添加火麻仁粕蛋白肽的發(fā)酵乳品質(zhì)特性分析

陳霞，肖瀟，王鵬，邵童，馬昕怡，顧瑞霞

（揚(yáng)州大學(xué)江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225000）

火麻仁別名大麻仁、麻仁、麻子，是一種藥食同源的油料作物，在我國的食用歷史長達(dá)3000多年[1]?；鹇槿实臓I養(yǎng)結(jié)構(gòu)和含量比例較為合理，脂肪酸含量為 25%~45%，其中不飽和脂肪酸占 90%以上；蛋白質(zhì)含量為20%~25%，包含8種人體必需氨基酸；此外還含有豐富的酚類物質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等有益成分[2]。目前火麻仁主要應(yīng)用于火麻油[3]、火麻蛋白提取[4]及生理活性功能開發(fā)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，火麻油具有較好的抗氧化和抗衰老作用，對慢性神經(jīng)炎、便秘和心腦血管等疾病也有一定的治療作用；火麻蛋白具有抗疲勞和提高免疫等作用[6]。

火麻榨油之后的剩余物稱為火麻仁粕，其中含有約30%的蛋白質(zhì)，且多為麻仁球蛋白和白蛋白，易被人體消化吸收[1]。但目前大多數(shù)火麻仁粕都被用作工業(yè)飼料，造成了大量高質(zhì)量植物蛋白資源的浪費(fèi)，所以如何有效利用火麻副產(chǎn)品資源，對于提升火麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。林金鶯等[7]研究了從火麻仁粕中提取蛋白質(zhì)，然后分步酶解蛋白質(zhì)制備抗氧化肽，經(jīng)分離純化后得到了兩種結(jié)構(gòu)獨(dú)特且具有較高抗氧化能力的多肽。魏連會等[8]通過動物實(shí)驗(yàn)研究了火麻籽多肽的降血脂功能，發(fā)現(xiàn)火麻籽多肽對高脂飲食喂養(yǎng)的大鼠具有一定的降脂作用；國外一些研究也證實(shí)火麻多肽具有較好的抗氧化和降血壓效果[9,10]，但還未見將火麻仁粕蛋白肽添加到酸奶中的相關(guān)文獻(xiàn)。

本研究采用堿溶酸沉法從火麻仁粕中提取蛋白，經(jīng)堿性蛋白酶水解后得到火麻仁粕蛋白肽（Hemp Seed Meal Protein Peptides，HSMPP），將HSMPP 添加到發(fā)酵乳中，研究不同添加量的HSMPP對發(fā)酵乳品質(zhì)特性的影響，為提高火麻綜合利用率和開發(fā)新型發(fā)酵乳提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

脫脂火麻仁粕，遼寧俏牌生物科技有限公司；全脂乳粉、脫脂乳粉，揚(yáng)大康源乳業(yè)有限公司；白砂糖，揚(yáng)州麥德龍超市采購；L.delbrueckii.subsp.bulgaricus142、S.thermophilus172、S.thermophilus100，江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保藏；堿性蛋白酶，浙江一諾生物科技有限公司；NaOH、HCl、濃H2SO4及其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

ZHJH-C1209B超凈工作臺，上海智城分析儀器制造有限公司；SPX-150BS生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；JF-SX-500全自動滅菌鍋，日本TOMY公司；5804R型高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；pHS-25型數(shù)顯pH計，梅特勒-托利多儀器有限公司；TMS-PRO質(zhì)構(gòu)儀，美國FTC公司；全自動凱氏定氮儀，北京盈盛恒泰科技有限責(zé)任公司；GYB60-08高壓均質(zhì)機(jī)，上海東華高壓均質(zhì)機(jī)廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 火麻仁粕蛋白的提取

