用網(wǎng)絡藥理學其它數(shù)據(jù)庫對相關數(shù)據(jù)進一步進行補充分析，以保障數(shù)據(jù)信息的全面和準確。而且，對研究結(jié)果的驗證還需加強，本組下一步將通過建立動物疾病模型，對預測的靶點和通路進行深入的研究和分析。