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    牛乳中β-乳球蛋白檢測(cè)方法的建立

    2021-09-02 03:39:44楊?lèi)?ài)君紀(jì)坤發(fā)楊美豐利志鋒邢益俊何瑛
    現(xiàn)代食品科技 2021年8期
    關(guān)鍵詞:牛乳回收率試樣

    楊?lèi)?ài)君,紀(jì)坤發(fā),楊美豐,利志鋒,邢益俊,何瑛

    (廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司,廣東廣州 510700)

    牛乳中蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高,是人類(lèi)不可缺少的營(yíng)養(yǎng)食品。牛乳蛋白質(zhì)主要有酪蛋白和乳清蛋白,其中酪蛋白成分約80%,乳清蛋白成分約20%;乳清蛋白中的β-乳球蛋白是主要組分,約占乳清蛋白的50%[1]。牛乳中的β-乳球蛋白分子質(zhì)量約為180000 u,等電點(diǎn)為5.1~5.3,一共由162個(gè)氨基酸殘基組成,有2個(gè)遺傳變異體。β-乳球蛋白在牛乳中主要以二聚體形式存在,由非共價(jià)鍵連接的2個(gè)單位亞基組成。在pH<3.5或pH>8.0時(shí),β-乳球蛋白二聚體解離成單體。每個(gè)單體含有 2個(gè)二硫鍵Cys66-Cys160和Cys106-Cys199,還有1個(gè)Cys121自由硫氫基[2]。β-乳球蛋白具有多種生物學(xué)活性,在食品加工中有一定的應(yīng)用;同時(shí)還具有降血壓、抗菌、抗氧化、抗癌、免疫調(diào)節(jié)、降膽固醇等功效[3]。研究發(fā)現(xiàn),β-乳球蛋白是牛乳中主要的熱敏感蛋白質(zhì),過(guò)度加熱會(huì)造成β-乳球蛋白變性并與乳中其他蛋白質(zhì)形成大分子結(jié)構(gòu)[4-6]。因此,檢測(cè)牛乳中β-乳球蛋白含量可以判斷牛乳熱處理程度,對(duì)研究牛乳熱處理方式的選擇具有重大的意義。

    目前,檢測(cè)牛乳中β-乳球蛋白含量還沒(méi)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),已發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)中有農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1663-2008《乳與乳制品中β-乳球蛋白的測(cè)定 聚丙烯胺凝膠電泳法》[7]和團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/TDSTIA 007-2019《奶及奶制品中β-乳球蛋白的測(cè)量 液相色譜法》[8]。其中《乳與乳制品中β-乳球蛋白的測(cè)定 聚丙烯胺凝膠電泳法》試樣用SDS-PAGE凝膠電泳后,用光密度計(jì)對(duì)β-乳球蛋白進(jìn)行測(cè)定分析而求得β-乳球蛋白的含量,該標(biāo)準(zhǔn)液態(tài)樣品的檢出限為240 mg/L,固液態(tài)和固體樣品的檢出限為2400 mg/kg[7];《奶及奶制品中β-乳球蛋白的測(cè)量 液相色譜法》通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行調(diào)酸到 pH至 4.60時(shí),酪蛋白及變性的乳清蛋白可以通過(guò)沉淀去除,濾液中未變性的β-乳球蛋白經(jīng)離心后在高效液相色譜儀上,經(jīng)蛋白質(zhì)分離柱分離,選擇210 nm檢測(cè)波長(zhǎng),紫外光檢測(cè),外標(biāo)法定量,該標(biāo)準(zhǔn)生乳、液態(tài)奶的定量限為25.0 mg/kg,乳粉的定量限為50.0 mg/kg[8]。前者操作方法繁雜,檢出限高,后者檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng),均不適用于企業(yè)日??焖俜治鰴z測(cè)。

