注射用清開靈（凍干）調(diào)配方法優(yōu)化及其在不同溶媒中穩(wěn)定性的研究

蔡楊靖，潘 云

（海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，海南 海口 570100）

注射用清開靈（凍干）由梔子、黃芩苷、金銀花、板藍(lán)根、膽酸、豬去氧膽酸、珍珠母、水牛角組成，具有清熱解毒，化痰通絡(luò)，醒神開竅的功效，主要用于上呼吸道感染，高熱。臨用前用注射用水溶解，用于肌內(nèi)注射及重癥靜脈滴注。靜脈滴注用氯化鈉注射液或10 %葡萄糖注射液稀釋，臨床使用中，不局限于這兩種溶媒。中藥注射劑與不同溶媒配伍后，成品輸液中含量、pH值及不溶性微粒數(shù)會出現(xiàn)不同變化。成品輸液從配制到用藥，保證其穩(wěn)定性可獲得最佳藥效，同時減少不良反應(yīng)。本研究采用正交試驗(yàn)優(yōu)化注射用清開靈（凍干）的調(diào)配技術(shù)，使其溶解達(dá)到最佳效果，采用高效液相色譜法（HPLC）測定配伍后成品輸液的梔子苷、黃芩苷、綠原酸的含量變化，并測定成品輸液的pH值、不溶性微粒數(shù)，考察注射用清開靈（凍干）與不同溶媒配伍的穩(wěn)定性，為該藥的臨床合理使用提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）；KQ-500DA型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；PHS-3C型pH計（上海雷磁儀器廠）；GWF-5JS 型微粒分析儀（天河醫(yī)療儀器有限公司）；AB-135S型電子天平（d=0.01 mg，瑞士梅特勒公司）； KJ-202 型振蕩器（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）。

1.2 試藥

梔子苷對照品（批號：110749-201919，純度：97.1 %），黃芩苷對照品（批號：110715-201821，純度：95.4 %），綠原酸對照品（批號：110753-201817，純度：96.8 %，中國食品藥品檢定研究院）；注射用清開靈（凍干）（貴州益佰制藥有限公司，規(guī)格：200 mg/支，批號：20190814）；0.9 % 氯化鈉注射液（湖南科倫藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：250 ml，批號：A19072203-1）；5 %葡萄糖注射液（湖南科倫藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：250 ml，批號：A19081506-2）；10 %葡萄糖注射液（湖南科倫藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：250 ml，批號：A19101102-1）；葡萄糖氯化鈉注射液（湖南科倫藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：250 ml，批號：A19061305-2）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)

以滅菌注射用水為溶媒，溶媒體積（A）、振蕩頻率（B）、振蕩時間（C）為因素，設(shè)計三因素二水平正交試驗(yàn)，以不溶性微粒數(shù)為指標(biāo)，選取最佳調(diào)配方法，因素水平見表1。分別取本品1支按正交試驗(yàn)設(shè)計進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表2～4。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果

由表3可見，≥10 μm及≥25 μm微粒數(shù)極差結(jié)果均顯示各因素對不溶性微粒數(shù)影響大小為：A＞B＞C，≥10 μm及≥25 μm微粒數(shù)的均值均顯示最佳調(diào)配方式為A1B2C1。表4方差分析結(jié)果顯示，溶媒體積對≥10 μm及≥25 μm微粒數(shù)有顯著影響（P<0.05），振蕩頻率對≥10 μm微粒數(shù)有一定影響（P<0.1），振蕩時間對≥10 μm及≥25 μm的微粒數(shù)無明顯影響。綜上，最終確定最佳溶解方式為A1B2C1即每支注射用清開靈（凍干）加5 ml滅菌注射用水，1000 r/min振蕩3 min。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.2 主成分含量測定方法

