miR-124-3p 阻斷Wnt/-catenin 信號(hào)抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及成骨分化

徐紅余，姚麒

骨質(zhì)疏松是以骨骼強(qiáng)度降低、骨折風(fēng)險(xiǎn)增加為特征的一類老年人常見的骨骼疾病。骨質(zhì)疏松是臨床病理性骨折的常見原因，也是影響人類健康的高危因素之一[1]。成骨細(xì)胞由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）分化而來(lái)，在骨形成中具有重要作用[2]。文獻(xiàn)報(bào)道，miR-124-3p 在老年小鼠骨組織內(nèi)明顯上調(diào)[3]。有研究發(fā)現(xiàn)在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）的分化過程中miR-124 表達(dá)的改變可能影響hBMscs的生物學(xué)功能[4]。但miR-124-3p對(duì)BMSCs的生物學(xué)功能尚待深入。本研究主要探討miR-124-3p 對(duì)BMSCs 細(xì)胞增殖、成骨分化的影響，并進(jìn)一步研究其調(diào)控Wnt/ -catenin 信號(hào)的作用機(jī)制。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 BMSCs（人源）購(gòu)自上海澤葉生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 TrizolTM、LipofectamineTM2000 試劑（Invitrogen 公司）；SYBR Green qPCR Mix、4×Reverse Transcription Master Mix（TaKaRa 公司）；CCK8 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；TransWell小室（上海子起生物科技有限公司）；miR-124-3p 模擬物（miR-124-3p mimics）、陰性對(duì)照（mimics-NC）（上海吉瑪公司）；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司）；Wnt、-catenin 和cyclin D1 單克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG 二抗（美國(guó)Abcam 公司）；引物均由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)合成（其中miR-124-3p 引物序列：Forward：5’-GGGTATTGAG-GAAGGTGTT-3’；Reverse：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6：Forward：5’-GCTCGCTTCGGCAGCACA-3’；Reverse：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’）。

1.1.3 主要儀器 1658033 小型蛋白垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（武漢科昊佳生物科技有限公司），ABI 7500 熒光定量PCR 儀（美國(guó)ABI公司），美國(guó)SHELLAB 2406-2 CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)SHELLAB 公司），CLARIOstar全功能多功能酶標(biāo)儀（德國(guó)BMG LABTECH 公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將BMSCs 培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 BMSCs的成骨分化 骨髓間充質(zhì)干BMSCs鋪板于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板生長(zhǎng)至細(xì)胞密度為1×104個(gè)/孔，經(jīng)含10%胎牛血清、50 mol/L 抗壞血酸、0.1 mol/L 二甲基亞砜（DMSO）和10 mmol/L -甘油磷酸酯的-MEM 誘導(dǎo)BMSCs 細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化7 d。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 分別設(shè)置miR-124-3p mimics 組與 miR-124-3p NC 組，待BMSCs細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，使用胰酶消化細(xì)胞，洗滌2 遍后應(yīng)用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞調(diào)至3.0×106個(gè)/ml，取200 l細(xì)胞液接種至corning6 孔板中培養(yǎng)24h。分別向3 個(gè)EP 管中加入5 l LipofectamineTM2000，5 l LipofectamineTM2000+5 l 陰性質(zhì)粒miR-124-3pNC，5 l LipofectamineTM2000+5 l miR-124-3p mimics，室溫靜置5 min 后混合，加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整終體積至2 ml，置于37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)6 h后，更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，完成BMSCs細(xì)胞轉(zhuǎn)染，并繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)miR-124-3p的表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功后，采用RT-qPCR 技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-124-3p的表達(dá)。收集細(xì)胞后，PBS 洗滌2 遍，離心取細(xì)胞沉淀，按照TrizolTMReagent 說明書提取BMSCs總RNA，依據(jù)4×Reverse Transcription Master Mix 試劑盒說明書將組織總RNA逆轉(zhuǎn)錄為總cDNA，按照SYBR Green qPCR Mix 試劑盒說明書操作，以cDNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)。反應(yīng)條件：94 ℃2 min，94 ℃20 s，60 ℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)。以U6 為內(nèi)參，miR-124-3p基因的相對(duì)表達(dá)量以2－Ct表示。

