SARS-CoV-2 Spike蛋白誘導(dǎo)人腎上皮細(xì)胞 周期阻滯及細(xì)胞凋亡

梁文翰, 毛瑩瑩, 賈敏, 胡志明, 李金龍, 李紅衛(wèi)*

(1.南方醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)與生物技術(shù)學(xué)院， 廣東 廣州 510515；2.南方醫(yī)科大學(xué) 皮膚病醫(yī)院/廣東省皮膚病醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 廣東 廣州 510515)

自2019年12月，由新型冠狀病毒SARS-CoV-2引起的嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)疾病迅速流行，成為影響幾乎所有國(guó)家的流行病[1].在短時(shí)間內(nèi)，這種感染已導(dǎo)致全球大流行，并已成為對(duì)當(dāng)今人類社會(huì)生存的重大威脅[2-4].根據(jù)世界衛(wèi)生組織公布信息，截至2020年11月17日，全球已有超過5 400萬確證病例，造成超過132萬人死亡.

冠狀病毒由一個(gè)大而多樣的包膜正鏈RNA病毒家族組成，其基因組長(zhǎng)約27～32 kb[5].SARS-CoV-2在結(jié)構(gòu)上主要有四種結(jié)構(gòu)蛋白：膜蛋白(membrane protein，M蛋白)，核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，N蛋白)，包膜蛋白(envelope protein，E蛋白)和刺突蛋白(spike protein，S蛋白)[6].其中SARS-CoV-2 S蛋白由2個(gè)亞基組成：S1亞基介導(dǎo)與宿主細(xì)胞受體結(jié)合，S2亞基介導(dǎo)病毒膜和細(xì)胞膜的融合，其中受體結(jié)合位區(qū)(receptor-binding domain, RBD)位于S1亞基上[7-8].SARS-CoV-2 S蛋白以三聚體的形式組成病毒顆粒外膜表面的刺突，其主要負(fù)責(zé)識(shí)別宿主細(xì)胞表面受體血管緊張素轉(zhuǎn)移酶2(angiotensin I-converting enzyme 2, ACE2)，從而介導(dǎo)與宿主細(xì)胞的融合[9-11].研究表明，SARS-CoV-2的S蛋白與ACE2的親和力更強(qiáng)，約比SARS的結(jié)合能力要高出10～20倍，這提示表達(dá)ACE2的細(xì)胞更容易受到SARS-CoV-2 的感染[7].

SARS-CoV-2 感染引起的COVID-19引起了全球的關(guān)注，隨著研究的不斷深入，SARS-CoV-2感染與全身多臟器受損間的關(guān)系及SARS-CoV-2感染的機(jī)制陸續(xù)得到揭示[12].文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)COVID-19患者最常見的腎臟功能異常是輕度至中度蛋白尿[13].只有一小部分血漿蛋白被腎小球過濾，并且大多數(shù)被近端腎小管有效地吸收，因此在正常尿液中基本上沒有蛋白出現(xiàn).腎小球?yàn)V過屏障取決于其三個(gè)組成部分上皮細(xì)胞、腎小球基底膜和足細(xì)胞的功能[14]，而最近已經(jīng)確定了SARS-CoV-2與足細(xì)胞的親和力，其可能影響腎小球?yàn)V過功能并引起濾過血漿蛋白增加[15].然而SARS-CoV-2感染引發(fā)急性腎衰竭的相關(guān)機(jī)制仍有待研究.HK-2細(xì)胞是人腎小管上皮細(xì)胞，高表達(dá)ACE2，屬于SARS-CoV-2 的易感細(xì)胞，而HEK293T(以下簡(jiǎn)稱293T)細(xì)胞屬于人腎上皮細(xì)胞系，來源于人胚胎腎細(xì)胞，其幾乎不表達(dá)胞外配體所需要的受體，是科學(xué)研究最常用的腎上皮細(xì)胞之一[16].本研究利用SARS-CoV-2 S蛋白重組慢病毒載體，探討其誘導(dǎo)的SARS-CoV-2 S蛋白過表達(dá)對(duì)腎上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)的影響及相關(guān)機(jī)制，為研究SARS-CoV-2 感染后期發(fā)生腎功能損傷的原因提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

