川芎嗪對(duì)膿毒癥小鼠肝臟的保護(hù)作用研究

張益維，王玨，朱浩，黃長順，楊秋紅，韓楊楊

膿毒癥是感染、創(chuàng)傷及燒傷等臨床危急重癥患者的常見并發(fā)癥，已成為危重病患者死亡的首要原因[1]。肝臟在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用[2]，肝細(xì)胞在膿毒癥時(shí)可以迅速地清除機(jī)體過量的炎癥介質(zhì)，從而有效地調(diào)控機(jī)體的炎癥反應(yīng)[3]。研究表明，肝功能障礙或肝臟病變的患者發(fā)生感染性疾病如膿毒癥等的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加[4]，膿毒癥休克患者并發(fā)肝功能障礙者病死率高達(dá)84.0%[5]。川芎嗪已被證實(shí)對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用，減少脂質(zhì)過氧化物的生成等作用[6]。本研究旨在通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察川芎嗪對(duì)膿毒癥小鼠肝臟的保護(hù)作用。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物模型和分組 32 只試驗(yàn)用小鼠，均為雄性8 周齡野生型C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量19～22 g，采購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005，合格證號(hào)：20170005013227。按體質(zhì)量編號(hào)后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，分別為假手術(shù)+0.9%氯化鈉注射液組（A 組）、假手術(shù)+川芎嗪組（B 組）、腸穿孔術(shù)（CLP）+0.9%氯化鈉注射液組（C 組）和CLP+川芎嗪組（D 組），各8 只小鼠。本試驗(yàn)已通過杭州赫貝科技有限公司試驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的倫理審查。

1.2 方法 CLP 造模方法：所有小鼠于手術(shù)前12 h 禁食、禁水，采用4%水合氯醛（0.1 ml/10g）麻醉后，C、D組小鼠于腹中線處進(jìn)行1 cm 左右的開口，游離盲腸，并于末端進(jìn)行結(jié)扎，采用16號(hào)針在盲腸末端0.5cm處，穿刺并擠出少許糞便后縫合。A、B組小鼠只進(jìn)行開腹不結(jié)扎盲腸。所有小鼠在開腹后均注射0.2 ml 0.9%氯化鈉注射液。干預(yù)措施：B、D 組小鼠于術(shù)前30min 小鼠尾靜脈注射20mg/kg的鹽酸川芎嗪注射液，A、C 組小鼠于術(shù)前30 min 注射等量的0.9%氯化鈉注射液。

1.3 觀察指標(biāo)（1）觀察4 組小鼠術(shù)后7 d 存活率。（2）血液生化檢測。取術(shù)后48 h眼眶血，EDTA抗凝處理后，4 ℃，5 000 r/min 離心10 min，取血漿置入血生化儀檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、腫瘤壞死因子-（TNF-）、白介素-1（IL-1）及白介素-6（IL-6）。（3）采用ELISA 法檢測肝組織勻漿中IL-6 和TNF-表達(dá)，以及肝組織內(nèi)髓過氧化物酶（MPO）的活性。（4）鏡下觀察拍照，對(duì)樣本的病理變化作綜合性描述，并對(duì)樣本進(jìn)行病理評(píng)分。按炎細(xì)胞浸潤范圍評(píng)分：0分，無炎細(xì)胞或極少數(shù)炎細(xì)胞浸潤；1 分，＜25%，輕微炎癥；2 分，26%～50%，輕度炎癥；3 分，51%～75%，中度炎癥；4 分，＞75%，重度炎癥。以5 個(gè)視野的平均值作為該樣本的最終評(píng)分，最終結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用檢驗(yàn)，多重比較采用 檢驗(yàn)；生存率比較采用檢驗(yàn)。＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后7 d生存率比較 A、B組小鼠CLP 術(shù)后7 d 內(nèi)無死亡，生存率顯著高于C 組和D 組（2≥5.02，均＜0.05）；D 組術(shù)后7 d 生存率顯著高于C 組（2=9.21＜0.05）。見封二彩圖7。

