泊洛沙姆作為溫度敏感型凝膠基質(zhì)的安全性評(píng)價(jià)

徐雨生，廖川江，段美娟＊

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2. 大理大學(xué) 云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 藥用特種昆蟲(chóng)開(kāi)發(fā)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，云南 大理 671000）

溫度敏感型原位凝膠（thermosensitive in situ gel）是目前研究較為廣泛的敏感型原位凝膠之一[1-3]。其優(yōu)點(diǎn)在于以原位凝膠為載體攜帶藥物可直接患部給藥，提高藥物生物利用度，組織親和力強(qiáng)，給藥后可親和給藥部位，并迅速發(fā)生相變形成半固體凝膠，高度親水性的三維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可將藥物束縛其中，延長(zhǎng)藥物在用藥部位的滯留時(shí)間，具有良好的緩釋作用[4-5]；組織相容性好，對(duì)機(jī)體刺激性很小，使用方便有效[6]；適用范圍廣，局部作用藥物、全身作用藥物、大分子藥物、親水性藥物和疏水性藥物等多數(shù)藥物均可以原位凝膠為載體[7]。

泊洛沙姆（poloxamer）作為一類(lèi)食品添加劑和藥物制劑的輔料（賦形劑）在化工、生物工程、醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用[8]。泊洛沙姆是一種高分子非離子型表面活性劑，其毒性低，生物相容性好，且具有低溫時(shí)為流動(dòng)液體，體溫下成凝膠狀的特性，是理想的藥物控釋材料[2]。目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)有關(guān)其毒性研究的報(bào)道。本研究對(duì)泊洛沙姆作為婦科疾病局部給藥的溫度敏感型凝膠基質(zhì)的安全性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)，為臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

EL-104型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；MilliQ Plus超級(jí)純水儀（廣州艾科普公司）；ASP-300S型自動(dòng)脫水機(jī)（德國(guó)Leica公司）；BM-VIII型生物組織包埋機(jī)（孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司）；RM2245型手動(dòng)切片機(jī)（德國(guó)Leisa公司）；YT-7FB型生物組織攤烤片機(jī)（湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；BI-2000型醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）。

1.2 試劑

泊洛沙姆P 4 0 7（批號(hào)：W P E H 5 4 0 B，BASF）；泊洛沙姆P188（批號(hào)：WPYH570B ，BASF）；生理鹽水（批號(hào)：15102404，昆明市宇斯藥業(yè)有限責(zé)任公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF級(jí)昆明種小鼠222只，雌雄各半，體重18～22 g；健康SPF級(jí)SD大鼠34只，雌性未孕，體重220～260 g，均由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證：SCXK（湘）2014-0011，飼養(yǎng)于大理大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的 IVC 系統(tǒng)。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 泊洛沙姆P407溶液制備 稱(chēng)取適量泊洛沙姆P407固體，加入三蒸水，配制成濃度為30.00 %，24.00 %，19.20 %，15.36 %，12.29 %（w/w）的泊洛沙姆P407溶液。

2.1.2 泊洛沙姆P188溶液制備 稱(chēng)取適量泊洛沙姆P188固體，加入三蒸水，配制成濃度為40.00 %，32.00 %，25.60 %，20.48 %，16.38 %（w/w）的泊洛沙姆P188溶液。

2.1.3 泊洛沙姆P407/P188混合溶液制備 按質(zhì)量比2.5:1，稱(chēng)取適量泊洛沙姆P407、P188固體，加入三蒸水，配制成濃度為40.00 %，32.00 %，25.60 %，20.48 %，16.38 %，13.10 %（w/w）的泊洛沙姆P407/P188混合溶液。以40.00 %的泊洛沙姆P407/P188混合溶液作為空白凝膠。

2.2 經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)

2.2.1 半數(shù)致死劑量（LD50）的測(cè)定 選取昆明種小鼠40只，雌雄各半，隨機(jī)分成4組，每組10只，分別按20 ml/kg劑量灌胃給予生理鹽水、30.00 %泊洛沙姆P407溶液、40 %泊洛沙姆P188溶液、40 %泊洛沙姆P407/P188混合溶液[9]。試驗(yàn)小鼠于給藥前12 h和給藥后4 h內(nèi)禁食，飲水自由，給藥后逐日觀(guān)察，連續(xù)14 d，參照《藥物毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)》[10]，觀(guān)察小鼠用藥后有無(wú)中毒表現(xiàn)、出現(xiàn)時(shí)間、持續(xù)時(shí)間和恢復(fù)時(shí)間，死亡時(shí)間，并記錄小鼠外觀(guān)、行為、排泄物、死亡數(shù)和死亡情況。隔天記錄小鼠的體重。

