氣相色譜法測(cè)定植物甾醇中β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇的含量

◎ 黃銀波，花 露，陳 君，葉 平

（泰州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，江蘇 泰州 225300）

植物甾醇是植物性食物中含有的類膽固醇物質(zhì)，其在植物油中的含量較高。植物甾醇通常可利用大豆油等植物油餾分為原料，通過(guò)皂化、萃取、結(jié)晶等工藝生產(chǎn)制得[1]。植物甾醇是數(shù)種甾醇的混合物，主要成分是β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和菜籽甾醇，其中以β-谷甾醇為主，占總植物甾醇的40%～50%。其具有維持體內(nèi)膽固醇平衡的作用，具有十分重要的生理價(jià)值。原衛(wèi)生部2010年第3號(hào)《關(guān)于批準(zhǔn)DHA藻油、棉籽低聚糖等7種物品為新資源食品及其他相關(guān)規(guī)定的公告》允許植物甾醇應(yīng)用于食品加工，規(guī)定了植物甾醇的含量及植物甾醇組成比例。國(guó)內(nèi)對(duì)于植物甾醇的研究集中于植物油類產(chǎn)品，采用的測(cè)定方法有氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[2-4]。而對(duì)于其本身各組分含量的測(cè)定的研究很少，目前尚無(wú)測(cè)定植物甾醇中各種甾醇含量的國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法，檢測(cè)方法缺失給植物甾醇的質(zhì)量控制帶來(lái)困難。因此，本工作擬采用硅烷化試劑衍生后氣相色譜法對(duì)植物甾醇中谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和菜籽甾醇的含量進(jìn)行測(cè)定，以期為相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量檢驗(yàn)及監(jiān)管提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器設(shè)備：Agilent 7890A氣相色譜儀（配FID檢測(cè)器）、電子天平、精密烘箱、水浴鍋、氮吹儀。

標(biāo)準(zhǔn)品：5α-膽甾醇標(biāo)準(zhǔn)品（內(nèi)標(biāo)），純度99.0%；β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品，純度98.0%；菜油甾醇標(biāo)準(zhǔn)品，純度98.5%；豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)品，純度98.9%；菜籽甾醇標(biāo)準(zhǔn)品，純度95.0%，上海ANPEL公司提供。

試劑：BSTFA硅烷化試劑、甲基叔丁基醚（分析純）、正庚烷（分析純）、正己烷（色譜純）、吡啶（色譜純）。

實(shí)驗(yàn)樣品：植物甾醇（純度大于90%），由江蘇豐益生物科技有限公司生產(chǎn)提供。

1.2 儀器工作條件

HP-5毛細(xì)管色譜柱（0.32 mm ×30 m，0.25 μm），進(jìn)樣口氣化溫度310 ℃，載氣為氮?dú)?，流?.0 mL·min-1；程序升溫：柱溫60 ℃，保持1 min，以15 ℃·min-1速率升溫至250 ℃，再以2 ℃·min-1升溫至300 ℃，保持18 min；檢測(cè)器溫度325 ℃；分流模式：不分流；進(jìn)樣體積0.6 μL。

1.3 試驗(yàn)方法

準(zhǔn)確稱取15 mg 5α-膽甾醇（內(nèi)標(biāo)）和50 mg樣品于反應(yīng)瓶中，置于40～50 ℃水浴，加入1 mL甲基叔丁基醚完全溶解，再加入4 mL正己烷，混合均勻。取上述溶液50 μL于小號(hào)反應(yīng)瓶中，50～60 ℃氮吹蒸發(fā)至近干。然后加入60 μL BSTFA硅烷化試劑、240 μL吡啶混勻，加蓋密封后于100 ℃烘箱中反應(yīng)35 min取出，5～10 min后加1.7 mL正庚烷混勻并轉(zhuǎn)移至樣品瓶中，上機(jī)測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱選擇

若使用的色譜柱固定相含有活潑氫基團(tuán)，硅烷化試劑將會(huì)破壞或改變柱效[5]。因此色譜柱固定相應(yīng)是非極性的，選用HP-5毛細(xì)管色譜柱（0.32 mm ×30 m，0.25 μm）。植物甾醇各組分標(biāo)準(zhǔn)樣品以及內(nèi)標(biāo)（5α-膽甾醇）色譜圖見圖1。

圖1 植物甾醇標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖

植物甾醇樣品色譜圖如圖2所示。4種不同組分甾醇以及內(nèi)標(biāo)物之間得到了較好的分離。出峰順序?yàn)椋簝?nèi)標(biāo)物5α-膽甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇，整個(gè)分析過(guò)程40 min內(nèi)完成。

圖2 植物甾醇實(shí)驗(yàn)樣品色譜圖

2.2 衍生化前處理

因甾醇分子中含有極性羥基，需對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理。衍生方法一般可以選擇硅烷化、酯化和?；痆6]。考慮到所形成的硅烷化衍生物更易氣化，熱穩(wěn)定性提高，更適合氣相色譜法分析。因此，選擇BSTFA硅烷化試劑作為反應(yīng)的衍生化試劑。

2.3 反應(yīng)時(shí)間選擇

為考察不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)各甾醇組分含量的影響，分別衍生化反應(yīng)10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min、40 min和45 min后上機(jī)測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量，結(jié)果如圖3所示。從圖3中可以看出，主要甾醇組分在衍生反應(yīng)35 min時(shí)含量相對(duì)較高，因此選用35 min作為衍生反應(yīng)時(shí)間。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)各甾醇組分含量影響圖

2.4 反應(yīng)溫度選擇

為考察反應(yīng)溫度對(duì)甾醇含量的影響，按表1中不同溫度下反應(yīng)35 min取出上機(jī)測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。從表1中可以看出，各甾醇組分在100 ℃的條件下反應(yīng)較為完全，含量較高。因此，選用100 ℃作為衍生反應(yīng)溫度。

表1 反應(yīng)溫度對(duì)植物甾醇含量的影響表（單位：%）

2.5 準(zhǔn)確度

按照標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》（GB/T 27404—2008）要求，重復(fù)分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，測(cè)定甾醇主含量平均值與參考值的偏差范圍＜5%，具體結(jié)果見表2。

表2 準(zhǔn)確度數(shù)據(jù)表

2.6 精密度

對(duì)同一實(shí)際樣品（植物甾醇總含量大于90%）平行測(cè)定6次，測(cè)定其中的植物甾醇含量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》（GB/T 27404—2008）要求，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)（CV＜1.3%）來(lái)判斷精密度。具體結(jié)果見表3。

表3 精密度數(shù)據(jù)表

3 結(jié)論

關(guān)于氣相色譜法測(cè)定植物甾醇各組分含量的研究報(bào)道較少見。本研究對(duì)硅烷化試劑衍生后氣相色譜法的各個(gè)實(shí)驗(yàn)條件參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化選擇。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度是關(guān)鍵因素，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為35 min、反應(yīng)溫度為100 ℃時(shí)衍生化反應(yīng)較為完全。通過(guò)對(duì)參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和實(shí)際樣品的測(cè)試，優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)便快速，精密度好、準(zhǔn)確度高。