植物環(huán)狀RNA研究進(jìn)展

趙佳明 樊二勤 王智 王軍輝 曲冠證

摘要 環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）主要是真核細(xì)胞通過反向剪接作用使3′末端和5′末端共價結(jié)合而形成的一條單鏈非編碼RNA分子，它是一種特殊的非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA），在多種生物體中廣泛存在。綜述了植物中circRNA鑒定方法、分子特征以及潛在的生物學(xué)功能等方面，表明circRNA可能在生物脅迫、非生物脅迫以及生長和發(fā)育中發(fā)揮重要作用，并以動物中circRNA的研究進(jìn)展為基礎(chǔ)，對植物中circRNA的局限性和應(yīng)用前景進(jìn)行討論。

關(guān)鍵詞 環(huán)狀RNA;非編碼RNA;circRNA鑒定;分子特征;生物學(xué)功能

中圖分類號 Q 943.2 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A ?文章編號 0517-6611（2021）15-0004-06

Abstract Circular RNA （circRNAs） is mainly a singlestranded noncoding RNA molecule formed by covalent binding of 3′ and 5′ ends by reverse splicing of eukaryotic cells. It is a special noncoding RNA （noncoding RNA，ncRNA）， which exists widely in many organisms. In this paper， the identification methods， molecular characteristics and potential biological functions of circRNA in plants were reviewed. It was indicated that circRNA may play an important role in biological stress， abiotic stress， growth and development. Based on the research progress of circRNA in animals， the limitations and application prospects of circRNA in plants were discussed.

Key words circRNA;Noncoding RNA;circRNA identification;Molecular characteristics;Biological function

基金項目 中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金項目 “楸樹特異性狀形成的分子解析” （CAFYBB2017ZY002）。

作者簡介 趙佳明（1995—），男，黑龍江綏化人，碩士研究生，研究方向：林木遺傳育種。*通信作者，研究員，博士，博士生導(dǎo)師，從事云杉、楸樹遺傳育種研究。

收稿日期 2020-11-18

在植物細(xì)胞中，除了可編碼蛋白的信使RNA（mRNA）以外，還存在著諸多類型的非編碼RNA，包含核糖體RNA（rRNA）、轉(zhuǎn)運RNA（tRNA）、反式作用siRNA（tasiRNA）、小干擾RNA（siRNA）、小核仁RNA（snoRNA）、小核RNA（snRNA）、長鏈非編碼RNA（lncRNA）、微小RNA（miRNA）和環(huán)狀RNA（circRNA）等[1]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，環(huán)狀RNA（circRNA）在非編碼RNA的研究中漸漸成為熱點。以共價閉合構(gòu)成的環(huán)狀RNA主要由數(shù)千種真核生物基因外顯子的前體mRNA的3′和5′末端的反向剪接形成，它是一類區(qū)別多數(shù)線性RNA的非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA）[2]。

更多的研究表明，circRNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、種類豐富、序列保守、在細(xì)胞和組織中特異性表達(dá)。circRNA具備很多潛在功能，通過發(fā)揮miRNA海綿功能、干擾可變剪切以及結(jié)合蛋白等方式調(diào)控線性mRNA的表達(dá)。高通量測序結(jié)果表示，circRNA廣泛存在于多種植物體中，通過細(xì)胞和組織特異性表達(dá)參與花的發(fā)育、果實的成熟、逆境響應(yīng)等生長發(fā)育進(jìn)程[3-4]。筆者總結(jié)近年來對植物circRNA的研究現(xiàn)狀，結(jié)合動物中最前沿的研究內(nèi)容，對植物中circRNA潛在的功能進(jìn)行借鑒研究，為植物circRNA的進(jìn)一步研究發(fā)展提供重要理論基礎(chǔ)，并討論未來的研究方向。

