GPV·MDPV和FAdV-4三重PCR檢測(cè)方法的建立

戴銀 胡曉苗 趙瑞宏 張丹俊 潘孝成 沈?qū)W懷 尹磊 周學(xué)利 侯宏艷

摘要 [目的]為快速地鑒別鵝細(xì)小病毒（GPV）、番鴨細(xì)小病毒（MDPV）和禽腺病毒血清4型（FAdV-4）3種病毒，建立一種特異強(qiáng)、敏感高、重復(fù)性好的三重PCR檢測(cè)方法。[方法]根據(jù)Genbank登錄的MDPV、GPV和FAdV-4的基因序列，設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，以提取的核酸為模板，進(jìn)行PCR特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)。[結(jié)果]采用所建立的方法能夠擴(kuò)增出GPV、MDPV和 FAdV-4 特異性片段，且不能檢出鴨黃病毒（DFV）、鴨 I 型肝炎病毒（DVH-Ⅰ）和禽呼腸孤病毒（ARV）;GPV、MDPV 和 FAdV-4 核酸模板的最低檢測(cè)量分別為20、2、2 pg;對(duì)8份陽(yáng)性臨床病料進(jìn)行檢測(cè)，可見MDPV、GPV和FAdV-4的檢出率均為100%。[結(jié)論]建立的三重PCR檢測(cè)方法能夠?qū)DPV、GPV和FAdV-4這3種病毒進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的診斷。

關(guān)鍵詞 鵝細(xì)小病毒（GPV）;番鴨細(xì)小病毒（MDPV）;禽腺病毒4型（FAdV-4）;三重PCR檢測(cè)

中圖分類號(hào) S 855 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A ?文章編號(hào) 0517-6611（2021）15-0183-02

Abstract [Objective]In order to quickly identify three kinds of goose parvovirus （GPV）， muscovy duck parvovlrus （MDPV） and fowl adenovirus serotype 4 （FAdV4）， to establish a triple virus with strong specificity， high sensitivity and good repeatability PCR detection method.[Method]According to the gene sequences of MDPV， GPV and FAdV4 registered in Genbank， 3 pairs of specific primers were designed and the extracted nucleic acid was used as a template to perform PCR specificity， sensitivity and repeatability tests.[Result]The established method could amplify specific fragments of GPV， MDPV and FAdV4， and cannot detect duck flavivirus （DFV）， duck viral hepatitis typeⅠ（DVHⅠ） and avian reovirus （ARV）.The minimum detection levels of GPV， MDPV and FAdV4 nucleic acid templates were 20， 2 and 2 pg， respectively.The detection of 8 positive clinical materials showed that the detection rates of MDPV， GPV and FAdV4 were all 100%.[Conclusion] The established triple PCR detection method can quickly and accurately diagnose the three viruses MDPV， GPV and FAdV4.

Key words Goose parvovirus （GPV）;Muscovy duck parvovlrus （MDPV）;Fowl adenovirus serotype 4 （FAdV4）;Triplex PCR detection

基金項(xiàng)目 安徽省科技重大專項(xiàng)（202003a06020012）;安徽省畜禽疫病研究中心項(xiàng)目（2020YL094）;安徽省家禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（AHCYJSTX-06）。

作者簡(jiǎn)介 戴銀（1980—），女，安徽蒙城人，副研究員，博士，從事獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)研究。*通信作者，研究員，從事畜禽傳染病學(xué)研究。

收稿日期 2020-10-10;修回日期 2021-01-28

番鴨細(xì)小病毒（muscovy duck parvovlrus，MDPV）和鵝細(xì)小病毒（goose parvovirus，GPV）都是細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒亞科、依賴病毒屬成員[1]。MDPV可引起雛番鴨的細(xì)小病毒病，又稱番鴨3周病，該病具有高度的傳染性，主要導(dǎo)致雛番鴨消化道、腸道等部位的病變，發(fā)病率和死亡率較高[2-3]。GPV又稱小鵝瘟，是一種急性或亞急性敗血性傳染病，傳播速度快[4];該病以腸道的病變?yōu)橹饕卣?，主要侵?0日齡以下雛鵝，也可感染雛番鴨，發(fā)病率、死亡率可高達(dá)100%[5]。禽腺病毒（fowl adenovirus，F(xiàn)AdV）屬于腺病毒科禽腺病毒屬，是雞、鴨、鵝等禽類體內(nèi)常見的傳染性病源[6]。血清4 型I 群禽腺病毒（fowl adenovirus serotype 4，F(xiàn)AdV-4）可引起以心包積液，以及包涵體肝炎為特征的心包積水-肝炎綜合征（hydropericardium hepatitis syndrome，HHS），病禽主要表現(xiàn)在精神沉郁、扭頭等神經(jīng)癥狀，死亡率可達(dá)20%～30%[7]。