2.2.1 色譜條件 色譜柱：XBridge C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相[1-5]：乙腈（A）-0.3 %磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～7 min，10 %A；7～12 min，20 %A；12～20 min，25 %A）；流速：1.0 ml/min；檢測波長[6]：0～7 min，327 nm；7～12 min，238 nm；12～20 min，280 nm。柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2.2 溶液的制備 對照品溶液的制備：精密稱取梔子苷、綠原酸、黃芩苷對照品適量，加50 %甲醇制成每1 ml中含梔子苷0.832 μg、綠原酸0.224 μg、黃芩苷7.448 μg的混合對照品溶液。

成品輸液的制備：取注射用清開靈12支，每支注入5 ml滅菌注射用水，于振蕩器中1000 r/min振蕩3 min，靜置后分別加至0.9 %氯化鈉注射液、5 %葡萄糖注射液、10 %葡萄糖注射液、葡萄糖氯化鈉注射液250 ml中，每種溶媒平行制備3份。

供試品溶液的制備：精密吸取上述成品輸液2 ml，置50 ml量瓶中，加50 %甲醇稀釋至刻度，過濾，即得。

空白溶液的制備：分別精密吸取0.9 %氯化鈉注射液、5 %葡萄糖注射液、10 %葡萄糖注射液、葡萄糖氯化鈉注射液2 ml，分別置50 ml量瓶中，加50 %甲醇稀釋至刻度，過濾，即得。

2.2.3 專屬性考察 分別取上述對照品溶液、供試品溶液和空白溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果見圖1。

圖1 專屬性考察HPLC圖譜

2.2.4 線性關(guān)系考察 取上述對照品溶液1.0，2.0，5.0，8.0，10 ml，分別置10 ml量瓶中，用50 %甲醇稀釋至刻度。按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對照品濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表5。

表5 3種成分的回歸方程及線性范圍

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)下配制的混合對照品溶液10 μl，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。梔子苷、綠原酸、黃芩苷峰面積RSD分別為0.73 %，0.83 %，0.31 %，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)下配制的供試品溶液，分別于0，4，6，10，15，20，24 h進(jìn)樣。梔子苷、綠原酸、黃芩苷峰面積RSD分別為0.78 %，0.93 %，0.54 %，表明供試品溶液中梔子苷、綠原酸、黃芩苷含量放置24 h穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性考察 取供試品6份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，梔子苷、綠原酸、黃芩苷含量RSD分別為0.64 %，0.76 %，0.45 %，表明該方法重復(fù)性良好。2.2.8 加樣回收試驗(yàn) 精密量取4種溶媒配制的成品輸液各9份，每份1 ml，置50 ml容量瓶中，分別精密加入80 %，100 %，120 % 3種濃度水平的混合對照品溶液1 ml。按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣分析，測定綠原酸、梔子苷、黃芩苷的含量，計算加樣回收率。結(jié)果，回收率在98.9 %～101.8 % 之間。計算過程以0.9 %氯化鈉注射液配制的成品輸液為例，見表6。

表6 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3 成品輸液穩(wěn)定性測定

2.3.1 含量變化 按2.2.2項(xiàng)下方法配制成品輸液，分別于 0，1，2，4，6，8 h測定成品輸液中梔子苷、綠原酸、黃芩苷的含量。結(jié)果顯示，8 h內(nèi)各成品輸液中梔子苷、綠原酸、黃芩苷的含量變化幅度均未超過10 %，滿足輸液配伍要求[7]，見表7。

表7 注射用清開靈（凍干）在不同溶媒中主要成分的相對含量變化情況（n=3)