1 植物中circRNA的鑒定

環(huán)狀RNA是一種呈環(huán)形閉合的非編碼RNA分子，在剪切復(fù)合體作用下，它由基因的一個或多個外顯子連接組成，且具備miRNA海綿體的功能，研究表明它的構(gòu)成依賴于兩側(cè)的內(nèi)含子互補序列。在動物和人類中已經(jīng)鑒定出許多環(huán)狀RNA，但是在植物上的大規(guī)模鑒定信息鮮有報道，幾乎關(guān)注度很低[5]。環(huán)狀RNA一直被認(rèn)為是剪切錯誤的產(chǎn)物，直到20世紀(jì)70年代，Sanger等[6]在植物病毒中發(fā)現(xiàn)了閉合的環(huán)狀RNA分子，并且在真核生物中驗證了環(huán)狀RNA的存在。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，Salzman等[7]第一次提出circRNA是由mRNA前體可變剪切而來，是真核生物中普遍存在的一類3′和5′共價閉合RNA分子，涉及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程。自2014年植物circRNA第一次在模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)以來[1]，目前已經(jīng)在玉米、水稻、小麥、大麥等單子葉植物和大豆、獼猴桃、辣椒、擬南芥、馬鈴薯、沙棘、番茄、棉花、枸橘、茶樹和梨等雙子葉植物約15個物種中涉及circRNA的研究報道。由于取樣組織、識別軟件和測序深度不同，所以報道物種間circRNA數(shù)量存在較大差異，例如，在擬南芥的葉組織和水稻的根部中鑒定出circRNA分別是6 012和12 037個[8];在水稻的花序中和成熟葉組織中鑒定出circRNA僅2 354個[3]。截至目前，為植物circRNA研究提供了極大的便利，已經(jīng)建立起4個針對植物circRNA分析和檢索數(shù)據(jù)庫[9]，該研究首次整理了circRNA的鑒定信息史（表1）。

有研究表明，circRNA同樣參與開花過程。目前，關(guān)于開花調(diào)控的小RNA研究主要還集中于microRNA（miRNAs）上，miRNA是一類長度為21～23 nt的RNA分子，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能[23]，主要利用引導(dǎo)效應(yīng)蛋白AGO（Argonaute）來抑制mRNA表達(dá)[24]。例如，在擬南芥和水稻中，miR172和miR156在營養(yǎng)生長到生殖生長過程中起著重要的作用;擬南芥中的miR172和金魚草、玉米中的miR169在初期花發(fā)育時調(diào)控花型及相關(guān)靶基因的表達(dá)，miR139、miR159、miR164和miR167主要在花發(fā)育后期發(fā)揮作用[25]。

circRNA的預(yù)測分析是其功能機(jī)制研究的基礎(chǔ)。截至目前，有7種以上的circRNA預(yù)測軟件被公開發(fā)表，其中PcircRNA_finder是針對植物較特異的circRNA預(yù)測軟件。依據(jù)算法不同，軟件可以分為2種類型：第1種是利用內(nèi)含子驅(qū)動下的反向可變剪切接頭序列而設(shè)計的預(yù)測軟件，例如，MapS-plice、CIRI、CIRCexplorer、find_circ等[26];第2種是利用基因組注釋信息預(yù)測可變剪切接頭反向序列，并與注釋的外顯子序列進(jìn)行匹配來推測新的circRNA軟件，例如，NCLscan、KNIFE等都是針對人類和動物circRNA進(jìn)行研究開發(fā)，不太適用于植物circRNA的鑒定[27-28]。此外不同軟件運行速度和準(zhǔn)確度各有差異，根據(jù)預(yù)測軟件的計算速度和準(zhǔn)確度對同一樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，KNIFE 和CIRCexplorer的準(zhǔn)確度就會很高;find_circ 準(zhǔn)確度也比較高;PcircRNA_finder更有利于對植物circRNA的鑒定[28]。但是關(guān)于這個軟件的可靠性和可應(yīng)用性還需要進(jìn)一步探討。該研究整理了circRNA的相關(guān)預(yù)測方法（表2），在實際應(yīng)用中可使用多個circRNA識別工具，進(jìn)行共同預(yù)測可取得滿意的結(jié)果。但是，由于植物circRNA的豐度較低，還是給circRNA的鑒定帶來一定困難，雖然已有報道在多種植物中含有很多的circRNA，但其實際數(shù)量可能被嚴(yán)重低估，因此更加可靠性和靈敏度高的鑒定軟件開發(fā)仍迫在眉睫。