2.2 4 組小鼠術(shù)后7 d 生化指標(biāo)和炎癥因子檢測 B組小鼠ALT、AST、TNF-、IL-1 及IL-6 均顯著低于A 組（≥5.22，均＜0.05）；C 組小鼠上述指標(biāo)均顯著高于A 組（≥4.90，均＜0.05）；D 組小鼠上述指標(biāo)均顯著低于A、C 兩組（≥4.68，均＜0.05），除TNF-外，其余指標(biāo)均顯著高于B 組（≥4.41，均＜0.05）。見表1。

表1 4 組小鼠術(shù)后7 d 生化指標(biāo)和炎癥因子檢測

2.3 4 組小鼠肝組織IL-6、TNF-及MPO 表達(dá)比較 B 組與A 組3 項(xiàng)指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（≤1.20，均＞0.05）；C 組3 項(xiàng)指標(biāo)均顯著高于B 組（≥4.11，均＜0.05）；D 組IL-6 及TNF-水平低于C 組（≥3.96，均＜0.05），MPO 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=1.85＞0.05）。見表2。

表2 4 組小鼠肝組織IL-6、TNF-及MPO 表達(dá)比較 pg/ml

2.4 病理結(jié)果（1）HE 染色結(jié)果示，A組及B 組小鼠肝細(xì)胞未見變形和壞死，肝竇清晰，未見炎癥浸潤。C 組小鼠肝細(xì)胞腫脹，中央靜脈存在嚴(yán)重變形，并伴有充血及炎癥細(xì)胞浸潤情況，肝臟大部分面積結(jié)構(gòu)紊亂，給藥干預(yù)后（D 組）病理改變減輕。見封二彩圖8。（2）肝臟切片病理評(píng)分顯示，A組為輕微炎癥，評(píng)分為（0.07±0.25）分；B組為無炎癥；C 組為輕中度炎癥，評(píng)分為（2.20±0.75）分；D組為輕微炎癥，評(píng)分為（1.20±0.40）分。

3 討論

膿毒血癥多是感染或創(chuàng)傷引起的全身系統(tǒng)彌漫性炎癥反應(yīng)[7]，在感染情況下，肝臟構(gòu)成了宿主防御機(jī)制的一道重要屏障，肝細(xì)胞在膿毒癥時(shí)可以迅速地清除機(jī)體過量的炎癥介質(zhì)，從而有效地調(diào)控機(jī)體的炎癥反應(yīng)，在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中起重要的作用[3]。川芎嗪是傘形科植物川芎根莖中的主要化學(xué)成分之一，為一種新型鈣離子拮抗劑。研究證實(shí)，川芎嗪具有抑制血小板聚集、降低血小板活性和抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)纖溶酶原激活物抑的分泌及的表達(dá)[8]；對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)具有重要的調(diào)節(jié)作用；同時(shí)還有擴(kuò)張肺血管，阻斷內(nèi)皮素受體，減少脂質(zhì)過氧化物的生成等作用[6]，同時(shí)具有活血通脈作用[9]。這些藥理作用均可阻斷或減輕膿毒癥的病理生理過程，有利于膿毒癥的防治。

本研究結(jié)果表明，川芎嗪能夠提高CLP 小鼠7 d 生存率，猜測川芎嗪可能是通過保護(hù)肝臟改善抗炎反應(yīng)和調(diào)節(jié)免疫的功能，來提高膿毒血癥小鼠術(shù)后的生存率。本研究結(jié)果表明，川芎嗪能夠有效保護(hù)CLP 小鼠肝功能，保護(hù)肝臟炎癥損害，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，采用川芎嗪的B組和D 組的ALT、AST、TNF-、IL-1 及IL-6 均顯著低于A 組和C 組；病理結(jié)果顯示，川芎嗪干預(yù)下的CLP 小鼠評(píng)分明顯低于對(duì)照組CLP小鼠評(píng)分，并且HE染色呈現(xiàn)類似結(jié)果，川芎嗪干預(yù)下的CLP小鼠肝臟炎性浸潤情況優(yōu)于對(duì)照組。這與2009 年陳玉熹等[10]人的研究結(jié)果相似。

綜上所述，川芎嗪能夠通過調(diào)節(jié)CLP小鼠炎癥反應(yīng)，抑制炎癥因子釋放，保護(hù)肝臟病理生理變化，從而避免膿毒血癥進(jìn)行性加重，提高CLP小鼠術(shù)后7d 生存率，改善預(yù)后。