    本文主要是開(kāi)發(fā)用超高效液相色譜法(Ultra Performance Liquid Chromatography,UPLC)來(lái)測(cè)定牛乳中β-乳球蛋白的含量的方法[9-19]。該方法前處理簡(jiǎn)便、分析時(shí)間短、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、精密度好,能夠準(zhǔn)確而又快速檢測(cè)牛乳中β-乳球蛋白含量。根據(jù)GB/T 27417-2017《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》[20]通過(guò)加標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果從線(xiàn)性范圍、精密度、正確度三個(gè)方面來(lái)驗(yàn)證方法的可行性。該方法為乳及乳制品中β-乳球蛋白檢測(cè)提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    Waters H-CLASS超高效液相色譜儀(配有PDA檢測(cè)器),美國(guó)Waters公司;Waters BEH C4色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm粒徑),美國(guó)Waters公司;Mettler Tledo XSR205DU電子分析天平,瑞士Mettler Tledo公司;Minipole 超純水系統(tǒng),默克化工;Sigma 2-16KL冷凍離心機(jī),德國(guó)Sigma公司;移液器,德國(guó)Brand公司;Waters GHP針式濾膜,美國(guó)Waters公司。

    乙腈、三氟乙酸(色譜純),德國(guó) Merck公司;冰醋酸(優(yōu)級(jí)純),廣州化學(xué)試劑廠(chǎng);β-乳球蛋白(L-046-100 MG),純度:97.23%,Sigm a-Aldrich公司;本試驗(yàn)中用水符合GB/T 6682-2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》[21]中一級(jí)水的規(guī)定。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 試驗(yàn)原理

    牛乳中酪蛋白的等電點(diǎn)為4.60,因此當(dāng)牛乳試樣pH至4.60時(shí),酪蛋白及變性的乳清蛋白可以通過(guò)沉淀去除,濾液中未變性的β-乳球蛋白經(jīng)超高效液相色譜儀分離,經(jīng) PDA檢測(cè)器測(cè)定,外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)定量[8]。

    1.2.2 試樣前處理

    準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g試樣于50 mL離心管,加水至25 mL,混勻后再加入冰醋酸調(diào)節(jié)pH為4.60±0.05,渦旋震蕩1 min,然后室溫靜置60 min,待試樣沉淀分層,將試樣高速離心(10000 r/min,4 ℃,15 min),取1 mL上清液,稀釋至適當(dāng)濃度,過(guò)0.20 μm針式濾膜,進(jìn)行UPLC檢測(cè)[5]。

    1.2.3 溶劑的配制

    很多朋友對(duì)排卵期出血并不陌生,也有一些病人跑來(lái)門(mén)診就說(shuō):“醫(yī)生,我排卵期出血,要吃什么藥?”其實(shí),排卵期出血應(yīng)該是一種排除性疾病,就是說(shuō)需要排除其他可能引起月經(jīng)間期出血的疾病之后才能判斷下來(lái)。

    流動(dòng)相①(0.1%三氟乙酸水溶液):取900 mL一級(jí)水倒入1 L的容量瓶中,加入1 mL三氟乙酸后立即蓋上蓋子,輕搖至三氟乙酸全部溶解沒(méi)有霧氣,用一級(jí)水定容至刻度線(xiàn),將容量瓶中的溶液全部轉(zhuǎn)移至棕色藍(lán)蓋瓶中,超聲脫氣10 min;流動(dòng)相②(0.085%三氟乙酸乙腈溶液):取900 mL乙腈倒入1 L的容量瓶中,加入0.85 mL三氟乙酸后立即蓋上蓋子,輕搖至三氟乙酸全部溶解沒(méi)有霧氣,用乙腈定容至刻度線(xiàn),將容量瓶中的溶液全部轉(zhuǎn)移至棕色藍(lán)蓋瓶中,超聲脫氣10 min;強(qiáng)洗溶液(90%乙腈水溶液):取900 mL乙腈倒入1 L的容量瓶中,用一級(jí)水定容至刻度線(xiàn),將容量瓶中的溶液全部轉(zhuǎn)移至棕色藍(lán)蓋瓶中,超聲脫氣 15 min;弱洗溶液(10%乙腈水溶液):取100 mL乙腈倒入1 L的容量瓶中,用一級(jí)水定容至刻度線(xiàn),將容量瓶中的溶液全部轉(zhuǎn)移至棕色藍(lán)蓋瓶中,超聲脫氣15 min。