2.3.2 成品輸液pH值變化 測定0，1，2，4，6，8 h時成品輸液pH值，結(jié)果各成品輸液pH值在8 h內(nèi)均呈逐漸減小趨勢，見表8。

表8 注射用清開靈（凍干）在不同溶媒中pH值隨時間的變化（n=3）

2.3.3 成品輸液不溶性微粒變化 2020年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定[8]，標(biāo)示裝量為100 ml或100 ml以上的靜脈用注射液，除另有規(guī)定外，每1 ml中含10 μm及10 μm以上的微粒數(shù)不得超過25粒，含25 μm及25 μm以上的微粒數(shù)不得超過3粒。本試驗(yàn)于0，1，2，4，6，8 h時測定成品輸液不溶性微粒數(shù)。結(jié)果，成品輸液不溶性微粒數(shù)8 h均呈增多的趨勢，其中0.9 %氯化鈉輸液8 h時含25 μm及25 μm以上的微粒數(shù)超出藥典要求，5 %葡萄糖輸液6 h時含10 μm及10 μm以上的微粒數(shù)及含25 μm及25 μm以上的微粒數(shù)均超出藥典要求，10 %葡萄糖輸液8 h時含10 μm及10 μm以上的微粒數(shù)超出藥典要求，葡萄糖氯化鈉輸液6 h時含25 μm及25 μm以上的微粒數(shù)超出藥典要求，結(jié)果見表9。

表9 注射用清開靈在不同溶媒中微粒數(shù)隨時間的變化（n=3）

3 討論

3.1 正交試驗(yàn)考察

中藥注射劑成分復(fù)雜，不溶性微粒數(shù)超標(biāo)有較大的安全隱患，可能引起炎癥、肉芽腫、熱原反應(yīng)等，以及血管物理方面的改變、血漿生化水平的改變等[9]。調(diào)配及與不同溶媒配伍過程中均會產(chǎn)生不溶性微粒增多現(xiàn)象，因此在考察注射用清開靈與不同溶媒配伍穩(wěn)定性試驗(yàn)前，應(yīng)選取最佳調(diào)配方法。本試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)法選取最佳調(diào)配方法。注射用清開靈說明書中規(guī)定，臨用前每支用5 ml注射用水溶解，故選擇注射用水為溶媒，選擇溶媒體積、振蕩頻率、振蕩時間為因素進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果，最佳調(diào)配方式為每支注射用清開靈（凍干）加5 ml滅菌注射用水，以1000 r/min頻率振蕩3 min溶解。

3.2 不同溶媒中穩(wěn)定性考察

溶媒的合理選擇是保障中藥注射劑穩(wěn)定性的前提，與不同溶媒配伍，pH值、澄明度、不溶性微粒、顏色會出現(xiàn)不同的變化，不當(dāng)?shù)呐湮闀?dǎo)致不良事件的發(fā)生[10]。另藥品從調(diào)配到患用藥會產(chǎn)生一定時間，時間過長藥效降低[11]，一般對于藥物穩(wěn)定性的研究限于 6 h 或 8 h 內(nèi)[12]。故本試驗(yàn)選擇了臨床上常見的4種溶媒，考察注射用清開靈與不同溶媒配伍后8 h內(nèi)的含量、不溶性微粒數(shù)、pH值的變化。結(jié)果，8 h內(nèi)各成品輸液中3種主成分含量隨時間的增加均出現(xiàn)下降的變化趨勢，這可能是由于配伍后pH值發(fā)生變化導(dǎo)致藥物的溶解度出現(xiàn)變化。各成品輸液的pH值8 h內(nèi)均逐漸降低，6 h時0.9 %氯化鈉輸液、10 %葡萄糖輸液pH值小于6.0，4 h時葡萄糖氯化鈉輸液、5 %葡萄糖輸液pH值小于6.0，易產(chǎn)生沉淀，不宜使用[13]。不溶性微粒方面，各成品輸液不溶性微粒數(shù)8 h內(nèi)均呈增多趨勢，6 h時5 %葡萄糖輸液、葡萄糖氯化鈉輸液不溶性微粒超出藥典要求，8 h時4種成品輸液不溶性微粒均超出藥典要求。

因此，臨床使用中，注射用清開靈（凍干）采用最佳調(diào)配方法溶解后，宜使用0.9 %氯化鈉或10 %葡萄糖注射液為溶媒，現(xiàn)用現(xiàn)配。若采用5 %葡萄糖注射液、葡萄糖氯化鈉注射液為溶媒，需在2 h內(nèi)使用。