1.2.5 細(xì)胞增殖水平 待轉(zhuǎn)染后的BMSCs細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，使用胰酶消化細(xì)胞，并洗滌2遍，然后應(yīng)用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞調(diào)至3.0×103個(gè)/ml，每孔（96 孔板）接種100 l細(xì)胞液。分別培養(yǎng)24、48 及72h，加入配置好的CCK8試劑（10 l CCK8 試劑＋90 l 完全培養(yǎng)基）孵育2 h，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm 波長(zhǎng)處的吸光值（OD450）。

1.2.6 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn) 兩組細(xì)胞以200個(gè)/皿接種于60 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿（含10 ml 培養(yǎng)液）中，置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育，2 周后肉眼可見細(xì)胞克隆的形成。小心吸棄培養(yǎng)液，用PBS 洗滌2 次，將兩組細(xì)胞以4%的多聚甲醛固定15 min，再用0.1%的結(jié)晶紫染色20 min，用清水清洗染液并風(fēng)干，于熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野統(tǒng)計(jì)形成的細(xì)胞克隆數(shù)（＞50 個(gè)克隆數(shù)為有效克隆）。

1.2.7 成骨分化相關(guān)因子測(cè)定 消化BMSCs 細(xì)胞后采用RT-qPCR 技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-124-3p的表達(dá)。收集細(xì)胞后，PBS 洗滌2 遍，離心取細(xì)胞沉淀，按照“1.2.4”項(xiàng)下RT-qPCR 方法測(cè)定堿性磷酸酶（ALP）、Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因2（RUNX2）、骨鈣素（OCN）成骨分化相關(guān)因子基因表達(dá)水平。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，miR-124-3p 基因的相對(duì)表達(dá)量以2－Ct表示。各引物由上海生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物序列

1.2.8 miR-124-3p 對(duì)BMSCs 細(xì)胞Wnt/-catenin 信號(hào)的調(diào)控作用 按照1∶10的比例加入放射免疫沉淀（RIPA）裂解液，按二辛喹酸（BCA）蛋白定量試劑盒說明書方法測(cè)定所提取的各組細(xì)胞的總蛋白含量，以確保每組樣本之間的上樣量相同。裂解、提取各組蛋白后，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）分離，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素（PVDF）膜，將轉(zhuǎn)好的PVDF 膜于5% 脫脂奶粉溶液中室溫封閉2 h，Tris-HCl 緩沖鹽+Tween（TBST）洗滌液漂洗3～4 次。加入一抗，4℃孵育過夜。再漂洗3～4 次，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗體，室溫孵育2 h，漂洗3～4 次。化學(xué)發(fā)光檢測(cè)底物電化學(xué)發(fā)光（ECL）工作液顯色，采用Image J 圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白顯影圖進(jìn)行灰度分析，以GAPDH 為內(nèi)參，分析并比較兩組Wingless/Integrated（Wnt）、-連環(huán)蛋白（-catenin）和細(xì)胞周期素D1（cyclin D1）蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用LSD-檢驗(yàn)。＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后BMSCs細(xì)胞miR-124-3p的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖的影響 BMSCs細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-124-3p 后，miR-124-3p 相對(duì)表達(dá)高于miR-124-3pNC 組（=9.512＜0.05）。miR-124-3pmimics 組轉(zhuǎn)染48h和72 h的OD450 值均低于miR-124-3p NC組（=14.781，17.247，均＜0.05），見圖1。

圖1 miR-124-3p 對(duì)BMSCs 細(xì)胞增殖的影響

2.2 miR-124-3p 對(duì)BMSCs細(xì)胞克隆的影響 miR-124-3p mimics 組細(xì)胞克隆形成數(shù)為61.8±5.3，低于miR-124-3p NC組的142.7±18.2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=19.743＜0.05）。見圖2。

圖2 miR-124-3p 對(duì)BMSCs 細(xì)胞克隆的影響

2.3 miR-124-3p 對(duì)BMSCs細(xì)胞成骨分化相關(guān)因子表達(dá)的影響 miR-124-3p mimics 組ALP、RUNX2 和OCN 水平均低 于 miR-124-3p NC 組（=9.641、17.264、14.361，均＜0.01）。見表2。