2 植物circRNA的特征

2.1 植物中circRNA的來源和保守性

一般來說，植物circRNA的豐度較低，主要是通過細(xì)胞類型和組織特異性表達(dá)發(fā)揮調(diào)控功能[31]。除了核基因組序列能夠生成植物circRNA之外，線粒體和葉綠體的質(zhì)基因組序列也可產(chǎn)生植物circRNA，這表明circRNA可能參與呼吸和光合作用的調(diào)控[32]。同時，circRNA通過與miRNA相互作用、與蛋白質(zhì)結(jié)合等方式來調(diào)控基因的表達(dá)，從而有效地提高植物轉(zhuǎn)錄調(diào)控的復(fù)雜性和多樣性[28]。植物circRNA來源于外顯子和內(nèi)含子或由兩者共同組成，并且circRNA的功能性表達(dá)與組織特異性密切關(guān)聯(lián)[29]。

目前，對于circRNA的研究大部分都集中在動物身上，對于植物circRNA的研究還不夠深入。目前只有單子葉植物水稻、玉米、小麥、大麥等物種，雙子葉植物擬南芥、番茄、毛竹、獼猴桃等物種涉及circRNA的研究報道[1，32]。與動物中circRNA一樣，植物中的circRNA也通過選擇性反向拼接和選擇性剪接產(chǎn)生多種類型。更有研究報道circRNA的植物物種之間存在保守性。Ye等[8]研究發(fā)現(xiàn)擬南芥和水稻之間有700個來源基因具有同源性，而且其中有300個同源基因在相似部位生成circRNA，表明circRNA在不同的植物中具有高度保守。通過對水稻、擬南芥和大豆分別產(chǎn)生circRNA的9 385、8 362和1 995個親本基因進(jìn)行保守性分析，得出大豆和擬南芥、水稻分別有685、1 095個高度同源，3個物種中一共存在551個高度同源[9]。

2.2 植物中circRNA的可變環(huán)化和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性

circRNA是非線性的單鏈非編碼RNA的一種，與常見的線性RNA是有區(qū)別的，它沒有5′帽狀結(jié)構(gòu)和 3′多聚腺苷酸化，使circRNA對核酸外切酶具有抗性，因此circRNA有一定的穩(wěn)定性和保守性[33]，研究還表明circRNA具備組織特異性、種屬特異性、發(fā)育階段相關(guān)特異性和疾病特異性[28]。同時一個基因能夠產(chǎn)生不同類型的circRNA，甚至某些circRNA的表達(dá)量的水平會比相應(yīng)的線性RNA高。然而，相關(guān)研究表明影響circRNA形成的重復(fù)和反向互補序列在擬南芥、水稻中都是非常少，這表示在植物中除了反向互補內(nèi)含子序列之外，可能還有其他影響植物circRNA形成的因素[3，8]。有研究報道，在水稻中鑒定到近2 806個全長circRNA，但是只有206個存在經(jīng)典的 GU、AG剪接信號，這表明在水稻中大部分circRNA的形成可能不依賴于經(jīng)典的GU、AG剪接信號[34]。可變環(huán)化的生成方式有很多，例如，對于內(nèi)含子間的競爭性配對，將會導(dǎo)致包含多個外顯子的一個基因座產(chǎn)生多種circRNA。另一方面，一個基因座可以通過是否保留外顯子間的內(nèi)含子而產(chǎn)生多種circRNA，并且同一基因座能夠通過可變環(huán)化產(chǎn)生多種circRNA。通過可變環(huán)化這一現(xiàn)象，加深了對反向剪切機(jī)制的了解，但可變環(huán)化產(chǎn)生和調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，需要進(jìn)一步探究。

