右美托咪定對(duì)脂多糖致急性肺損傷小鼠p38MAPK-HSP27通路與炎癥反應(yīng)的影響

康 蘆，王德明

（1.湖南醫(yī)藥學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科，湖南 懷化 410021；2.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，湖南 衡陽(yáng) 421001）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是由各種直接、間接致傷因素導(dǎo)致的肺泡上皮細(xì)胞與毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，而引起彌漫性肺間質(zhì)水腫、肺泡水腫等損害肺功能的癥狀，最終可造成急性低氧性呼吸功能不全。有研究表明，ALI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要?dú)w因于過(guò)度的炎癥反應(yīng)引起的肺組織破壞，而肺泡血管內(nèi)皮細(xì)胞與肺成纖維細(xì)胞可合成p38分裂原激活蛋白激酶（p38MAPK），從而激活熱休克蛋白27（HSP27），誘導(dǎo)炎性因子產(chǎn)生，損害肺部組織，且細(xì)胞因子相互介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)炎性反應(yīng)能加重肺組織損傷[1-2]。右美托咪定屬于一種高選擇性腎上腺素受體激動(dòng)劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、催眠及抑制交感神經(jīng)活性等作用[3]。為探究右美托咪定治療ALI的作用機(jī)制，本研究將BABL/cJ小鼠作為試驗(yàn)對(duì)象，旨在探討右美托咪定對(duì)脂多糖致ALI小鼠p38分裂原激活蛋白激酶（p38MAPK） -?熱休克蛋白27（HSP27）通路與炎癥反應(yīng)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BABL/cJ小鼠，均為雌性，體質(zhì)量14～16 g，平均（15.11±0.07） g；所選動(dòng)物均由南華大學(xué)提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（湘）2020-0002。本實(shí)驗(yàn)方案已經(jīng)湖南醫(yī)藥學(xué)院第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 儀器與設(shè)備 脂多糖（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；鹽酸右美托咪定注射液（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20090248，規(guī)格：2 mL∶200 μg）；酶聯(lián)免疫試劑盒（Beyotime Biotechnology Co.，LTD，中國(guó)）；BCA蛋白定量試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher公司）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體（北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司）；ELC化學(xué)法顯色系統(tǒng)（美國(guó)Thermo Fisher公司）；蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜槽、蛋白電泳槽（美國(guó)Bio-Rad公司）等。

1.2 方法選取30只BABL/cJ小鼠為試驗(yàn)對(duì)象，隨機(jī)取10只小鼠作為空白對(duì)照組；剩余20只小鼠建立脂多糖致ALI小鼠動(dòng)物模型，建模前常規(guī)禁食12 h，并于腹腔內(nèi)注射脂多糖5 mg/kg，連續(xù)注射3 d，若小鼠出現(xiàn)呼吸急促、抱團(tuán)取暖、口唇發(fā)鉗或抓取時(shí)無(wú)力反抗?fàn)顟B(tài)時(shí)則表明建模成功[4]。將建模成功后的小鼠隨機(jī)分為兩組，模型對(duì)照組和右美托咪定組，各10只?？瞻讓?duì)照組與模型對(duì)照組小鼠均腹腔注射0.9%的氯化鈉溶液（0.1 mL）干預(yù)，而右美托咪定組小鼠于注射LPS前30 min腹腔注射右美托咪定0.1 mL。24 h后評(píng)估各組干預(yù)效果。

1.3 觀察指標(biāo) ①對(duì)比3組小鼠干預(yù)后24 h的炎性因子水平。3組小鼠均于干預(yù)后24 h以頸椎脫臼法處死，取尾靜脈血3 mL，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min分離血清，后放置在 -20 ℃冰箱中備用，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定3組小鼠的腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）水平。②干預(yù)后24 h進(jìn)行肺組織蘇木精 - 伊紅（HE）染色[5]。小鼠處死后取肺部組織，放置在濃度為4%多聚甲醛中，固定病灶組織，常規(guī)石蠟包埋，后制備4 μm切片，并完成HE染色，于光學(xué)倒置顯微鏡下觀察小鼠肺部組織變化情況，每只小鼠取切片5張，每張切片觀察5個(gè)不同的視野；③對(duì)比3組小鼠干預(yù)后24 h肺損傷指標(biāo)，根據(jù)小鼠HE染色，觀察小鼠肺組織并進(jìn)行肺損傷評(píng)分[6]，分值為0～16分，分?jǐn)?shù)越高，肺部損傷越重，并取右肺上葉組織，分別稱(chēng)量其濕重與干重，其中左肺上葉清洗后稱(chēng)重為濕重，然后將其置于80℃的烤箱，烘烤48 h后測(cè)量干重，計(jì)算濕重與干重的比值。④對(duì)比3組小鼠干預(yù)后24 h的p38MAPK-HSP27通路蛋白表達(dá)情況。取3組小鼠部分左肺部組織，加入細(xì)胞裂解液后勻漿30 min，離心15 min后，提取肺部蛋白，利用蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）[7]檢測(cè)p38MAPK、HSP27蛋白表達(dá)情況，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，取蛋白上樣品50 μg，加入樣緩沖液，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，取200 mA凝膠穩(wěn)流轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上后，采用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液完成2 h封閉，洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體，室溫孵育1 h。TBST洗膜后，加入ECL發(fā)光液，采用凝膠成像系統(tǒng)報(bào)告。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料使用(±s?)表示，采用t檢驗(yàn)；多組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 炎性因子 右美托咪定組和模型對(duì)照組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平均高于空白對(duì)照組，但右美托咪定組低于模型對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05），見(jiàn)表1。