參考林金鶯等[7]的方法，并略做修改。將干燥粉碎的脫脂火麻仁粕與水按1:12（W/W）混合，用1 mol/L NaOH調(diào)溶液pH為8.5，將其放于45 ℃，800 r/min的恒溫磁力攪拌器上攪拌1 h。攪拌完成后，在8000 r/min的條件下離心20 min，取上清液，用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)溶液pH為4.5。靜置沉降，于8000 r/min下離心15 min，取沉淀物，用蒸餾水洗滌至中性，冷凍干燥，得到火麻仁粕蛋白。

1.3.2 酶法水解火麻仁粕蛋白

將冷凍干燥的火麻仁粕蛋白用去離子水配制成濃度為0.05 g/mL的蛋白溶液，加入2000 U/g堿性蛋白酶，混勻，調(diào)節(jié)至最佳酶解溫度和pH，放于恒溫磁力攪拌器上，以200 r/min振蕩反應(yīng)12 h，然后于沸水中持續(xù)滅酶10 min。冷卻至室溫，將溶液調(diào)至中性，于8000 r/ min下離心15 min，收集上清液，即為火麻仁粕蛋白肽液（Hemp seed meal protein peptide，HSMPP）。

1.3.3 火麻仁粕蛋白水解度測定

采用凱氏定氮法測定原料的總氮含量，采用甲醛電位滴定法測定酶解產(chǎn)物氨基氮含量[11]，代入以下公式，得到肽液水解度：

1.3.4 火麻仁粕蛋白肽發(fā)酵乳制作工藝流程

12%復(fù)原乳+7%白砂糖+火麻仁粕蛋白肽液→混合→均質(zhì)→滅菌（95 ℃，10 min）→冷卻（40 ℃左右）→接種（3%）→發(fā)酵（42 ℃）→后熟（4 ℃，24 h）→成品

1.3.4.1 操作要點(diǎn)

用全脂奶粉配制12%的復(fù)原乳，往復(fù)原乳中加入7%的白砂糖和火麻仁粕蛋白肽液（0%、3%、6%、9%、12%），混合均勻后在55 ℃，20 MPa的條件下進(jìn)行均質(zhì)，均質(zhì)完于95 ℃水浴中滅菌10 min。冷卻至40 ℃左右，接入 3%的混合菌種（L.delbrueckiisubsp.bulgaricus142，S.thermophilus172和S.thermophilus100三種菌的體積比為1:1:1），于42 ℃發(fā)酵箱中發(fā)酵至凝乳，然后放于4 ℃冰箱中24 h后熟。

1.3.4.2 菌種活化

將保存在甘油管的L.delbrueckiisubsp.bulgaricus142接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；S.thermophilus172和S.thermophilus100接種于M17液體培養(yǎng)基中，42 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h?；罨瘍纱螅俳臃N于12%脫脂乳培養(yǎng)基中，凝乳后于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 凝乳時間測定

發(fā)酵乳滴定酸度達(dá)75 °T時為發(fā)酵完成，記錄時長。

1.3.6 質(zhì)構(gòu)特性測定

參考Guo等[12]的方法，采用TPA法測定酸奶的硬度、內(nèi)聚性、膠黏性、彈性和咀嚼性。使用12.7 mm圓柱形探頭，起始力為0.01 N，測試速度為6 cm/min，形變量為60%，壓縮間隔時間1 s。

1.3.7 pH值和滴定酸度測定

使用pHS-25型數(shù)顯pH計測定發(fā)酵乳的pH值；采用GB 5009.239-2016[13]中的酚酞指示劑法測定發(fā)酵乳的滴定酸度。

1.3.8 持水率測定

稱取一定質(zhì)量的發(fā)酵乳樣品置于 10 mL離心管中，8000 r/min下離心20 min，傾倒出上清液，測定上清液質(zhì)量。發(fā)酵乳的持水率計算公式如下：

1.3.9 活菌數(shù)測定

參考 GB 4789.35-2016[14]中的平板計數(shù)法測定發(fā)酵乳中的活菌數(shù)。

1.3.10 感官評價

評分小組由接受過感官評定培訓(xùn)的食品科學(xué)專業(yè)的5位男性和5位女性學(xué)生組成，按照表1評分標(biāo)準(zhǔn)對產(chǎn)品進(jìn)行感官評分。