    1.2.4 色譜條件

    經(jīng)過(guò)測(cè)試,超高效液相色譜儀的色譜條件如表1。

    表1 洗脫梯度Table 1 Elution gradient

    色譜柱:Waters BEH C4 100 mm×2.1 mm,1.7 μm粒徑;進(jìn)樣量:10 μL;柱溫:60 ℃;流速:0.5 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm;流動(dòng)相:流動(dòng)相①為0.1%三氟乙酸水溶液、流動(dòng)相②為0.085%三氟乙酸乙腈溶液;洗脫梯度:見(jiàn)表1。

    1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)的制作

    1.3.1β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液(9211.57 mg/L)的配制

    準(zhǔn)確稱(chēng)取94.74 mg的β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(純度:97.23%)于50 mL的燒杯中,記錄稱(chēng)樣量,用少量一級(jí)水進(jìn)行溶解,并轉(zhuǎn)移定容到10 mL容量瓶中,得到濃度為9211.57 mg/L的β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液;

    1.3.2β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

    取2 mL超高效液相色譜儀進(jìn)樣瓶5個(gè),用移液器分別準(zhǔn)確吸取 8.14 μL、16.28 μL、24.42 μL、32.56 μL、65.12 μLβ-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液(9211.57 mg/L),用一級(jí)水定容至1.5 mL,配置成濃度為50、100、150、200、400 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

    β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作溶液通過(guò)超高效液相色譜儀分析,以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液色譜峰面積為橫坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)。

    1.4 計(jì)算

    1.4.1 試樣檢測(cè)

    將待測(cè)溶液上機(jī)檢測(cè),根據(jù)計(jì)算公式得到試樣中β-乳球蛋白的含量。

    1.4.2 計(jì)算公式

    試樣中的β-乳球蛋白的含量X按以下公式計(jì)算:

    式中:X表示試樣中β-乳球蛋白的含量,mg/kg;c表示待測(cè)樣液中β-乳球蛋白濃度,mg/L;V表示加入水后定容體積,mL;m表示吸取試樣的質(zhì)量,g;F表示待測(cè)上清液稀釋倍數(shù);β-乳球蛋白的含量以β-乳球蛋白A和β-乳球蛋白B含量之和計(jì)。

    1.4.3 數(shù)據(jù)處理

    本方法所有試驗(yàn)均重復(fù)測(cè)定 6次,采用 Waters Empowe 3(版本號(hào):7.30.00.00)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

    2 結(jié)果與分析

    根據(jù)GB/T 27417-2017《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》[20]通過(guò)加標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果從線(xiàn)性范圍、精密度、正確度三個(gè)方面來(lái)驗(yàn)證方法的可行性。

    2.1 濃度范圍、變異系數(shù)、回歸方程、相關(guān)系數(shù)

    對(duì)β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行上機(jī)檢測(cè),標(biāo)準(zhǔn)工作溶液每個(gè)濃度點(diǎn)按 1.2.4的色譜條件重復(fù)測(cè)定 6次,得到標(biāo)準(zhǔn)工作溶液每個(gè)濃度點(diǎn)的色譜平均峰面積及其變異系數(shù)(CV),標(biāo)準(zhǔn)工作溶液色譜平均峰面積如表2,標(biāo)準(zhǔn)工作溶液色譜圖如圖1。

    圖1 β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖50(mg/L)Fig.1 Standard working solution chromatogram 50 (mg/L)