3 植物circRNA的功能

3.1 作為miRNA的海綿體

越來越多的研究證明，circRNA是具備多種生物學(xué)功能的生物大分子，circRNA最典型的一種作用機(jī)制是作為miRNA海綿體（sponge）[35]，miRNA是生物體最短的具有生物學(xué)功能的非編碼RNA，長為22 bp左右，在調(diào)控生長發(fā)育、分化、生殖和逆境耐受等生命過程中發(fā)揮作用，人類有1/3以上基因受miRNA調(diào)控[36]。circRNA通過競爭性結(jié)合的模式抑制miRNA靶標(biāo)結(jié)合的能力。例如，Hansen等[37]研究表明，小腦變性關(guān)聯(lián)蛋白1反義轉(zhuǎn)錄物ciRS-7中含有約70個miR-7保守結(jié)合位點，通過兩者相互作用可以負(fù)向調(diào)控miR-7的活性，進(jìn)而調(diào)控下游目的基因的表達(dá)，改變circRNA的豐度能夠調(diào)控miRNA對其目的基因的作用。例如，矽肺是比較典型的肺疾病類型，其特征是纖維細(xì)胞異常增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積，研究發(fā)現(xiàn)，在circRNA小腦變性關(guān)聯(lián)蛋白1的反義轉(zhuǎn)錄物（CDR1as）上有多個miR-7的結(jié)合位點，在SiO2刺激后，CDR1as可以利用海綿化miR-7釋放目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化生長因子受體2，從而增強(qiáng)A549細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，引起肺纖維化病癥[38]。

Lu等[3]在水稻中發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Os08circ16564，其靶標(biāo)關(guān)系的OsmiR172的表達(dá)沒有發(fā)生變化，但在一些植物circRNA的研究中，依然將它作為miRNA海綿體來研究。例如，Wang等[39-40]在番茄中發(fā)現(xiàn)102個circRNA可以作為24個miRNA的潛在靶標(biāo)，在小麥中報道6個circRNA可以作為26個miRNA的潛在靶標(biāo)。但是截至目前，在不同植物物種中具備潛在吸附能力的circRNA所占比例較小。例如，Ye等[8]研究發(fā)現(xiàn)水稻和擬南芥中少部分的circRNA（6.0%和5.0%）被猜測為miRNA的潛在靶標(biāo)。在擬南芥中，Chen等[41]報道比例更低，為0.67%。在成熟和熟綠番茄2個發(fā)育時期，Yin等[42]共鑒定出340個差異表達(dá)的circRNA，其中只有19個可能是miRNA的潛在靶標(biāo)。因為circRNA缺失5′端和poly（A）尾巴，因此核糖核酸酶（RNase）不能將它降解，在脫帽和降解過程通常會結(jié)合miRNA，參加轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。Hansen等[37]研究發(fā)現(xiàn)在植物生長發(fā)育過程中circRNA作為miRNA海綿具備調(diào)控功能，成為circRNA早期功能鉆研的重點。在線蟲中circRNA可作為分子海綿的數(shù)量和功能有限，在目前已報道的circRNA中，也僅有CDR1as和SRY這2個circRNA被證實具備分子海綿作用，因而miRNA分子海綿不是circRNA的普遍特點，可能只有極少數(shù)的circRNA可以結(jié)合大量miRNA分子[43]。