表1 火麻仁粕蛋白肽發(fā)酵乳感官評分表Table 1 Sensory scoring table of hemp seed meal protein peptide fermented milk

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Spss 17.0和Origin 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析和作圖。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以p<0.05表示數(shù)據(jù)之間的顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 火麻仁粕蛋白水解時間對水解度的影響

由圖1所示，隨著酶解時間的延長，火麻仁粕蛋白的水解度呈上升趨勢，且前12 h上升速度較快，12 h后趨于平緩。說明絕大多數(shù)的火麻仁粕蛋白在12 h內(nèi)已被堿性蛋白酶酶解，12 h后由于底物濃度和酶濃度降低，且受酶解產(chǎn)物的抑制，使得酶解速率降低[15]。因此，選取酶解12 h的火麻仁粕蛋白肽液用于制備發(fā)酵乳，此時蛋白的水解度為16.62%。

圖1 火麻仁粕蛋白水解時間和水解度關(guān)系Fig.1 Relationship between hydrolysis time and degree of hydrolysis of hemp seed meal protein

2.2 火麻仁粕蛋白肽添加量對發(fā)酵乳凝乳特性的影響

由圖2所示，添加HSMPP的發(fā)酵乳凝乳時間均小于空白對照組，說明添加HSMPP能顯著縮短發(fā)酵乳發(fā)酵時間（p<0.05）。隨著HSMPP添加量的增加，發(fā)酵乳的凝乳時間呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢；其中HSMPP添加量為9%時發(fā)酵乳凝乳時間最短，為5.2 h，相比對照組縮短了 2.8 h。這可能是由于 HSMPP里的小分子肽段為乳酸菌的生長繁殖提供了充足的氮源，促進(jìn)了乳酸菌的增殖，使得發(fā)酵乳的酸度快速降低，進(jìn)而縮短了凝乳時間[16]。Lucas等[17]研究也發(fā)現(xiàn)酪蛋白水解物和乳清蛋白水解物能縮短酸乳的發(fā)酵時間。適度酶解的小分子肽段有較好的促凝乳效果，過度酶解的活性肽由于被聚合成了寡肽，反而會抑制凝乳[18,19]。

圖2 肽液添加量對發(fā)酵乳凝乳特性的影響Fig.2 The effect of added amount of peptide solution on the characteristics of fermented milk curd

2.3 不同火麻仁粕蛋白肽添加量對發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)的影響

由表2所知，與空白對照組相比，添加HSMPP顯著減小了發(fā)酵乳的硬度和膠黏性（p<0.05），顯著增大了發(fā)酵乳的彈性、內(nèi)聚性和咀嚼性（p<0.05），說明添加HSMPP改變了發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)特性。隨著HSMPP添加量的增加，發(fā)酵乳的硬度和膠黏性呈下降趨勢，彈性呈增大趨勢，內(nèi)聚性和咀嚼型呈先增大后降低的趨勢。但包一楓[12]的研究表明，添加全谷物酶解液的發(fā)酵乳，其硬度、膠黏性和咀嚼型均呈下降趨勢。發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)與固形物和蛋白質(zhì)的含量有關(guān)，而蛋白質(zhì)的種類、數(shù)量發(fā)生改變也會對發(fā)酵乳的凝膠結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，造成其質(zhì)構(gòu)特性的變化[20]?；鹇槿势芍兄饕氖锹槿是虻鞍缀桶椎鞍?，HSMPP的加入改變了體系中蛋白質(zhì)的組成和含量，導(dǎo)致質(zhì)構(gòu)發(fā)生改變，其中HSMPP添加量為6%時，內(nèi)聚性和咀嚼性最高。

