Caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡對(duì)腦出血大鼠神經(jīng)損傷的影響*

郭亞凈， 任 靜， 劉 寒， 李亭亭， 王 洪

（河北中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，河北石家莊050200）

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）具有很高的死亡率和致殘率，占所有卒中類型的15%~20%，且其發(fā)病人數(shù)呈逐年上升趨勢(shì)［1］。并且，大多數(shù)幸存者會(huì)遺留不同程度的神經(jīng)功能障礙［2］。大量研究表明，血腦屏障破壞、腦水腫、炎癥反應(yīng)和凝血酶毒性效應(yīng)等繼發(fā)性腦損傷是導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙，造成不良預(yù)后的主要原因［3-4］。

胱天蛋白酶1（caspase-1）作為炎癥性半胱天冬酶，介導(dǎo)細(xì)胞固有免疫炎癥反應(yīng)，促進(jìn)白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18等炎癥因子的成熟與釋放。同時(shí)，caspase-1還能使細(xì)胞焦亡執(zhí)行蛋白gasdermin D（GSDMD）發(fā)生剪切，并在細(xì)胞膜聚集，造成細(xì)胞穿孔，引起細(xì)胞焦亡［5］。實(shí)驗(yàn)研究顯示，caspase-1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞焦亡參與多種神經(jīng)相關(guān)性疾病的發(fā)展過程［6-10］。然而，其在ICH后神經(jīng)損傷中是否起作用仍不十分清楚。

本課題組利用自體非抗凝血注射法制造大鼠ICH模型，采用腦室內(nèi)注射caspase-1選擇性抑制劑Ac-YVAD-CMK的方法，觀察caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡在ICH后神經(jīng)損傷中的作用。

材料和方法

1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，8~10周齡，體重約250~300 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)條件，溫度恒定為（22±1）℃，濕度為（50±20）%，光照條件為晝夜各12 h，自由飲食、水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，開始第1部分實(shí)驗(yàn)。將30只大鼠隨機(jī)分為5組（每組6只大鼠）：假手術(shù)（sham）組、ICH 12 h組、ICH 24 h組、ICH 48 h組和ICH 72 h組。采用Western blot方法，觀察caspase-1和GSDMD在ICH后的表達(dá)及激活情況，選取活化變化最明顯的時(shí)間點(diǎn)。根據(jù)第1部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用同樣的造模方式，開始第2部分實(shí)驗(yàn)：54只大鼠隨機(jī)平均分為3組（每組18只大鼠）：sham組、ICH組和Ac-YVAD-CMK給藥組（YVAD組），用于觀察Ac-YVAD-CMK的作用。造模過程中未出現(xiàn)動(dòng)物死亡情況，成功率為100%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序通過河北中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)DWLL-2018005）。

2 主要試劑

Ac-YVAD-CMK購(gòu)自APExBIO；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、神經(jīng)元核抗原（neuronal nuclei，NeuN；神經(jīng)元特異性核蛋白）抗體、離子鈣結(jié)合接頭分子1（ionized calcium-binding adaptor molecule-1，Iba-1；小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物）抗體和β-actin抗體購(gòu)自Servicebio；ECL顯色試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；caspase-1和GSDMD抗體購(gòu)自Santa Cruz；IL-1β和IL-18抗體購(gòu)自Abcam；辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗IgG購(gòu)自Cell Signaling Technology；TUNEL試劑盒購(gòu)自Roche；Fluoro-Jade C（FJC）染色劑購(gòu)自Millipore。