3.2 circRNA的表達(dá)模式

circRNA在植物體中普遍存在，對生長發(fā)育進(jìn)程起著重要作用。例如，circRNA主要利用葉綠素代謝和激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑參加花的發(fā)育、果實的成熟、葉片的衰老相關(guān)調(diào)控[31]，同時，circRNA在應(yīng)對不同脅迫時會表現(xiàn)出差異現(xiàn)象。例如，甜椒果實在低溫脅迫下，檢測到有36個circRNA差異表達(dá)現(xiàn)象[44];水稻在磷脅迫下，檢測到有27個circRNA的表達(dá)量發(fā)生變化[8];小麥幼苗在干旱脅迫下，檢測到有62個circRNA差異表達(dá)現(xiàn)象;在梨中經(jīng)干旱脅迫后，檢測到有33個circRNA出現(xiàn)差異表達(dá)，而且其中發(fā)現(xiàn)11個來源基因參與了氧化還原過程[45]。番茄經(jīng)低溫脅迫，發(fā)現(xiàn)163個circRNA中，包括138個上調(diào)和25個下調(diào)[40]。另外，擬南芥在光強(qiáng)脅迫后，與大麥在經(jīng)歷微量元素鋅和鐵處理后，circRNA均發(fā)生顯著表達(dá)變化[8，32]。因為circRNA是一類沒有5′端和3′端的閉環(huán)結(jié)構(gòu)，所以核酸外切酶不容易將它降解，circRNA對生物與非生物脅迫應(yīng)答時有較長的響應(yīng)周期，并且在植物長距離傳遞信號中發(fā)揮相應(yīng)功能[16]。目前，circRNA的研究主要基于人類和其他動物，主要研究思路可以分為2種類型，首先就是以circRNA為切入點來尋找有相同結(jié)合位點的miRNA，通過miRNA尋找控制相關(guān)表型特性的靶基因，建立circRNA-miRNA-靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò);其次是以miRNA為切入點，由miRNA尋找相關(guān)的上游和下游相關(guān)靶基因，并最終建立調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

3.3 circRNA與蛋白互作

目前，circRNA除了可作為miRNA海綿體（miRNA sponges）之外，還發(fā)揮著其他生物功能，包括蛋白質(zhì)分子海綿（protein sponges）、蛋白質(zhì)招募（protein recruiters）、蛋白質(zhì)支架（protein scaffolds）、蛋白誘捕陷阱（protein decoys）、翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)（protein translates）等。circRNA可識別、存儲和運輸各種蛋白質(zhì)，并將它們運送到特定的位置，通過調(diào)節(jié)靶mRNA或核糖體生成，從而發(fā)揮作用[46]。如ciR-7/CDR1as能利用AGO2蛋白完成競爭性結(jié)合miR-7[37];同時，circRNA利用蛋白互作，參與泛素化、細(xì)胞周期、細(xì)胞衰老等生命進(jìn)程，circRNA和蛋白質(zhì)的相互作用影響其circRNA合成降解，并對蛋白質(zhì)的功能和表達(dá)都會影響，有研究表明circRNA的生物合成過程受到轉(zhuǎn)錄因子、RBPs、反式剪切因子和順式調(diào)控元件的混合調(diào)控[47]。

目前最常用的circRNA-蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)主要有5種，包括RNA pull-down、RNase酶保護(hù)試驗、抗體依賴的RIP、熒光原位雜交法（FISH）和電泳遷移分析法（EMSA）等，且通過熒光原位雜交和RNase的2種方法可以精確得到互作circRNA的序列。Zhang等[48]探究發(fā)現(xiàn)針對前期篩選出的一個肺腺癌組織高表達(dá)circ_0007766進(jìn)行體外了解分析和生物學(xué)功能性驗證，從而證實circ_0007766利用上調(diào)細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)蛋白CyclinD1/CyclinE1/CDK4的表達(dá)增強(qiáng)肺腺癌細(xì)胞增殖。最新發(fā)現(xiàn)某些circRNA能在體內(nèi)產(chǎn)生相應(yīng)蛋白質(zhì)，而這一重要發(fā)現(xiàn)拓展了轉(zhuǎn)錄組和蛋白組的領(lǐng)域[49]。