2.2.2 經(jīng)口最大耐受量（MTD）的測(cè)定 選取昆明種小鼠32只，隨機(jī)分成2組，每組16只，雄雌各半，第一組按最大可給藥體積（40 ml/kg）[9]灌胃給予空白凝膠，第二組給予等容積的生理鹽水。試驗(yàn)小鼠于給藥前12 h和末次給藥后4 h內(nèi)禁食，飲水自由，試驗(yàn)當(dāng)天首次給藥后間隔6 h再次給藥，逐日觀(guān)察，連續(xù)14 d，參照《藥物毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)》[10]，觀(guān)察小鼠用藥后有無(wú)中毒表現(xiàn)、出現(xiàn)時(shí)間、持續(xù)時(shí)間及恢復(fù)時(shí)間，死亡時(shí)間，并記錄小鼠行為、排泄物，死亡數(shù)和死亡情況。隔天記錄小鼠的體重。

2.3 腹腔注射急性毒性試驗(yàn)

選取昆明種小鼠150只，雄雌各半，隨機(jī)分為15組，每組10只，分別按20 ml/kg劑量，腹腔注射[9,11]方式給予泊洛沙姆P407溶液（濃度分別為30.00 %，24.00 %，19.20 %，15.36 %，12.29 %）、泊洛沙姆P188溶液（濃度分別為40.00 %，32.00 %，25.60 %，20.48 %，16.38 %）、泊洛沙姆P407/P188混合溶液（濃度分別為40.00 %，32.00 %，25.60 %，20.48 %，16.38 %，13.10 %）。試驗(yàn)小鼠給藥前12 h和末次給藥后4 h內(nèi)禁食，飲水自由，給藥后逐日觀(guān)察，連續(xù)14 d，參照《藥物毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)》[10]，觀(guān)察小鼠用藥后有無(wú)中毒表現(xiàn)、出現(xiàn)時(shí)間、持續(xù)時(shí)間及恢復(fù)時(shí)間，死亡時(shí)間，并記錄小鼠外觀(guān)、行為、排泄物、死亡數(shù)和死亡情況。隔天記錄小鼠的體重、飲水量和采食量。

2.4 陰道給藥急性毒性試驗(yàn)

選取雌性未孕大鼠18只，按體重隨機(jī)分為3組，每組6只。按0.01 ml/10 g劑量陰道給藥，第一組12 h內(nèi)給予空白凝膠4次，第二組12 h內(nèi)給予空白凝膠6次[11]，第三組為空白對(duì)照組，不給藥。試驗(yàn)大鼠給藥前12 h和末次給藥后4 h內(nèi)禁食，飲水自由，給藥后參照《藥物毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)》[10]，逐日觀(guān)察，連續(xù)7 d，并記錄中毒反應(yīng)、死亡數(shù)和死亡情況，隔天記錄大鼠的體重。

2.5 陰道黏膜刺激性試驗(yàn)

選取雌性未孕大鼠16只，按體重隨機(jī)分成兩組，分別為空白凝膠組和空白對(duì)照組，每組8只。空白對(duì)照組不給藥，空白凝膠組按0.01 ml/10 g劑量大鼠陰道給藥[1,3]，連續(xù)14 d，給藥期間觀(guān)察大鼠中毒情況及陰道局部的變化，記錄中毒反應(yīng)、陰道病變情況、大鼠死亡數(shù)和死亡情況。隔天記錄大鼠的體重，并于給藥后第8天和第15天，各組分別隨機(jī)處死2只大鼠，取出陰道組織，10 %福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查[12-13]。試驗(yàn)期間若有死亡大鼠應(yīng)及時(shí)解剖，觀(guān)察其臟器組織形態(tài)、顏色有無(wú)異常，有明顯病變者需取材進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。根據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》“中藥陰道制劑毒性試驗(yàn)方法”對(duì)陰道黏膜刺激反應(yīng)的評(píng)定要求分別對(duì)肉眼和病理組織學(xué)觀(guān)察進(jìn)行評(píng)分[14]。

3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

4 結(jié)果

4.1 小鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

小鼠灌胃給予泊洛沙姆P407溶液的LD50>6.00 g/kg；小鼠灌胃給予泊洛沙姆P188溶液的LD50>8.00 g/kg；小鼠灌胃給予泊洛沙姆P407/P188混合溶液的LD50>8.00 g/kg；各組小鼠在給藥后立即出現(xiàn)豎毛、蜷縮、扎堆的現(xiàn)象，1 h后基本恢復(fù)正常，4 h后陸續(xù)出現(xiàn)稀便的現(xiàn)象，24 h后基本恢復(fù)正常。14 d的觀(guān)察期內(nèi)均未出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)或死亡，體重隨試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。觀(guān)察期內(nèi)，每只小鼠投食量為4 g/d，所有受試小鼠都能吃完當(dāng)天的飼料。14 d后處死部分小鼠，解剖無(wú)可見(jiàn)臟器的病變。