3 主要方法

3.1 Ac-YVAD-CMK給藥方法 給藥方法參考已有文獻(xiàn)［11］。將Ac-YVAD-CMK溶解于DMSO中，用PBS進(jìn)一步稀釋至濃度為1 g/L（DMSO終濃度<0.2%）待用。大鼠稱重，1%戊巴比妥鈉，100 mL/kg腹腔注射麻醉。待大鼠麻醉成功后，將其固定于全自動(dòng)腦立體定位儀上（51700，Stoelting），剪去大鼠頭頂毛發(fā)，碘伏消毒，剪開大鼠頭部正中皮膚約1 cm×1 cm，輕輕擦拭掉顱骨表面筋膜及軟組織，定位前囟，然后以前囟作為原點(diǎn)，向后1.0 mm、向右旁開1.5 mm標(biāo)記為穿刺點(diǎn)，顱鉆垂直向下鉆開一個(gè)直徑約1 mm的注射孔，將裝有Ac-YVAD-CMK的微量注射器安裝到電動(dòng)注射裝置上，垂直向下進(jìn)針4.5 mm穿刺進(jìn)入腦室后，以1μL/min的速度注入Ac-YVAD-CMK，每只大鼠注射1μL。注藥完畢后留針3 min，再緩慢退針。sham組和ICH組操作方法同上，以等體積PBS稀釋的DMSO注入側(cè)腦室，不注入任何藥物。

3.2 ICH模型的制備 側(cè)腦室注射Ac-YVAD-CMK 20 min后，建立ICH模型。以前囟作為原點(diǎn)，向前0.12 mm、向右旁開3.8 mm標(biāo)記為穿刺點(diǎn)，然后用顱鉆垂直向下鉆開直徑約1 mm的注射孔。碘伏擦拭大鼠尾尖，剪斷尾尖取血，迅速將100μL血液轉(zhuǎn)移到微量注射器中，將微量注射器安裝到電動(dòng)注射裝置上，垂直向下進(jìn)針5.5 mm穿刺進(jìn)入紋狀體，以10μL/min的速度注入自體非抗凝血，注射結(jié)束后停針20 min，然后緩慢退針。最后用骨蠟封閉注射孔，并用手術(shù)線縫合切口。

3.3 神經(jīng)功能評(píng)價(jià) （1）前肢放置實(shí)驗(yàn)用于評(píng)價(jià)大鼠的感覺運(yùn)動(dòng)功能：測(cè)試者握住大鼠背部皮膚使四肢懸空，將大鼠胡須接觸桌面邊緣誘導(dǎo)其將前肢放置于桌面上，紋狀體受損大鼠，其受損對(duì)側(cè)肢體將出現(xiàn)不同程度的放置能力缺失。大鼠每側(cè)受測(cè)10次，左側(cè)前肢成功放置的百分率反應(yīng)損傷情況。（2）轉(zhuǎn)角實(shí)驗(yàn)用于評(píng)價(jià)大鼠肢體協(xié)調(diào)功能：將大鼠放入一個(gè)兩塊板所形成的30°夾角內(nèi)，使其轉(zhuǎn)身，觀察并記錄大鼠向左側(cè)轉(zhuǎn)身的次數(shù)。每只大鼠重復(fù)放置10次，每次間隔至少30 s，左側(cè)轉(zhuǎn)身次數(shù)百分率反應(yīng)損傷情況。（3）改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分（modified neurologi?cal severity score，mNSS）用于評(píng)價(jià)大鼠的運(yùn)動(dòng)、感覺、平衡和反射功能：評(píng)分范圍為0~18分，分值越高，其神經(jīng)損害越嚴(yán)重，評(píng)分方法參考相關(guān)文獻(xiàn)［12］。

3.4 干濕比重法 用于檢測(cè)腦組織含水量，觀察水腫情況。大鼠麻醉后，迅速取腦組織。將其分為病灶側(cè)皮質(zhì)、病灶側(cè)基底、病灶對(duì)側(cè)皮質(zhì)、病灶對(duì)側(cè)基底及小腦5個(gè)部分。將腦組織分別放入錫紙中，稱量濕重并記錄。然后，將錫紙包裹的腦組織，放入恒溫干燥箱（UF160，Memmert）中，以100℃烘干24 h。將烘烤后的腦組織取出，稱量干重。腦組織含水量（%）=（濕重?干重）/濕重×100%。