當(dāng)前對circRNA的研究還有諸多的爭論與困難，希望以后有更多人投入circRNA研究中，因為它極有可能作為新一代的疾病治療靶點和分子標(biāo)志物在臨床上發(fā)揮功能。

3.4 circRNA潛在翻譯功能

在正常情況下，由于circRNA不具有翻譯的功能，因此它被定義為新型的非編碼RNA。但是，近些年對circRNA密切研究，在特定條件下，circRNA具備被翻譯成蛋白質(zhì)的功能[50]。最先發(fā)現(xiàn)δ肝炎病毒的單鏈環(huán)狀RNA基因組，在哺乳動物細(xì)胞中被翻譯成與病毒相關(guān)蛋白，并在產(chǎn)生肝炎過程中發(fā)揮相應(yīng)功效[50-51]。在人細(xì)胞中，circRNA顯示可以通過N6-甲基腺苷（m6A）途徑翻譯蛋白;Zhou等[52]研究發(fā)現(xiàn)eIF4G2能直接參與m6A修飾調(diào)控其circRNA翻譯，并證明m6A修飾直接影響circRNA翻譯。由于circRNA編碼的多肽的功能尚不明確，但生物細(xì)胞中circRNA的翻譯水平在應(yīng)激條件下會發(fā)生變化[38]。Yang等[53]研究發(fā)現(xiàn)在人類細(xì)胞中的circRNA上存在大量一致性的m6A基序，并且在多種蛋白參與下，一個m6A位點便能夠啟動對circRNA的翻譯。

當(dāng)前，對于擬南芥中m6A修飾有一定的了解，它修飾部位一般在mRNA的起始密碼子與終止密碼子處，但其他植物circRNA中有關(guān)m6A修飾的研究還沒有[23]。王琮等[54]在bioRxiv經(jīng)過大面積地搜集和整理目前試驗驗證的IRES（internal ribosome entry site）文獻(xiàn)材料，開發(fā)出了IRESbase數(shù)據(jù)庫，IRES是一種RNA功能性元件，可以招募核糖體啟動翻譯。除了一些非帽依賴的mRNA通過IRES招募核糖體啟動翻譯，目前發(fā)現(xiàn)一些circRNA 也能利用IRES啟動翻譯。其中包括不少circRNA與lncRNA有關(guān)聯(lián)的IRESs。circRNA已被發(fā)現(xiàn)可以翻譯成蛋白質(zhì)并且展現(xiàn)重要的生物學(xué)功能，例如，circβ-catenin 經(jīng)IRES介導(dǎo)的翻譯能夠激活Wnt信號通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增長，IRESbase的工作必然能為探究circRNA翻譯提供一些幫助[55]。

3.5 circRNA參與開花調(diào)控

花是被子植物的繁殖器官，對于生產(chǎn)而言具有較大經(jīng)濟(jì)價值。成花誘導(dǎo)是植物生命周期中一個主要變化，也被認(rèn)為是幼年期到成年期顯著的標(biāo)志。不同植物的成花轉(zhuǎn)變時間一般不同，相對來說，木本植物的營養(yǎng)生長時期更長[23]。