    表2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液色譜平均峰面積Table 2 Average peak area of standard working solution chromatography

    從表2可知,本方法采用校準(zhǔn)曲線(xiàn)法定量,標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)的濃度范圍為50~400 mg/L,標(biāo)準(zhǔn)工作溶液每個(gè)濃度點(diǎn)重復(fù)測(cè)定 6次,變異系數(shù)(CV)在0.04%~0.23%之間符合標(biāo)準(zhǔn)要求,適合用于實(shí)際分析檢測(cè)。

    以β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作溶液色譜平均峰面積為橫坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),做線(xiàn)性回歸方程,得到β-乳球蛋白測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)濃度范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)。β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)濃度范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)如表3,標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)如圖2。

    從表3、圖2得到β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)的濃度范圍(50~400 mg/L)、回歸方程(y=6E-05x+4.2877)、相關(guān)系數(shù)(R2=1.00)。本方法用校準(zhǔn)曲線(xiàn)法定量,標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)在50~400 mg/L的濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性良好,R2等于1.00,符合GB/T 27417-2017《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》[20]采用校準(zhǔn)曲線(xiàn)法定量,線(xiàn)性回歸方程的相關(guān)系數(shù)不低于0.99的要求,可用于實(shí)際分析檢測(cè)。

    表3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)濃度范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)Table 3 Standard working curve concentration range,regression equation, correlation coefficient

    圖2 β-乳球蛋白的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)Fig.2 Standard working curve for-lactoglobulin

    2.2 準(zhǔn)確性和精密度

    2.2.1 試樣的檢測(cè)

    因?yàn)楦邷丶訜釙?huì)使牛乳中β-乳球蛋白失去活性,所以分別使用某公司生產(chǎn)的超高溫滅菌乳和巴氏殺菌乳按1.2的試驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè),每個(gè)樣品設(shè)置6個(gè)平行試驗(yàn),并與第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)(北京畜牧研究所)的結(jié)果對(duì)比,檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4,超高溫滅菌乳、巴氏殺菌乳β-乳球蛋白色譜圖見(jiàn)圖3、圖4。

    圖3 超高溫滅菌乳β-乳球蛋白色譜圖Fig.3 Chromatogram of high temperature sterilization milk β-lactoglobulin

    圖4 巴氏殺菌乳β-乳球蛋白色譜圖Fig.4 Chromatogram of pasteurized milk β-lactoglobulin

    從圖3、圖4、表4可知超高溫滅菌乳的β-乳球蛋白含量為25.39 mg/kg,變異系數(shù)為0.92%,巴氏殺菌乳的β-乳球蛋白含量為3541.39 mg/kg,變異系數(shù)為0.14%,兩種殺菌乳的重復(fù)測(cè)試穩(wěn)定性較好,變異系數(shù)<1%,符合實(shí)際分析的要求;兩種殺菌乳的檢測(cè)結(jié)果與第三方機(jī)構(gòu)檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異,偏差<1%。

    表4 超高溫滅菌乳、巴氏殺菌乳β-乳球蛋白含量Table 4 The content of ultra-high temperature sterilization milk and pasteurized milk-lactoglobulin

    2.2.2 回收率和變異系數(shù)

    從 2.2.1的試驗(yàn)結(jié)果默認(rèn)超高溫滅菌乳為低本底β-乳球蛋白含量,巴氏殺菌乳為高本底β-乳球蛋白含量,添加β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率測(cè)定,超高溫滅菌乳β-乳球蛋白的具體添加量為200,300,400 mg/kg,巴氏殺菌乳β-乳球蛋白的具體添加量為2500,3200,4000 mg/kg,每個(gè)濃度的陽(yáng)性試樣設(shè)置六個(gè)平行試驗(yàn),計(jì)算陽(yáng)性試樣的加標(biāo)回收率及變異系數(shù)(CV),以評(píng)估方法精密度和正確度。陽(yáng)性試樣的加標(biāo)回收率及變異系數(shù)(CV),見(jiàn)表5。