表2 轉(zhuǎn)染后兩組成骨分化相關(guān)因子水平比較

2.4 miR-124-3p 對(duì)BMSCs 細(xì)胞Wnt/-catenin 信號(hào)的影響 miR-124-3p mimics 組Wnt/ -catenin 信號(hào)中關(guān)鍵靶點(diǎn)Wnt、-catenin 和cyclin D1 蛋白相對(duì)表達(dá)均低于miR-124-3p NC 組（=9.517、18.204、7.353，均＜0.01）。見圖3。

圖3 miR-124-3p 對(duì)BMSCs 細(xì)胞Wnt/ -catenin 信號(hào)的影響

3 討論

骨質(zhì)疏松的發(fā)病率在超50 歲人群中逐漸升高，且女性發(fā)病率高于男性，發(fā)病后嚴(yán)重影響生活質(zhì)量[5-6]，故尋找新的藥物靶點(diǎn)已成為近年的研究熱點(diǎn)。miRNA 可通過調(diào)控BMSCs 細(xì)胞增殖、凋亡和成骨分化，在成骨過程中扮演重要角色，影響骨代謝，可作為其生物學(xué)特性、病因?qū)W的分子標(biāo)志物[7-8]。

miR-124-3p在老年小鼠中表達(dá)上調(diào)，具有對(duì)hBMSCs向成骨細(xì)胞分化的負(fù)性調(diào)控作用[3]。但國(guó)內(nèi)關(guān)于miR-124-3p 與成骨分化的發(fā)生發(fā)展及相關(guān)機(jī)制的研究較少。本研究顯示miR-124-3p mimics組miR-124-3p 高表達(dá)；轉(zhuǎn)染48 h 后，miR-124-3p mimics 組細(xì)胞增殖低于miR-124-3p NC組，細(xì)胞克隆形成數(shù)低于miR-124-3p NC 組。這提示miR-124-3p可抑制BMSCs 細(xì)胞增殖。研究指出，成骨細(xì)胞的分化過程同時(shí)受到一系列蛋白調(diào)節(jié)，如ALP、RUNX2、OCN[8-9]。與健康人相比，骨質(zhì)疏松患者的ALP、RUNX2和OCN 等成骨相關(guān)因子通常較低。此外，RUNX2 在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用[10]。故ALP、RUNX2 和OCN 可作為骨質(zhì)疏松或成骨分化的生物標(biāo)志物。本研究顯示，miR-124-3pmimics 組ALP、RUNX2和OCN水平低于miR-124-3p NC 組，可見miR-124-3p 可抑制BMSCs的成骨分化，從而影響骨代謝過程。

目前，Wnt/ -catenin 是常見信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與控制多種生物現(xiàn)象。成骨細(xì)胞分化已被證實(shí)受Wnt/ -catenin 途徑的調(diào)節(jié)。先前研究已經(jīng)證明Wnt/ -catenin途徑在骨質(zhì)疏松的發(fā)病和進(jìn)展中具有關(guān)鍵作用，也被認(rèn)為是治療骨質(zhì)疏松的靶點(diǎn)[11]。而探討成骨細(xì)胞分化過程中Wnt/ -catenin 經(jīng)典信號(hào)與相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白的相互關(guān)系較少[12]。本研究顯示miR-124-3p mimics 組Wnt/ -catenin 信號(hào)中關(guān)鍵靶點(diǎn)Wnt、-catenin 和cyclin D1 蛋白相對(duì)表達(dá)均低于miR-124-3p NC組。這提示miR-124-3p 可抑制Wnt/ -catenin信號(hào)，從而阻止BMSCs向成骨分化。

綜上所述，miR-124-3p 可阻礙BMSCs增殖，逆轉(zhuǎn)成骨分化，可能與抑制Wnt/ -catenin 信號(hào)有關(guān)。為進(jìn)一步研究miR-124-3p調(diào)控骨代謝的作用奠定基礎(chǔ)，并為骨質(zhì)疏松的基因靶點(diǎn)治療提供參考。