關(guān)于開花調(diào)控的研究主要還集中在miRNAs上，miRNA是一類長度為21～23 nt的RNA分子，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能[23]，主要利用引導(dǎo)效應(yīng)蛋白AGO（Argonaute）來抑制mRNA表達(dá)[24]。例如，在擬南芥和水稻中，miR172和miR156在營養(yǎng)生長到生殖生長過程中起著重要的作用;擬南芥中的miR172和金魚草、玉米中的miR169在初期花發(fā)育時調(diào)控花型及相關(guān)靶基因的表達(dá)，miR139、miR159、miR164和miR167主要在花發(fā)育后期發(fā)揮作用[9，25]。2017年，Conn等[56]報道一條來源SEPALLATA3基因的外顯子circRNA對來源mRNA具有反向作用，從而可以調(diào)控花型，說明circRNA同樣參與開花過程。Liang等[57]在水稻中共鑒定出31個差異表達(dá)circRNA，47個差異表達(dá)miRNAs和4 779個差異表達(dá)mRNAs。應(yīng)用Cytoscape構(gòu)建了miRNA介導(dǎo)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和CERNA網(wǎng)絡(luò)，猜測認(rèn)為CircRNA A02：23507399|23531438是在轉(zhuǎn)錄后一定程度上調(diào)控花藥發(fā)育的重要circRNA。Zeng等[58]為了鑒定柑橘circRNA并研究其功能作用，對早熟三葉橙（早花三葉橙突變體）進(jìn)行了高通量測序，并對其野生型進(jìn)行了分析。利用生物信息學(xué)分析，共鑒定出558個潛在的circRNA，其中86.02%是正義重疊的circRNA。對它們的序列特性、交替環(huán)化等特點進(jìn)行了分析。與野生型相比，在早熟三葉橙中共鑒定出176個差異表達(dá)的circRNA，其中61個顯著上調(diào)，115個顯著下調(diào)，表明它們可能在早花過程中起重要作用。Cheng等[59]通過對擬南芥中17個在野生型植物中積累的laciRNAs（套索結(jié)構(gòu)驅(qū)動的circRNA）進(jìn)行測序。為了確定這些laciRNAs的生物學(xué)功能，分別為每個laciRNA構(gòu)建了一對轉(zhuǎn)基因植株，其中有或沒有內(nèi)含子的局部基因分別在野生型植物中過表達(dá)。通過比較兩類轉(zhuǎn)基因植物的形態(tài)表型和轉(zhuǎn)錄譜，結(jié)果表明，從At5g37720的第1個內(nèi)含子獲得的laciRNA過表達(dá)會導(dǎo)致葉卷曲、簇生，開花延遲和繁殖力下降，大約800個基因的表達(dá)量改變，說明circRNA與開花過程相關(guān)。