GPV和MDPV基因組具有高度的同源性，抗原性也高度相似，用常規(guī)的血清學(xué)檢測(cè)方法很難區(qū)分。FAdV也可分為5個(gè)種、12個(gè)血清型，其中以血清4型為主[8]。相對(duì)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、免疫熒光技術(shù)等方法，PCR方法則可同時(shí)對(duì)多個(gè)病毒進(jìn)行準(zhǔn)確、快速的鑒別診斷。三重 PCR 實(shí)現(xiàn)了一管三檢的目的，具有成本低、效率高、速度快等優(yōu)點(diǎn)。目前，應(yīng)用三重PCR 技術(shù)同時(shí)對(duì)GPV、MDPV和FAdV-4的3種病毒進(jìn)行檢測(cè)和診斷的研究鮮見報(bào)道，該研究設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物，建立了GPV、MDPV和FAdV-4的三重 PCR 快速檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

DL2000 DNA Marker、Taq酶等購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司;RNA/DNA 快速提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、瓊脂糖（電泳純）等購(gòu)自生工生物工程科技（上海）股份有限公司。

1.2 病毒株

GPV、MDPV和FAdV-4，以及對(duì)照毒株鴨黃病毒（duck flavivirus，DFV）、鴨 I 型肝炎病毒（duck viral hepatitis type Ⅰ，DVH-Ⅰ）和禽呼腸孤病毒（avian reovirus，ARV）由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存。

1.3 三重PCR方法的建立

1.3.1 引物的設(shè)計(jì)與合成。根據(jù)GPV、MDPV和 FAdV-4的基因保守序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)3對(duì)特異性擴(kuò)增引物（表1），由生工生物工程科技（上海）股份有限公司合成。

1.3.2 核酸的提取及反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)病毒 DNA/RNA 快速提取試劑盒說(shuō)明書，提取GPV、MDPV、 FAdV-4、DFV、DVH-Ⅰ和ARV的 DNA/RNA。核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定核酸的濃度和純度，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。將RNA 按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。

1.3.3 PCR反應(yīng)條件。PCR反應(yīng)體系：DNA 1 μL，上、下游引物各1.0 μL， Taq ?DNA 聚合酶Mixture 14 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 特異性檢測(cè)

把含有GPV、MDPV和 FAdV-4核酸模板的樣品，以及含有其他對(duì)照病原體（DFV、DVH-Ⅰ和ARV）的核酸樣品，分別加至GPV、MDPV和 FAdV-4的三重PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，以檢測(cè)其特異性。

1.5 敏感性檢測(cè)

測(cè)定GPV、MDPV和 FAdV-4的核酸模板濃度后，將其作10倍遞進(jìn)稀釋至10-7。分別對(duì)上述模板進(jìn)行三重PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)其敏感性。

1.6 重復(fù)性檢測(cè)

利用建立的三重PCR方法，在相同條件下，對(duì)收集的8份已鑒定的禽病料進(jìn)行基因組提取和PCR擴(kuò)增檢測(cè)，以驗(yàn)證該P(yáng)CR方法的重復(fù)性。

1.7 PCR產(chǎn)物的電泳分析及克隆測(cè)序

取5 μL PCR產(chǎn)物于上樣孔中，同時(shí)點(diǎn)DNA Marker作為參照，以90～120 V的電壓于1×TAE電泳緩沖液中電泳，在紫外凝膠成像儀上觀察結(jié)果，分析并記錄。PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 三重PCR的特異性

采用該方法對(duì)GPV、MDPV和 FAdV-4及對(duì)照病原體DFV、DVH-Ⅰ和ARV的核酸樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖1），GPV、MDPV和 FAdV-4的混合核酸模板及單獨(dú)模板均能擴(kuò)增出與試驗(yàn)設(shè)計(jì)大小相符的628、432、979 bp的條帶，而對(duì)照病原體在相同位置卻無(wú)特異性擴(kuò)增條帶。

2.2 三重PCR的敏感性

經(jīng)敏感性試驗(yàn)測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖2），GPV、MDPV和 FAdV-4三重PCR 最低能同時(shí)檢測(cè)到2 pg的MDPV和 FAdV-4核酸模板以及20 pg GPV核酸模板。

2.3 三重PCR的重復(fù)性

利用建立的三重PCR方法，對(duì)已鑒定的病料進(jìn)行檢測(cè)，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示（圖3），8份混合核酸模板的PCR擴(kuò)增結(jié)果均出現(xiàn)了3條清晰明亮的目的條帶。結(jié)果表明，建立的GPV、MDPV和FAdV-4三重PCR檢測(cè)方法具有良好的重復(fù)性。