3.5 標(biāo)本的留取和制備 將麻醉成功的大鼠固定于操作臺(tái)上，充分暴露大鼠胸腔，在右心耳處做一小切口。自左心室注入冰冷的生理鹽水，將心血管系統(tǒng)內(nèi)的血液沖洗干凈。腦組織完整取出后去除小腦和腦干，僅留大腦。用于病理學(xué)檢測(cè)的組織，在血液注射進(jìn)針點(diǎn)冠狀面將大腦分為前后兩部分，放入4%組織細(xì)胞固定液中進(jìn)行固定，隨后進(jìn)行蠟塊包埋和組織切片；用于Western blot檢測(cè)的組織，以血液注射進(jìn)針點(diǎn)冠狀面為基準(zhǔn)，分別向其前后延伸1 mm距離，切取厚約2 mm的腦組織切片，并留取患側(cè)紋狀體腦組織，于液氮中存放24 h后，轉(zhuǎn)入?80℃冰箱備用。所有操作均在冰上快速進(jìn)行，以防止蛋白酶降解蛋白。

3.6 HE染色 用于觀察血腫周圍腦組織病理學(xué)變化及水腫情況。正置顯微鏡下（DM5300，Leica），每張切片選取4個(gè)視野進(jìn)行拍照，每只動(dòng)物選取3張切片進(jìn)行觀察。

3.7 FJC染色 用于檢測(cè)血腫周圍神經(jīng)元退化情況。石蠟?zāi)X組織切片脫蠟至水后，用PBS沖洗，每次5 min，沖洗3次后將切片浸入0.06%的髙錳酸鉀溶液中10 min（在搖床上輕搖）。從高錳酸鉀溶液中取出切片，PBS沖洗3次，每次5 min。在避光環(huán)境下，將切片轉(zhuǎn)移浸入0.000 1%的FJC染色液中染色30 min。用蒸餾水沖洗3次，每次5 min，切片周圍水用紙巾擦干，晾干5 min，烤箱中（50℃）烘烤5 min。然后，將干燥后的切片置于二甲苯中進(jìn)行透明，用抗熒光淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡下（DM5300，Lei?ca），每張切片選取血腫周圍組織4個(gè)視野進(jìn)行拍照，并用ImageJ軟件進(jìn)行FJC陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)。

3.8 Western blot 用RIPA裂解液進(jìn)行腦組織勻漿后，在4℃下，12 000×g離心15 min。然后收集上清液，使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。將含有50μg蛋白質(zhì)的上清液加入SDS-PAGE分離，然后將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉PVDF膜后，分別孵育caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18和β-actin抗體，于4℃過夜。然后，將TBST洗滌后的PVDF膜孵育過氧化物辣根酶標(biāo)記的Ⅱ抗，于室溫下放置90 min。使用ECL顯色試劑盒進(jìn)行顯影，多功能激光掃描系統(tǒng)（Fusion FX5 Spectra，Vil?ber）檢測(cè)蛋白含量，ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析。

3.9 免疫熒光雙標(biāo)染色 石蠟切片脫蠟至水，稍甩干后用3%H2O2處理切片10 min，抑制內(nèi)源性過氧化酶的活性，PBS漂洗3次，每次5 min。放入枸櫞酸鹽緩沖液中加熱修復(fù)抗原10 min，室溫冷卻，PBS漂洗3次，每次5 min；滴加羊血清，于37℃恒溫箱中封閉1 h；輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加鼠源和兔源Ⅰ抗（GSDMD和Iba-1抗體，或GSDMD和NeuN抗體），于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜；次日用PBS漂洗3次，每次5 min。切片滴加兩種相應(yīng)種屬的熒光Ⅱ抗，避光室溫孵育30 min。PBS中漂洗3次后，滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min。PBS中漂洗3次，抗熒光淬滅封片劑封片。正置熒光顯微鏡下（DM5300，Leica），觀察并采集圖像，用ImageJ軟件進(jìn)行分析。