小鼠灌胃給予空白凝膠的MTD>16 g/kg。NS對(duì)照組小鼠在給藥后14 d的觀(guān)察期內(nèi)均未出現(xiàn)明顯的異常、不良反應(yīng)或死亡，體重也隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加?？瞻啄z組小鼠在首次給藥后 4 h 陸續(xù)出現(xiàn)稀便的現(xiàn)象，第二次給藥后4 h小鼠的大便呈黏稠的液體狀，末次給藥結(jié)束后24 h小鼠逐漸恢復(fù)稀便，48 h后小鼠大便恢復(fù)正常?？瞻啄z組小鼠于首次給藥后立即出現(xiàn)豎毛、蜷縮、扎堆的現(xiàn)象，1 h后恢復(fù)活躍狀態(tài)；第二次給藥后大部分小鼠有干嘔的現(xiàn)象，小鼠有豎毛、安靜、扎堆的表現(xiàn)，4 h后投食，所有小鼠進(jìn)食表現(xiàn)基本恢復(fù)正常。

4.2 小鼠腹腔注射急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示，小鼠腹腔注射泊洛沙姆P407溶液的LD50為3.66 g/kg；小鼠腹腔注射泊洛沙姆P188溶液的LD50為7.74 g/kg；小鼠腹腔注射泊洛沙姆P407/P188溶液的LD50為5.62 g/kg；小鼠腹腔注射不同基質(zhì)后在14 d的觀(guān)察期內(nèi)出現(xiàn)不同程度的毒性反應(yīng)：泊洛沙姆P407組：藥物注射后小鼠活動(dòng)、狀態(tài)正常，20 min后部分小鼠活動(dòng)緩慢、狀態(tài)變差、豎毛、喜扎堆、飲食量正常，24 h后開(kāi)始有小鼠死亡，最高劑量組死亡小鼠眼睛流淚，解剖發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)有積液，肉眼觀(guān)察肝臟色澤暗淡，腸系膜血管充盈，其余劑量組死亡小鼠解剖發(fā)現(xiàn)肝臟色澤暗淡，其余組織和臟器無(wú)異常；泊洛沙姆P188組：藥物注射后小鼠活動(dòng)、狀態(tài)正常，20 min后部分小鼠活動(dòng)緩慢、狀態(tài)變差、豎毛、喜扎堆、飲食量正常，24 h后部分小鼠逐漸恢復(fù)，48 h后最高劑量組開(kāi)始有小鼠死亡，死亡小鼠解剖發(fā)現(xiàn)肝臟色澤暗淡，其余組織、臟器無(wú)異常；泊洛沙姆P407/P188組：藥物注射后小鼠活動(dòng)、狀態(tài)正常，20 min后部分小鼠活動(dòng)緩慢、狀態(tài)變差、豎毛、喜扎堆、飲食量正常，72 h后最高劑量組開(kāi)始有小鼠死亡，死亡小鼠解剖發(fā)現(xiàn)肝臟色澤暗淡，其余組織、臟器無(wú)異常，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 小鼠腹腔注射泊洛沙姆的急性毒性試驗(yàn)LD50測(cè)定結(jié)果（n=10）

結(jié)果表明，泊洛沙姆以腹腔注射方式給藥會(huì)有一定的毒性。該產(chǎn)品主要為外用，該結(jié)果可為其他用藥途徑毒性評(píng)價(jià)提供一定的參考。

4.3 大鼠陰道給藥急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

空白凝膠12 h內(nèi)分別4次或6次給藥，在給藥后7 d的觀(guān)察期內(nèi)，所有大鼠進(jìn)食正常，均未出現(xiàn)任何不良反應(yīng)和死亡，體重也隨著試驗(yàn)的延長(zhǎng)而增加。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，空白凝膠組大鼠陰道給藥的MTD>2.40 g/kg。

4.4 大鼠陰道黏膜刺激性試驗(yàn)結(jié)果

所有大鼠在14 d的給藥期內(nèi)進(jìn)食正常，未出現(xiàn)任何不良反應(yīng)和死亡，體重也隨試驗(yàn)的延長(zhǎng)而增加，給藥期間大鼠陰道外周未見(jiàn)明顯的紅斑、水腫和膿性分泌物；連續(xù)給藥14 d內(nèi)，空白凝膠對(duì)大鼠的陰道黏膜無(wú)明顯的刺激性；空白凝膠給藥7 d和14 d的大鼠陰道組織，在40倍顯微鏡下可見(jiàn)組織結(jié)構(gòu)正常，層次分明，少量淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分散浸潤(rùn)，與正常大鼠相比黏膜層及黏膜下層未見(jiàn)明顯變化，結(jié)果見(jiàn)表2、3及圖1。

圖1 各組大鼠陰道組織病理切片（HE，×40）

表2 陰道黏膜刺激性試驗(yàn)大鼠外陰肉眼評(píng)分（n=8）

表3 陰道黏膜刺激性試驗(yàn)大鼠陰道病理組織學(xué)評(píng)分（n=2）

5 結(jié)論

此產(chǎn)品擬專(zhuān)為治療婦科疾病研制，故局部毒性和刺激性實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具有實(shí)際意義。由泊洛沙姆P407和泊洛沙姆P188組成的溫敏型空白凝膠基質(zhì)經(jīng)小鼠口服、陰道黏膜給藥基本無(wú)毒。泊洛沙姆可作為對(duì)人體基本無(wú)毒性、無(wú)局部刺激性的治療婦科疾病局部給藥的溫敏型凝膠基質(zhì)。