3 討論與結(jié)論

番鴨細(xì)小病毒（MDPV）只感染番鴨，鵝細(xì)小病毒（GPV）則既可感染鵝，又可感染番鴨，新型鵝細(xì)小病毒還可導(dǎo)致鴨的短喙和侏儒綜合征[9-10];研究發(fā)現(xiàn)MDPV和GPV在自然環(huán)境中可發(fā)生基因重組，形成重組型的水禽細(xì)小病毒株[11-13]，產(chǎn)生新的危害。禽腺病毒血清4型（FAdV-4）不僅在雞群中造成危害，也可感染鵝和鴨[14-15]，但目前還未引起廣泛的重視。這3種病毒病近年來(lái)不斷有發(fā)生的報(bào)道，已成為危害水禽養(yǎng)殖業(yè)的重要病原，建立準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)方法尤為重要。相對(duì)常規(guī)血清學(xué)方法，PCR方法具有操作簡(jiǎn)便、敏感性高、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，多重PCR則可一次同時(shí)檢測(cè)多種病毒，更為簡(jiǎn)便、快速。

由于多重PCR反應(yīng)體系中存在2種以上的引物和模板，反應(yīng)過(guò)程中相互之間可能會(huì)存在一定的干擾，因此要求各引物要有較強(qiáng)的特異性，且反應(yīng)條件盡可能地接近一致。該研究根據(jù)GPV、MDPV和FAdV-4各自的基因組序列設(shè)計(jì)多對(duì)特異性引物，通過(guò)多次反應(yīng)條件的優(yōu)化，篩選了退火溫度一致的3對(duì)引物，進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，即可鑒別GPV、MDPV和FAdV-4這3種病毒。采用該三重PCR 方法，GPV、MDPV和 FAdV-4核酸模板的最低檢出量分別為20、2和2 pg;對(duì)8份臨床病料進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MDPV、GPV和FAdV-4的檢出率均為100%。這說(shuō)明該三重 PCR檢測(cè)方法具有較好的特異性、敏感性和可重復(fù)性，可為鴨細(xì)小病毒、鵝細(xì)小病毒和禽腺病毒鑒別診斷提供準(zhǔn)確的結(jié)果，對(duì)3種疫病的預(yù)防控制具有重要意義。

參考文獻(xiàn)

[1] 萬(wàn)春和，陳紅梅，傅秋玲，等.番鴨細(xì)小病毒浙江分離株 VP 基因的克隆與序列分析[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2015，42（10）：2600-2605.

[2] 戴銀，張丹俊，沈?qū)W懷，等.安徽番鴨細(xì)小病毒的分離和PCR檢測(cè)[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2016，52（8）：35-37.

[3] 崔國(guó)杰，陳少鶯.番鴨細(xì)小病毒和小鵝瘟病毒混合感染的診治[J].畜牧與獸醫(yī)，2015，47（3）：147-148.

[4] 黃宇翔，劉力威，李洪彬，等.鵝細(xì)小病毒病、副黏病毒病的流行病學(xué)調(diào)查及病原分離鑒定[J].中國(guó)家禽，2013，35（2）：22-25，29.

[5] 吳娟，盧梁萍，戴銀，等.番鴨細(xì)小病毒病和鵝細(xì)小病毒病的特征和防控[J].畜牧與飼料科學(xué)，2017，38（8）：100-102.

[6] 盧鳳英，孫華偉，張敬峰，等.鴨源血清4型禽腺病毒的分離鑒定[J].中國(guó)家禽，2018，40（5）：62-64.

[7] 孫自若，林維鵬，楊曉龍，等.血清4型禽腺病毒研究進(jìn)展[J].中國(guó)家禽，2018，40（16）：43-49.

[8] 王慧，程小果，陳申秒.I亞群禽腺病毒流行新特點(diǎn)及防控策略[J].家禽科學(xué)，2017（2）：23-25.

[9] 宮曉華，李琦，李傳峰，等.鴨源新型鵝細(xì)小病毒DS15株生物學(xué)特性研究[J].中國(guó)家禽，2017，39（4）：52-55.

[10] LI C F，LI Q，CHEN Z Y，et al.Novel duck parvovirus identified in Cherry Valley ducks（ Anas platyrhynchos domesticus ），China[J].Infect Genet Evol，2016，44：278-280.

[11] WANG J Y，LING J Y，WANG Z X，et al.Molecular characterization of a novel Muscovy duck parvovirus isolate：Evidence of recombination between classical MDPV and goose parvovirus strains[J].BMC Vet Res，2017，13（1）：1-10.

[12] ZHU Y，ZHOU Z，HUANG Y，et al.Identification of a recombinant Muscovy Duck parvovirus（MDPV）in Shanghai，China [J].Vet Microbiol，2014，174（3/4）：560-564.

[13] 萬(wàn)春和，傅秋玲，陳翠騰，等.基因重組型番鴨細(xì)小病毒FJM3的全基因組特征[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2016，36（11）：1836-1841.

[14] 粟元文，王懷禹，魏玲.鴨源FadV-4的分離鑒定與致病性分析[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2019（4）：98-101.

[15] 盧鳳英，孫華偉，張敬峰，等.鴨源血清4型禽腺病毒的分離鑒定[J].中國(guó)家禽，2018，40（5）：62-64.