I-tip法在海綿微生物分離培養(yǎng)中的應(yīng)用與改進(jìn)

張乙宸 張嘉凱 張桓耀 張亦弛 郝正琦

關(guān)鍵詞：海洋動物微生物;分離;培養(yǎng);I-tip技術(shù)

一、海洋動物——海綿

海洋動物有很多，其中研究比較廣泛的是海綿。海綿是一種籠統(tǒng)的稱呼，作為一種原始的多細(xì)胞動物很早便在地球上存在。淡水產(chǎn)和海產(chǎn)的海綿均存在，多數(shù)以固定落著的方式生長。海洋動物來源微生物的分離一般是采用平板分離法。平板分離法存在一定的局限性，對于這種方法，無法完美地對菌落進(jìn)行分離，而且具有較高的被污染的風(fēng)險。

二、兩相共流法

用注射器或其他擠壓設(shè)備將聚合物溶液滴入交聯(lián)劑中，經(jīng)固化交聯(lián)形成具有一定機(jī)械強(qiáng)度的、穩(wěn)定的水凝膠微球的方法稱為銳孔法（或擠出法）。

兩相共流法（Coflowing liquid stream method）：液滴形成裝置的主要部件是一個直徑幾百微米的用于擠出懸浮細(xì)胞的海藻酸鈉水溶液的針和一個直徑2.5毫米的海藻酸鈉管，通過這個管，擠出的溶液流人周圍不相容的液體石蠟中。針被放置在同軸小管附近的上游。黏性海藻酸鈉水溶液的液滴直徑可以通過改變內(nèi)部和外部流體的速度以及針的直徑來控制，從幾十微米到幾百微米不等。利用300μm直徑的針頭，將細(xì)胞懸浮的海藻酸鈉溶液以1.2cm/s的速度擠壓到環(huán)境液體石蠟中，得到直徑為48±8μm的cho-kl細(xì)胞包裹液滴。分裂過程不影響封閉細(xì)胞的生存能力，因?yàn)榉忾]過程后超過95%的cho-kl細(xì)胞仍然存活。

以上為分散相口與微球制備裝置，該裝置主要由毛細(xì)玻璃管（4）、針頭（8）、緩沖池（5）、固定器（6）、恒流泵（2）、微量注射泵（1）等部分組成。

三、I-tip技術(shù)

I-tip技術(shù)是一種比較先進(jìn)的分離培養(yǎng)的方法是Jung，Dawoon、Seo，Eun-Young、Epstein，Slava s.等2014年在研究海綿中微生物多樣性時使用的一種技術(shù)。

I-tip技術(shù)是復(fù)刻的原位培養(yǎng)，我們首先取用實(shí)驗(yàn)室中的移取液體的滴液頭，然后對滴液頭進(jìn)行機(jī)械切割處理，將處理好的裝置嵌入到原生動物的體表內(nèi)部，嵌入深度為1.25～2.25em左右為宜，滴液頭的頂部用透明度較好的塑料薄膜封住，防止空氣的微生物進(jìn)入原位培養(yǎng)的培養(yǎng)物中感染培養(yǎng)液。兩周之后，將所得到的分離物質(zhì)接種到原生瓊脂培養(yǎng)皿中進(jìn)行下一步的分離和培養(yǎng)，觀察所得的菌落數(shù)量和種類。

四、改進(jìn)I-tip技術(shù)

在水族箱中培養(yǎng)海綿，用1000txL移液槍槍頭端作為裝置的基本元件，通過機(jī)械切片切板機(jī)床，將滴液頭按照相同的規(guī)格割至1.5em，將所得的原位收取器嵌入到海綿的體表，然后所得到的新型培養(yǎng)液加入原位培養(yǎng)器中，采用膠狀透明薄膜封口，處理好的微球用納米級別的過濾膜包住，然后放入移液頭里，形成有機(jī)統(tǒng)一的上下連接裝半密封的整體。培養(yǎng)兩周后，從每個水族箱中取出海綿和原生培養(yǎng)器。將收集的培養(yǎng)器的近寬一端用酒精處理后的機(jī)械刀片進(jìn)行割片處理，再次使用微球，用微球?qū)κ占脑囵B(yǎng)器中的提取物再進(jìn)行第二次的去離，連接方法處理完成后，使用無菌的接種環(huán)取出得到的分離溶液，接種培養(yǎng)到新型培養(yǎng)基，加入PA緩沖液進(jìn)行充分的混合，在培養(yǎng)基底板上培養(yǎng)3～4周后進(jìn)行觀察。

五、具體實(shí)驗(yàn)方案

（一）試驗(yàn)?zāi)康?/p>

從威海近海海域取來買來海綿（多孔動物），通過對照實(shí)驗(yàn)，分別采用I-tip技術(shù)，微包埋法以及綜合兩者改進(jìn)的混合方法對海綿微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)，探究改進(jìn)后的I-tip技術(shù)是否對于篩選分離海綿微生物更加有效。