HK-2細(xì)胞株、293T細(xì)胞株購(gòu)自ATCC，慢病毒載體質(zhì)粒由南方醫(yī)科大學(xué)生物治療研究所保存.SARS-CoV-2 S蛋白質(zhì)粒(VG40589-UT)購(gòu)自北京義翹神州有限公司.限制性內(nèi)切酶Nhe I和Mlu I、T4 DNA連接酶均購(gòu)自美國(guó)New England Biolabs公司； CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)自東京同仁公司；細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、體積分?jǐn)?shù)為0.25%的Trypsin(EDTA)、PBS粉末和胎牛血清均購(gòu)自Gibco；細(xì)菌培養(yǎng)用抗生素、瓊脂粉、100×雙抗購(gòu)自美國(guó)?？寺」荆坏鞍譓arker、DNA Marker購(gòu)自北京康潤(rùn)科技有限公司； Trizol裂解液、Primer STAR、逆轉(zhuǎn)錄試劑和SYBR Premix Ex TaqTM均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；細(xì)胞周期流式檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞凋亡流式檢測(cè)試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；Caspase-3抑制劑購(gòu)自美國(guó)Santa公司，Caspase-8，Caspase-9抑制劑購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；使用的一抗均購(gòu)自CST公司；HRP標(biāo)記抗羊鼠二抗購(gòu)自杭州弗德生物科技有限公司.

超凈臺(tái)(雙人單面)購(gòu)自力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾公司；凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)GE ImageQuant公司；倒置顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司；小型高速冷凍離心機(jī)(5910型)購(gòu)自德國(guó)艾本德(Eppendorf)公司；超低溫冰箱購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾公司；FACSCelestaTM流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司.

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HK-2細(xì)胞使用DMEM/F12培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)為1%的青霉素和體積分?jǐn)?shù)為1%的鏈霉素)，置于37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；293T細(xì)胞用 DMEM培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)為1%的青霉素和體積分?jǐn)?shù)為1%的鏈霉素)，置于37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.2.2 目的基因及引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)北京義翹神州有限公司提供的SARS-CoV-2 S蛋白質(zhì)粒(VG40589-UT)的基因序列，在5’及3’端分別加入Nhe Ⅰ和Mlu Ⅰ酶切位點(diǎn)，同時(shí)設(shè)計(jì)相關(guān)的引物序列(表1)，交由擎科生物科技有限公司合成.

表1 引物及序列Table 1 Primers and sequences

1.2.3 載體質(zhì)粒的構(gòu)建

SARS-CoV-2 S蛋白質(zhì)粒(VG40589-UT)作為模板用PCR擴(kuò)增出S基因全長(zhǎng)，用Nhe Ⅰ和Mlu Ⅰ對(duì)PCR產(chǎn)物和慢病毒載體質(zhì)粒pLV-CMV-IRES-eGFP進(jìn)行雙酶切，將酶切所得產(chǎn)物凝膠電泳后按片段大小進(jìn)行切膠回收.將回收到的S片段和載體片段用T4 DNA連接酶16℃過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，第二天從細(xì)菌平板挑取單克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)增并提取質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒命名為pLV-CMV-S-IRES-eGFP，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定.

1.2.4 慢病毒載體的包裝、濃縮及滴度測(cè)定

病毒包裝使用三質(zhì)粒系統(tǒng)，將pLV-CMV-S-IRES-eGFP與輔助質(zhì)粒VSVG和輔助質(zhì)粒psPAX2按體積比4∶1∶3的比例轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，在37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清并用100KD超濾管進(jìn)行超濾濃縮，得到慢病毒LV-CMV-IRES-eGFP (以下簡(jiǎn)稱為L(zhǎng)V-GFP)以及慢病毒LV-CMV-S-IRES-eGFP (以下簡(jiǎn)稱為L(zhǎng)V-S).用RT-PCR檢測(cè)兩種病毒的感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)，保存于-80 ℃冰箱.

1.2.5 建立慢病毒感染細(xì)胞模型

選擇狀態(tài)良好的HK-2及293T細(xì)胞以1×106/孔均勻鋪于6孔板中，在37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的環(huán)境中培養(yǎng)24 h.在第2天，棄去培養(yǎng)基，以MOI為100加入稀釋好的LV-S病毒液-聚凝胺(polybrene終質(zhì)量濃度為8 mg/L)培養(yǎng)基混合液，將細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中，12 h后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng).72 h后使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞感染熒光蛋白表達(dá)情況.

1.2.6 細(xì)胞活力檢測(cè)

(1)EdU法檢測(cè)細(xì)胞增殖 在細(xì)胞感染慢病毒后，將培養(yǎng)基換成含10 μmol/L EdU培養(yǎng)液孵育2 h，PBS緩沖液清洗，多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，經(jīng)甘氨酸脫色和體積分?jǐn)?shù)為0.5%的TritonX-100通透，后續(xù)步驟按照說明書進(jìn)行.每個(gè)孔隨機(jī)取3個(gè)200倍視野，熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)并拍照.