表2 質(zhì)構(gòu)參數(shù)Table 2 Texture parameters

2.4 貯藏期內(nèi)火麻仁粕蛋白肽對發(fā)酵乳滴定酸度和pH值的影響

發(fā)酵乳在低溫貯藏過程中乳酸菌會繼續(xù)利用剩余的乳糖進(jìn)行發(fā)酵，過度發(fā)酵會發(fā)生乳清析出現(xiàn)象和出現(xiàn)過度酸味，進(jìn)而影響酸奶的感官，即后酸化現(xiàn)象[21]。滴定酸度和pH是衡量酸奶品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，滴定酸度代表發(fā)酵及后酸化過程中產(chǎn)生乳酸的程度，pH反映的是酸奶中處于電離狀態(tài)的活性H+濃度[22,23]。目前，研究主要從加工工藝（調(diào)整發(fā)酵劑的比例和組成[24]、高壓處理[25]和添加防腐劑[26]等）、誘變育種（物理誘變[27]和化學(xué)誘變[28]）和基因工程技術(shù)[29]等方面改善酸奶的后酸化現(xiàn)象。如圖可知，隨著儲藏天數(shù)的推移，樣品組和空白對照組的滴定酸度不斷上升，pH值不斷下降。由圖3可知，5組發(fā)酵乳樣品在4 ℃冷藏21 d期間滴定酸度呈逐漸上升趨勢，pH呈逐漸下降趨勢。其中空白對照組的酸度和pH變化幅度較大，滴定酸度由第1 d的82.34 °T上升到的92.45 °T，pH值由第1 d的4.51下降到4.20；添加了HSMPP發(fā)酵乳樣品的滴定酸度和pH值變化幅度較小，其中6%組樣品的酸度和pH變化幅度最小。這可能是因?yàn)镠SMPP的蛋白質(zhì)和多肽對有機(jī)酸具有一定的緩沖作用[30]，使得發(fā)酵乳在冷藏期間的酸度變化較平緩。說明添加HSMPP能緩解發(fā)酵乳貯藏后期的后酸化現(xiàn)象，對提高發(fā)酵乳貯藏性有積極作用。趙強(qiáng)忠等[31]研究也表明，添加大豆分離蛋白酶解產(chǎn)物能緩解酸奶貯藏期的后酸化。

圖3 貯藏期內(nèi)發(fā)酵乳滴定酸度和pH值變化Fig.3 Changes of titration acidity and pH value of fermented milk during storage

2.5 貯藏期內(nèi)火麻仁粕蛋白肽對發(fā)酵乳持水力的影響

持水率是評價發(fā)酵乳貯藏穩(wěn)定性的關(guān)鍵指標(biāo)之一，它可以從側(cè)面反映發(fā)酵乳的蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)對水份的保持能力。持水率越高，凝膠網(wǎng)絡(luò)越致密，乳清越不容易析出，發(fā)酵乳在運(yùn)輸及銷售過程中的穩(wěn)定性越強(qiáng)。由圖4可知，對照組的持水率在前14 d都比較穩(wěn)定，14 d后顯著下降，說明在貯藏后期其穩(wěn)定性下降。相比之下，HSMPP添加量為3%、6%和9%的發(fā)酵乳的持水率較穩(wěn)定，第21 d的持水率顯著高于對照組和添加量為12%的樣品組（p<0.05），其中添加量為6%的發(fā)酵乳的穩(wěn)定性最好。說明添加適量的HSMPP可以增強(qiáng)蛋白膠粒網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)體系穩(wěn)定性，這可能是因?yàn)镠SMPP里的游離氨基酸增強(qiáng)了發(fā)酵乳體系的極性基團(tuán)，極性氨基酸分子與水分子穩(wěn)定結(jié)合，進(jìn)而提高靜電作用，所以持水能力也隨之增強(qiáng)；但添加過多的HSMPP反而會破壞了發(fā)酵乳體系中分子之間的靜電作用而導(dǎo)致發(fā)酵乳品質(zhì)下降[32]。董世榮等[33]研究也表明，膠原蛋白肽的添加可顯著提高酸奶持水率。

圖4 貯藏期內(nèi)發(fā)酵乳持水率的變化Fig.4 Changes in the water holding rate of fermented milk during storage