（二）采用機(jī)理

海洋微生物細(xì)胞通過具有自由進(jìn)出能力的天然高分子材料包裹于通透性良好且允許氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物等發(fā)育環(huán)境之中。選擇良好性能的無毒無害的介質(zhì)。用注射器或其他擠壓設(shè)備將聚合物溶液滴入交聯(lián)劑中，經(jīng)鹽溶液中金屬陽離子的固化交聯(lián)形成具有一定機(jī)械強(qiáng)度的、穩(wěn)定的水凝膠微球。本實(shí)驗(yàn)采用的是海藻酸鈉包埋法，一般通過ca2+固化獲得海藻酸鈣微球。將溶液通過針頭滴入一定濃度的氯化鈣溶液中，鈣離子使海藻酸鈉分子內(nèi)部發(fā)生交聯(lián)形成網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，形成海藻酸鈣凝膠微球。通過兩種方法的有機(jī)整合，形成原位生態(tài)位培養(yǎng)的培養(yǎng)容器，上寬下窄半密封式的培養(yǎng)條件位，更加有效的分離培養(yǎng)所去離的菌株，對于微生物去離和培育的研究具有的新的含義和用處。

（三）試驗(yàn)材料

1.樣品來源

威海海域市場針海綿屬海綿，少部分采用威海近海海域沖積平原和人?？谔幊遍g帶以及海底8000米深度的鈣質(zhì)海綿。通過直接購買或者捕撈公司海底捕撈獲得，帶人實(shí)驗(yàn)室用海水沖洗干凈后放入水族箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

2.儀器設(shè)備

注射器，小型擠壓儀器，200μL移液槍槍頭，60μm～100μm玻璃珠，150μm～212μm玻璃珠，超凈操作臺，機(jī)械切割臺。

3.試驗(yàn)藥品

海藻酸鈉溶液，氯化鈣溶液，無菌PBS緩沖溶液，R2A瓊脂平板，瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿。

制備海藻酸鈉溶液：取用從威海近海岸帶濕的海藻，用海水清洗除雜，然后用去離子水進(jìn)行2～3次沖洗，采用搗器進(jìn)行細(xì)碎化處理，NaOH溶液萃取后澄清化，經(jīng)氯化鈣沉淀得到海藻酸鈣微溶物，利用化學(xué)方法除去存在的可溶性雜質(zhì)得到海藻酸沉淀，與碳酸鈉作用得海藻酸鈉，再經(jīng)干燥和干篩后得到純凈的粉末，將制備好的粉末配置成溶液。

制備無菌PBS緩沖溶液：稱取磷酸二氫鉀（KH2P04）0.27g，磷酸氫二鈉（Na2nP04·12H20）1.42g，氯化鈉（NaCl）8g，氯化鉀（KCl）0.2g，吐溫-20，加去離子水約800mL充分?jǐn)嚢枞芙猓缓蠹尤霛恹}酸調(diào)pH至7.4，最后定容到1L。

瓊脂培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，瓊脂20.0g，葡萄糖20.0g，蒸餾水1000mL。將馬鈴薯洗皮，切成碎塊，加入煮沸20min。紗布過濾。濾液中加入葡萄糖和瓊脂，加熱使之溶化。再補(bǔ)足水量至1000mL，分裝，高壓滅菌23。

R2A瓊脂平板通過上海齊源生物科技公司購買。

（四）試驗(yàn)方法

1.樣品處理

將威海海域市場針海綿屬海綿，少部分采用威海近海海域沖積平原和人?？谔幊遍g帶以及海底8000米深度的鈣質(zhì)海綿。帶回實(shí)驗(yàn)室，放入水族箱中培養(yǎng)。

2.海綿微生物的分離

在水族箱中培養(yǎng)海綿，用1000μL移液槍槍頭端作為裝置的基本元件，通過機(jī)械切片切板機(jī)床，將滴液頭按照相同的規(guī)格割至1.5cm，將所得的原位收取器嵌入到海綿的體表，然后所得到的新型培養(yǎng)液加入原位培養(yǎng)器中，采用膠狀透明薄膜封口，處理好的微球用納米級別的過濾膜包住，然后放入移液頭里，形成有機(jī)統(tǒng)一的上下連接裝半密封的整體。培養(yǎng)2周后，從每個水族箱中取出海綿和原生培養(yǎng)器。將收集的培養(yǎng)器的近寬一端用酒精處理后的機(jī)械刀片進(jìn)行割片處理，再次使用微球，用微球?qū)κ占脑囵B(yǎng)器中的提取物再進(jìn)行第二次的去離，連接方法處理完成后，使用無菌的接種環(huán)取出得到的分離溶液，接種培養(yǎng)到新型培養(yǎng)基，加入PA緩沖液進(jìn)行充分混合，在培養(yǎng)基底板上培養(yǎng)3～4周后進(jìn)行觀察。

3.菌株的測定

將培養(yǎng)基上長出的菌落進(jìn)行測定，采用基于分散液液微萃取技術(shù)（DLLME）的高效液相色譜法測定，得出菌落的種類，同時與對照組菌落種類，數(shù)量進(jìn)行對比。

（五）預(yù)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

請列表來表示出可能獲得的數(shù)據(jù);數(shù)據(jù)處理的過程;預(yù)計(jì)的結(jié)論。

用微型觀測法處理所得的原生培養(yǎng)菌落，觀察并記錄新型方法分離下，去離得到的菌落的數(shù)量大小和種類情況。（六）實(shí)驗(yàn)示意流程圖