    表5 陽(yáng)性試樣添加回收試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Positive sample addition recovery test results

    根據(jù)GB/T 27417-2017《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》附錄 A要求,當(dāng)被測(cè)組分加標(biāo)濃度>100 mg/kg時(shí),被測(cè)組分加標(biāo)回收率范圍在95%~105%之間;標(biāo)準(zhǔn)的附錄B要求,被測(cè)組分含量在 100 mg/kg~1000 mg/kg時(shí),測(cè)試結(jié)果的變異系數(shù)<3.8%;當(dāng)被測(cè)組分含量在0.1%~1%時(shí),測(cè)試結(jié)果的變異系數(shù)<2.7%[6]。

    從表5可知,低本底的超高溫滅菌乳β-乳球蛋白陽(yáng)性試樣的平均加標(biāo)回收率在97.15%~99.11%之間,變異系數(shù)(CV)在0.53%~0.71%之間;高本底的巴氏殺菌乳β-乳球蛋白陽(yáng)性試樣的平均加標(biāo)回收率在96.56%~98.43%之間,變異系數(shù)(CV)在0.04%~0.15%之間??梢?jiàn)陽(yáng)性試樣的本底值無(wú)論高還是低,本方法的精密度和正確度均符合上述標(biāo)準(zhǔn)要求。本方法加標(biāo)回收率穩(wěn)定,重現(xiàn)性高,可作為實(shí)際試樣的準(zhǔn)確定量檢測(cè)方法。

    2.3 討論

    目前測(cè)定β-乳球蛋白含量的方法很多,高星等建立的超高效液相色譜法可以快速檢測(cè)牛乳中β-乳球蛋白含量,該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性(R2=0.99),方法回收率(70%~90%),變異系數(shù)(CV=0.93%~3.22%),檢出限為40.0 mg/kg[22];趙大偉等研究設(shè)計(jì)了可用于分析牛乳中β-乳球蛋白的高效液相色譜法,該方法分析時(shí)間長(zhǎng)(t=30 min),標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性(R2=0.99),暫無(wú)寫(xiě)出方法回收率,變異系數(shù)(CV=2.9%)[23];孫國(guó)慶等研究設(shè)計(jì)了可分析牛乳中β-乳球蛋白的毛細(xì)管電泳法,該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性(R2=0.99),方法回收率(75.2%~105.2%),變異系數(shù)(CV=1.09%~3.1%)[24]。而我們建立的使用超高效液相色譜法對(duì)牛乳中β-乳球蛋白進(jìn)行檢測(cè)的方法,其標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性(R2=1.00),方法回收率(96.56%~99.11%),變異系數(shù)(CV=0.04%~0.71%),分析檢測(cè)時(shí)間(t=9 min),檢出限為20.41 mg/kg,方法定量限為61.23 mg/kg,均比上述方法有一定的優(yōu)勢(shì),具有前處理簡(jiǎn)便、分析時(shí)間短、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、精密度好等優(yōu)點(diǎn),能夠準(zhǔn)確而又快速檢測(cè)牛乳中β-乳球蛋白含量。

    3 結(jié)論

    本文建立了超高效液相色譜法檢測(cè)巴氏殺菌乳和超高溫滅菌乳中β-乳球蛋白含量的方法。通過(guò)驗(yàn)證表明,該方法線(xiàn)性關(guān)系良好(R2=1.00),平均回收率在96.56%~99.11%之間,變異系數(shù)在0.04%~0.71%之間,β-乳球蛋白方法檢出限為20.41 mg/kg(S/N=3),方法定量限為61.23 mg/kg,符合標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27417-2017《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》的要求。該方法簡(jiǎn)便易行、定量準(zhǔn)確、精密度好,可用于液態(tài)乳中β-乳球蛋白的定量分析測(cè)定。

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