2.6 貯藏期內(nèi)火麻仁粕蛋白肽對發(fā)酵乳活菌數(shù)的影響

由圖5可知，5組發(fā)酵乳在貯藏期內(nèi)的活菌數(shù)呈先上升后下降的趨勢，對照組第1 d的活菌數(shù)為9.09 log cfu/g，第21 d時活菌數(shù)降到8.92 log cfu/g。這是因?yàn)槿樗峋x產(chǎn)酸使體系的酸度持續(xù)上升，抑制了乳酸菌的生長。另一方面由于儲藏后期體系中營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，菌體開始衰老死亡，所以活菌數(shù)下降[34]。添加了HSMPP的4組樣品在冷藏的前14 d活菌數(shù)呈緩慢增加增加趨勢，在第14 d后活菌數(shù)開始下降，但均顯著高于對照組（p<0.05），其中添加量為6%和9%的樣品顯著高于對照組（p<0.01）。說明HSMPP中的一些游離氨基酸可以促進(jìn)乳酸菌生長，為乳酸菌生長提供了對照組所沒有的營養(yǎng)基質(zhì)，所以在儲藏期內(nèi)，樣品組的活菌數(shù)一直保持在較高的狀態(tài)。張清麗等[19]研究也表明，將酪蛋白水解物添加到酸乳中能夠明顯提高其貯藏期內(nèi)的活菌數(shù)。

圖5 貯藏期發(fā)酵乳活菌數(shù)的變化Fig.5 Changes in the number of viable cells of fermented milk during storage

2.7 貯藏期間火麻仁粕蛋白肽添加量對發(fā)酵乳感官評價的影響

由圖6可知，在4 ℃貯藏21 d期間，5組發(fā)酵乳樣品的感官評分呈先上升后下降的趨勢，其中對照組和添加量為12%的發(fā)酵乳的感官評分在第7 d后便開始下降，其他3組在14 d后才開始下降，說明在貯藏后期隨著酸度上升和持水率下降，發(fā)酵乳的品質(zhì)開始下降。其中HSMPP添加量為6%的樣品的感官評分最高，在21 d的貯藏期內(nèi)，該發(fā)酵乳風(fēng)味和質(zhì)地較為穩(wěn)定，呈乳白色，具有發(fā)酵乳和火麻仁粕肽液特有的香氣，到貯藏后期組織較均勻細(xì)膩，無乳清析出；HSMPP添加量為 3%的發(fā)酵乳樣品肽液香氣不明顯；添加量為9%和12%的發(fā)酵乳樣品肽液味較重，略帶苦味，到儲藏后期乳清析出較多，對發(fā)酵乳品質(zhì)產(chǎn)生不良影響。

圖6 感官評分Fig.6 Sensory score

3 結(jié)論

采用堿溶酸沉法從火麻仁粕中提取蛋白，經(jīng)堿性蛋白酶水解12 h后制得水解度為16.62%的HSMPP。利用 HSMPP、復(fù)原乳和白砂糖制備具有火麻蛋白肽香氣，高蛋白含量的保健發(fā)酵乳，研究發(fā)現(xiàn)添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的HSMPP后能縮短發(fā)酵乳的凝乳時間，降低發(fā)酵乳的酸度、硬度和膠黏性，提高發(fā)酵乳的內(nèi)聚性和彈性；添加HSMPP能延緩發(fā)酵乳在4 ℃貯藏21 d期間的后酸化程度，提高發(fā)酵乳的持水性和活菌數(shù)，其中 HSMPP添加量為 6%的火麻仁粕蛋白肽發(fā)酵乳綜合各項(xiàng)指標(biāo)品質(zhì)最優(yōu)，且在貯藏期內(nèi)保持了較高的活菌數(shù)和感官品質(zhì)，第 14 d時持水率達(dá)最高值31.24%，第21 d時活菌數(shù)為9.23 log cfu/g，感官評分為86分，為火麻仁粕蛋白肽發(fā)酵乳的最佳添加量。