4 植物circRNA局限性

目前，對于circRNA的認(rèn)識仍比較淺顯，有許多問題有待闡明，主要表現(xiàn)在以下5個方面：①在circRNA命名機(jī)制方面，其命名機(jī)制有待于完善。當(dāng)前，circRNA的命名沒有進(jìn)行統(tǒng)一，由于每個人的研究角度不同，導(dǎo)致命名的不一致[60]，因此，需要構(gòu)建一個公認(rèn)的、恰當(dāng)?shù)暮瓦m合的circRNA命名體系，以防止circRNA命名混亂現(xiàn)象的發(fā)生;②circRNA的形成方面，植物中circRNA的形成機(jī)制可能與動物中有所區(qū)別，但二者具體形成機(jī)制存在的差異還需要進(jìn)一步研究。此外，在反向剪接過程中，剪接體是怎樣發(fā)揮作用的，如何進(jìn)行組裝的還不夠清楚。circRNA究竟是產(chǎn)生于轉(zhuǎn)錄后還是共轉(zhuǎn)錄過程中以及其依靠于什么樣的動力學(xué)模型等都需要進(jìn)一步深入研究[61];③circRNA功能、翻譯和表達(dá)方面，雖然有研究表明，circRNA在病毒中存在翻譯功能[51]。然而，截至目前還沒有證據(jù)能夠表明在真核生物中內(nèi)源circRNA可以翻譯成蛋白質(zhì)。因此關(guān)于circRNA的翻譯能力還存在著一定的爭議，除了該研究介紹的circRNA的一些的功能之外，可能還存在一些未知的生物學(xué)功能。circRNA在組織細(xì)胞中進(jìn)行時空特異性表達(dá)的調(diào)控機(jī)制目前還不是很清楚，Ye等[8]對植物中單子葉和雙子葉植株進(jìn)行circRNA的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)circRNA同樣具有時空組織表達(dá)的特異性，其表達(dá)與來源基因有關(guān)，并且序列保守。但是在circRNA的形成模式上，植物和動物之間的相關(guān)特性并不一樣，例如內(nèi)含子的長度、側(cè)翼序列的重復(fù)片段等方面[8]。在植物生長過程中circRNA同樣有很重要的作用，值得進(jìn)行深入研究;④circRNA運輸降解方面，circRNA在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間進(jìn)行怎樣的運輸，并涉及到哪些蛋白或者酶的參與，和相關(guān)的信號通路都不是很清楚，這都需要進(jìn)一步探究[62]。與circRNA形成機(jī)制比較，circRNA如何被降解的相關(guān)研究非常稀少，circRNA降解過程涉及到相關(guān)信號通路，以及蛋白或者酶的參與等問題，都需要解決;⑤circRNA研究方法方面，截至目前，circRNA的鑒定主要依賴將試驗方法鑒定和生物信息學(xué)預(yù)測相結(jié)合2個方面。比如，在試驗方法中，普遍利用RNA-seq技術(shù)來鑒定，例如像反轉(zhuǎn)錄過程可能存在一些由于技術(shù)上的錯誤連接，產(chǎn)生一些人為的circRNA，這些circRNA可能會影響測序的準(zhǔn)確性。RNA-seq已經(jīng)在不同的組織和疾病中發(fā)現(xiàn)了數(shù)千種circRNA，然而多數(shù)還沒有得到其他技術(shù)手段的驗證或者功能研究[62]。在生物信息學(xué)中，為了降低假陽性，普遍算法采取的策略是利用經(jīng)典的U2剪接信號和基因注釋，但是這樣就會降低其敏感性，因為基因注釋并不完整，況且部分基因不適用于經(jīng)典剪接信號，所以對circRNA的檢測算法需要進(jìn)一步探究。

5 展望

相比于動物，植物中circRNA的研究進(jìn)展較緩慢，需要進(jìn)一步研究其轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)控生物學(xué)功能和形成機(jī)制等方面。即使在動物中，circRNA的生物學(xué)功能研究也不夠全面。相比較mRNA、lncRNA和miRNA等，對于circRNA的探究仍處于初級階段，這些研究將有助于提高對基因組中非編碼序列的認(rèn)識。circRNA在生物體內(nèi)動態(tài)表達(dá)，通過與mRNA、miRNA和lncRNA三者形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而實現(xiàn)對宿主基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的相關(guān)調(diào)控。它是具備重要調(diào)控功能的RNA分子，而不是錯誤剪接的副產(chǎn)物。現(xiàn)在，關(guān)于circRNA的生物學(xué)功能研究大多集中于circRNA的海綿狀體功能上，其翻譯功能是主要的被忽視的方向。雖然大多數(shù)都在探究可預(yù)測性circRNA的翻譯功能，但是需要進(jìn)一步提高其準(zhǔn)確性。

關(guān)于近年來植物circRNA研究獲得的成果，結(jié)合動物中最前沿研究，分析植物circRNA的潛在功能，進(jìn)一步表明circRNA在開花調(diào)控領(lǐng)域進(jìn)展緩慢，關(guān)于木本植物開花發(fā)育的研究逐漸成為熱點，對楸樹提早開花機(jī)制研究的比較少，因此探究circRNA對楸樹提早開花相關(guān)的影響也是一個重要方向。目前，雖然對于circRNA的研究取得了一些成果，但植物circRNA的研究仍然是一個漫長的過程。circRNA分子研究正在進(jìn)入一個極速發(fā)展的新時代，所以要對這一領(lǐng)域進(jìn)行不斷研究。circRNA的深入研究可能會為解釋植物遺傳現(xiàn)象及理解遺傳調(diào)控提供一種新的思路，因此，對植物circRNA的認(rèn)識仍是一個漫長的過程。

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