(2)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種到96孔板中，細(xì)胞貼壁后按MOI為100加入慢病毒，72 h后加入100 μL含體積分?jǐn)?shù)為10%的CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑的新鮮培養(yǎng)基，孵育1 h，用酶標(biāo)儀讀取450 nm各孔的吸光度.

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡

(1)檢測(cè)細(xì)胞周期 經(jīng)離心收集1×106細(xì)胞，用PBS緩沖液洗2次，加入-20 ℃預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，低溫固定過夜.離心后收集細(xì)胞，PBS水化，清洗1次，加入1 mL DNA staining solution和10 μL PI 混勻后 4 ℃避光孵育30 min，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè).

(2)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 經(jīng)離心收集1×106細(xì)胞，用PBS緩沖液洗2次，按說明書加入Annexin V-FITC，室溫孵育15 min，用Binding Buffer洗1次，重懸細(xì)胞，加入PI染色液，避光孵育10 min，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè).

1.2.8 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡的基因表達(dá)

用RNAiso Plus提取HK-2及293T細(xì)胞總RNA，酶標(biāo)儀測(cè)得RNA質(zhì)量濃度.以每反應(yīng)體系1 μg加入RNA，以37 ℃持續(xù)15 min, 85 ℃持續(xù)5 min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；然后按照試劑盒說明書設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)PCR程序.每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次并取其均值.

1.2.9 Western Blot檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)

在細(xì)胞感染慢病毒72 h后，提取HK-2及293T細(xì)胞總蛋白，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的凝膠中以200 V，40 min的條件電泳，并以200 mA，1.5 h的條件電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上.質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的脫脂奶粉封閉后，以V抗體∶V抗體稀釋液=1∶1 000稀釋一抗，并置于4 ℃冰箱孵育過夜，洗滌后，以V抗體∶V抗體稀釋液=1∶10 000稀釋二抗并室溫孵育1 h. 使用ECL發(fā)光液檢測(cè)各組細(xì)胞中周期、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)量，利用Image quant軟件測(cè)量發(fā)光強(qiáng)度.使用Image J軟件對(duì)蛋白質(zhì)條帶灰度進(jìn)行分析.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析進(jìn)行比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 SARS-CoV-2 S慢病毒載體構(gòu)建及鑒定結(jié)果

重組質(zhì)粒pLV-CMV-S-IRES-eGFP質(zhì)粒酶切鑒定的凝膠電泳結(jié)果(圖1 A)表明，挑取的單克隆質(zhì)粒DNA均被切割成兩段條帶，其中小片段大小約為3 900 bp，與原始目的基因質(zhì)粒序列長(zhǎng)度相同，且經(jīng)測(cè)序后結(jié)果顯示序列無突變.說明重組質(zhì)粒pLV-CMV-S-IRES-eGFP構(gòu)建成功.重組慢病毒包裝結(jié)果顯示，細(xì)胞在24 h、48 h、72 h均能表達(dá)綠色熒光(圖1 B).Western blot結(jié)果顯示S蛋白成功過表達(dá)(圖1 C)，用RT-PCR法測(cè)定其病毒滴度，結(jié)果顯示為3.85×108IU/mL.這表明慢病毒載體包裝成功，并能介導(dǎo)S蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá).

2.2 細(xì)胞活力分析

LV-S感染HK-2及293T細(xì)胞72 h后，EdU檢測(cè)細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示，與對(duì)照組LV-GFP對(duì)比，HK-2及293T細(xì)胞增殖顯著減少(P<0.05)(圖2 A, B).CCK-8結(jié)果顯示，LV-S組與對(duì)照組LV-GFP對(duì)比，細(xì)胞活力明顯減少(圖2 C).這提示SARS-CoV-2 S蛋白可以顯著抑制細(xì)胞增殖.

2.3 重組慢病毒載體介導(dǎo)的SARS-CoV-2 S蛋白表達(dá)

流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果表明，與對(duì)照組細(xì)胞相比，過表達(dá)SARS-CoV-2 S蛋白的293T細(xì)胞的G2/M期占比從6.87%上升到12.48%，HK-2細(xì)胞的G2/M期占比從7.54%增加到14.75%(圖3 A, B)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).過表達(dá)SARS-CoV-2 S后，293T和HK-2細(xì)胞的Cyclin B1的基因和蛋白水平均明顯下降，表明SARS-CoV-2 S蛋白可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯(圖3C, D).