表1 3組小鼠炎性因子比較（ ?±s?, pg/mL）

表1 3組小鼠炎性因子比較（ ?±s?, pg/mL）

注：與空白對(duì)照組比，*P<0.05；與模型對(duì)照組比，#P<0.05。TNF-α：腫瘤壞死因子 -α；IL-6：白介素 -6；IL-1β：白介素 -1β。

組別 例數(shù) TNF-α IL-6 IL-1β空白對(duì)照組 10 84.34±12.13 33.27±4.34 58.32±6.41模型對(duì)照組 10 326.98±43.25* 174.34±14.98* 203.59±15.39*右美托咪定組 10 123.23±24.29*# 102.15±10.29*# 132.53±10.63*#F值 195.384 427.598 404.925 P值 <0.05 <0.05 <0.05

2.2 HE染色 HE染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組肺組織變化不明顯，且結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔清晰，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；右美托咪定組顯示肺泡結(jié)構(gòu)破壞與出血程度較輕，見(jiàn)圖1。

圖1 HE染色結(jié)果（×100）

2.3 肺損傷指標(biāo) 右美托咪定組和模型對(duì)照組小鼠肺損傷評(píng)分、W/D水平均高于空白對(duì)照組，但右美托咪定組低于模型對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05），見(jiàn)表2。

表2 3組小鼠肺損傷指標(biāo)比較(?±s?)

表2 3組小鼠肺損傷指標(biāo)比較(?±s?)

注：與空白對(duì)照組比，*P <0.05；與模型對(duì)照組比，#P < 0.05。W/D：濕重與干重比。

組別 例數(shù) 肺損傷評(píng)分(分) W/D空白對(duì)照組 10 1.91±0.32 3.28±0.43模型對(duì)照組 10 9.30±0.83* 7.22±0.81*右美托咪定組 10 4.61±0.49*# 4.97±0.73*#F值 406.720 85.313 P值 <0.05 <0.05

2.4 p38MAPK-HSP27通路蛋白表達(dá)情況 Western blotting法結(jié)果顯示，模型對(duì)照組與右美托咪定組小鼠肺組織中p38MAPK、HSP27蛋白含量均高于空白對(duì)照組，但右美托咪定組低于模型對(duì)照組，見(jiàn)圖2。

圖2 p38MAPK-HSP27通路蛋白表達(dá)情況

3 討論

ALI是臨床常見(jiàn)的急危重癥，與中性粒細(xì)胞的廣泛浸潤(rùn)、炎癥細(xì)胞的過(guò)度激活、促炎介質(zhì)的過(guò)量產(chǎn)生有關(guān)，患者主要特征有急性肺心源性肺水腫、頑固性低氧血癥等，其臨床致死率較高，因此，尋求規(guī)范化、創(chuàng)新性藥物是進(jìn)一步改善ALI患者預(yù)后的重點(diǎn)。

右美托咪定是一種有效的α2腎上腺素受體激動(dòng)劑，其具有高親和力、半衰期較短的特點(diǎn)，具有一定的選擇性，可發(fā)揮抗焦慮、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛及神經(jīng)保護(hù)等作用，進(jìn)而穩(wěn)定血流動(dòng)力學(xué)，緩解氣管插管及手術(shù)應(yīng)激反應(yīng)，是臨床重病監(jiān)護(hù)治療的常用藥物[8]。血清TNF-α、IL-6、IL-1β是臨床常見(jiàn)的炎性因子，其可通過(guò)HSP27通路活化而被誘導(dǎo)產(chǎn)生，從而介導(dǎo)ALI的發(fā)生。本研究通過(guò)對(duì)右美托咪定組小鼠進(jìn)行右美托咪定干預(yù)，并對(duì)3組小鼠肺部進(jìn)行HE染色，結(jié)果顯示，右美托咪定組小鼠肺損傷評(píng)分、W/D及血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平均低于模型對(duì)照組，但高于空白對(duì)照組；HE染色顯示，空白對(duì)照組小鼠肺組織變化不明顯，并具有完整結(jié)構(gòu)，肺泡腔清晰，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)變化；模型對(duì)照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；右美托咪定組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞與出血程度較輕，提示將右美托咪定用于脂多糖致ALI小鼠中可減輕小鼠機(jī)體的炎癥反應(yīng)，從而減輕肺泡結(jié)構(gòu)的損害，保護(hù)肺功能。

研究表明，p-p38MAPK含量可隨ALI炎癥反應(yīng)程度加重而逐漸增加；而MAPK是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)系統(tǒng)，能調(diào)控細(xì)胞增生、分化、凋亡及基因表達(dá)，當(dāng)p38MAPK磷酸化后，可調(diào)節(jié)下游的HSP27表達(dá)，進(jìn)而加重ALI[9]。本研究通過(guò)Western blotting檢測(cè)顯示，模型對(duì)照組與右美托咪定組小鼠肺組織中p38MAPK、HSP27蛋白含量均高于空白對(duì)照組，但右美托咪定組低于模型對(duì)照組，提示右美托咪定能抑制脂多糖致ALI小鼠肺組織p38MAPK-HSP27通路蛋白表達(dá)，繼而抑制機(jī)體炎性反應(yīng)，達(dá)到治療ALI的目的，可為ALI患者的臨床治療提供新的思路。

綜上，右美托咪定用于脂多糖致ALI小鼠中可減輕小鼠機(jī)體的炎癥反應(yīng)，抑制p38MAPK-HSP27通路活化，保護(hù)肺功能，為ALI的臨床治療提供新思路，值得臨床進(jìn)一步研究。