A：pLV-CMV-S-IRES-eGFP酶切鑒定結(jié)果， M：DL 10000 DNA 標(biāo)記物，1：pLV-CMV-S-IRES-eGFP (Nhe Ⅰ & Mlu Ⅰ), 2：SARS-CoV-2 S (Nhe Ⅰ & Mlu Ⅰ)，3～6: pLV-CMV-S-IRES-eGFP (Nhe Ⅰ & Mlu Ⅰ); B：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝慢病毒，檢測(cè)24、48、72 h的熒光表達(dá)(×40); C：Western blot檢測(cè)SARS-CoV-2 S蛋白表達(dá).

A：EdU檢測(cè)HK-2細(xì)胞及293T細(xì)胞增殖(×200)；B：對(duì)EdU實(shí)驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；C：CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力.1)與LV-GFP組相比，P<0.05.

2.4 SARS-CoV-2 S蛋白對(duì)HK-2細(xì)胞及293T細(xì)胞凋亡、自噬水平的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HK-2細(xì)胞過表達(dá)S蛋白后，細(xì)胞凋亡比例顯著增多(從8.61%到27.6%)， 293T細(xì)胞過表達(dá)S蛋白后，細(xì)胞凋亡顯著增多(從2.04%上升到4.52%)(圖4 A，P<0.01).Western blot結(jié)果表明，與LV-GFP感染的細(xì)胞相比，LV-S感染組細(xì)胞p53、Bax、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白表達(dá)均顯著升高(圖4 B)，與之相反，Bcl-2的表達(dá)則顯著下降.RT-PCR結(jié)果顯示S蛋白過表達(dá)后細(xì)胞的Bax基因表達(dá)上升，Bcl-2 表達(dá)下降(圖4 C).提示SARS-CoV-2 S蛋白可以誘導(dǎo)HK-2及293T細(xì)胞發(fā)生凋亡.

進(jìn)一步探討SARS-CoV-2 S誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的相關(guān)機(jī)制，采用Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9抑制劑處理細(xì)胞并檢測(cè)其凋亡的變化情況.結(jié)果表明，應(yīng)用Caspase-3抑制劑和Caspase-9抑制劑之后， Caspase-3和Caspase-9蛋白水平顯著下降.而應(yīng)用Caspase-8抑制劑之后，Caspase-8表達(dá)未發(fā)生明顯變化.上述結(jié)果提示SARS-CoV-2 S蛋白主要可能通過調(diào)節(jié)Caspase-9的內(nèi)源性凋亡途徑，進(jìn)而激活下游的Caspase-3凋亡執(zhí)行蛋白，誘導(dǎo)HK-2及HEK-293T細(xì)胞發(fā)生凋亡(圖4 D).

自噬在細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新過程中發(fā)揮重要作用，本研究檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示自噬的相關(guān)蛋白Beclin 1與LC3 B表達(dá)上升，p62表達(dá)下降，提示SARS-CoV-2 S蛋白導(dǎo)致了HK-2及HEK-293T細(xì)胞自噬增強(qiáng)(圖4 E).

A：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HK-2及293T細(xì)胞的細(xì)胞周期；B：G2/M期HK-2及293T細(xì)胞的百分比；C：感染的HK-2及293T細(xì)胞中Cyclin B1基因的相對(duì)水平; D、E：感染的HK-2及293T細(xì)胞中Cyclin B1的表達(dá)水平； 1)相較于LV-eGFP，P<0.05.

A: 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SARS-CoV-2 S蛋白導(dǎo)致HK-2及293T細(xì)胞凋亡; B: SARS-CoV-2 S蛋白誘導(dǎo)HK-2及293T細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá); C: SARS-CoV-2 S蛋白誘導(dǎo)HK-2及293T細(xì)胞 Bax，Bcl-2 mRNA表達(dá)， 1)與LV-eGFP比P<0.05; D: Caspase抑制劑對(duì)SARS-CoV-2 S誘導(dǎo)的HK-2及293T細(xì)胞凋亡的抑制作用;E: SARS-CoV-2導(dǎo)致HK-2及293T細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平.

3 討論

數(shù)據(jù)顯示，大多數(shù)COVID-19肺炎患者發(fā)生腎臟功能異常，雖然這些患者的腎臟功能異常往往在3周內(nèi)消失[17]，但住院的COVID-19患者中有很大一部分患有急性腎損傷，且該類人群的預(yù)后較差.在患有腎臟疾病和肥胖的人群中，SARS-CoV-2感染更容易引起多臟器損傷，導(dǎo)致COVID-19死亡率上升[18].本研究結(jié)果證實(shí)過表達(dá)SARS-CoV-2 S蛋白能引起HK-2細(xì)胞活力抑制且發(fā)生G2/M期阻滯，且過表達(dá)SARS-CoV-2 S蛋白能激活Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生凋亡.本研究結(jié)果提示，SARS-CoV-2 S蛋白在SARS-CoV-2 感染誘導(dǎo)的腎臟損傷中可能發(fā)揮重要作用.

細(xì)胞周期蛋白B1(Cyclin B1)主要參與細(xì)胞從G2期進(jìn)入M期的調(diào)節(jié)，在細(xì)胞周期循環(huán)過程中如果出現(xiàn)Cyclin B1表達(dá)降低則可能引起細(xì)胞周期阻滯[19].本研究結(jié)果顯示重組慢病毒載體介導(dǎo)的SARS-CoV-2 S蛋白表達(dá)導(dǎo)致HK-2及293T 細(xì)胞Cyclin B1 mRNA含量顯著下降，Western blot結(jié)果也正是其蛋白表達(dá)量也顯著下調(diào).

已有文獻(xiàn)報(bào)道多種病毒蛋白能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，例如流感病毒的NS1蛋白[20]，丙型肝炎病毒的E1/E2蛋白[21]和EB病毒的EBNA3C的N端[22]，但是上述蛋白在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制往往各不相同[23].

大量研究表明p53是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要蛋白，p53主要通過抑制細(xì)胞的有絲分裂信號(hào)和生存信號(hào)，促進(jìn)凋亡信號(hào)的發(fā)生從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[24].據(jù)以往文獻(xiàn)報(bào)道p53能上調(diào)Bcl-2凋亡家族蛋白Bax表達(dá)，同時(shí)抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的轉(zhuǎn)錄.因此，p53調(diào)節(jié)的Bax表達(dá)上調(diào)同時(shí)伴隨著Bcl-2表達(dá)下調(diào)，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)BAX/Bcl-2比例失衡，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[25].本研究結(jié)果表明，SARS-CoV-2 S蛋白過表達(dá)不僅上調(diào)了p53蛋白的表達(dá)，同時(shí)增加了胞內(nèi)Bax的含量，下調(diào)了Bcl-2的表達(dá)，上述結(jié)果顯示p53蛋白參與了SARS-CoV-2 S 介導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡.研究還發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2 S過表達(dá)的HK-2及293T細(xì)胞中cleaved caspase-3、8、9的含量顯著升高，然而僅caspase-3和caspase-9抑制劑能抑制細(xì)胞凋亡，結(jié)果提示SARS-CoV-2 S通過內(nèi)源性凋亡通路誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡.

自噬是一個(gè)吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器，并使其包被進(jìn)入囊泡，然后與溶酶體融合從而形成自噬溶酶體，進(jìn)而降解囊泡內(nèi)容物的過程，借此實(shí)現(xiàn)細(xì)胞代謝需要和細(xì)胞器更新[26].在生理或者病理的過程中都可見到自噬的發(fā)生，因此自噬所起的作用尚未完全闡明.Beclin1 和LC3 B作為自噬的調(diào)控因子和效應(yīng)因子，在自噬過程中被激活從而引起細(xì)胞自噬，p62作為自噬的負(fù)調(diào)節(jié)因子，負(fù)向調(diào)節(jié)自噬流生成[27].本研究發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2 S蛋白過表達(dá)不僅上調(diào)了Beclin 1和LC3 B的表達(dá)，說明細(xì)胞內(nèi)自噬流被激活，同時(shí)胞內(nèi)p62減少，說明胞內(nèi)自噬流通暢，并未受到抑制，提示自噬參與了SARS-CoV-2 S 蛋白介導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡.

綜上，在體內(nèi)環(huán)境下SARS-CoV-2 S蛋白對(duì)腎臟功能的影響機(jī)制尚不清楚，本研究發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2 S蛋白過表達(dá)能引起腎小管上皮細(xì)胞增殖減弱和凋亡，為進(jìn)一步研究SARS-CoV-2 的腎臟損傷機(jī)制，靶點(diǎn)以及如何影響腎臟功能提供了方向.

作者貢獻(xiàn)聲明

梁文翰：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)者和實(shí)驗(yàn)研究執(zhí)行，數(shù)據(jù)分析，論文初稿的寫作；毛瑩瑩：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果分析；賈敏：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果分析；李金龍：參與論文審閱，指導(dǎo)論文寫作；胡志明：參與論文審閱，指導(dǎo)論文寫作；李紅衛(wèi)：項(xiàng)目的構(gòu)思指導(dǎo)論文寫作.

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，無利益沖突.