3.10 免疫熒光與TUNEL雙染 TUNEL（綠色）和Iba-1（紅色）雙染色用于評(píng)估ICH后小膠質(zhì)細(xì)胞焦亡情況。石蠟切片經(jīng)脫蠟至水、抑制內(nèi)源性過氧化酶、抗原修復(fù)步驟后，根據(jù)TUNEL檢測(cè)試劑盒（Roche）說明書，進(jìn)行TUNEL染色；然后往切片上加入Iba-1抗體，4℃孵育過夜；次日將切片與熒光染料標(biāo)記的Ⅱ抗在室溫黑暗環(huán)境中孵育2 h；最后DAPI染核，抗熒光淬滅封片劑封片。在正置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察和拍照，每個(gè)切片在血腫周圍選取3個(gè)視野，每個(gè)腦組織選取3個(gè)切片進(jìn)行觀察。使用ImageJ軟件分析TUNEL陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用Tukey's檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ICH后患側(cè)紋狀體中caspase-1和GSDMD蛋白的表達(dá)及激活情況

Western blot結(jié)果顯示，與sham組比較，caspase-1、pro-caspase-1、caspase-1/pro-caspase-1、GSDMD-N、GSDMD和GSDMD-N/GSDMD均在ICH后72 h時(shí)顯著升高（P<0.05），并且在72 h時(shí)病變最為明顯，見圖1。因此，本課題組選擇ICH 72 h時(shí)點(diǎn)作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)時(shí)點(diǎn)。

Figure 1.Western blot results for the changes of caspase-1（A）and GSDMD（B）activation and expression in the perihematoma after intracerebral hemorrhage（ICH）.Mean±SEM.n=6.*P<0.05，**P<0.01 vs sham group.圖1 腦出血后血腫周圍組織caspase-1和GSDMD的激活及蛋白表達(dá)

2 抑制caspase-1對(duì)ICH大鼠神經(jīng)功能的影響

前肢放置實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與sham組比較，ICH大鼠左側(cè)前肢放置成功率顯著下降（P<0.01），而抑制caspase-1顯著提高了大鼠左側(cè)前肢放置成功率（P<0.05），見圖2A。轉(zhuǎn)角實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與sham組比較，ICH大鼠左側(cè)轉(zhuǎn)身的百分比顯著下降（P<0.05），而抑制caspase-1顯著提高了大鼠左側(cè)轉(zhuǎn)身的百分比（P<0.05），見圖2B。mNSS結(jié)果顯示，與sham組比較，ICH大鼠mNSS顯著升高（P<0.01），而抑制caspase-1顯著降低了大鼠mNSS（P<0.05），見圖2C。

Figure 2.Neurological function assessment in the rats with intracerebral hemorrhage（ICH）.A：forelimb placement test；B：corner turn test；C：modified neurological severity score（mNSS）.Mean±SEM.n=6.*P<0.05，**P<0.01 vs sham group；#P<0.05 vs ICH group.圖2 腦出血大鼠的神經(jīng)功能評(píng)估結(jié)果

3 抑制caspase-1對(duì)ICH大鼠神經(jīng)損傷的影響

HE染色結(jié)果顯示，sham組大鼠腦組織中神經(jīng)細(xì)胞排列整齊、分布勻稱，細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)染色均勻；ICH組大鼠血腫周圍腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加，神經(jīng)細(xì)胞腫脹，排布不均，部分細(xì)胞固縮性壞死，染色加深；YVAD組大鼠血腫周圍腦組織中神經(jīng)細(xì)胞腫脹明顯減輕，固縮壞死細(xì)胞數(shù)量減少，見圖3A。干濕比重結(jié)果顯示，與sham組比較，ICH大鼠病灶側(cè)基底顯著水腫（P<0.05），而抑制caspase-1顯著緩解了病灶側(cè)基底的水腫（P<0.05），見圖3B。然而，與sham組比較，ICH大鼠病灶側(cè)皮質(zhì)、病灶對(duì)側(cè)基底、病灶對(duì)側(cè)皮質(zhì)及小腦的水腫情況無(wú)顯著差異。FJC染色結(jié)果顯示，與sham組比較，ICH大鼠血腫周圍腦組織中FJC染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增加（P<0.05），而抑制caspase-1顯著減少了FJC染色陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量（P<0.05），見圖3C、D。

Figure 3.Nerve injury in the rats with intracerebral hemorrhage（ICH）.A：HE staining was used to observe the histopathological changes in the surrounding tissues of hematoma（scale bar=50μm）；B：the changes of brain water content in different parts of brain tissue（Ispi：ispilateral；Cont：contralateral；BG：basal ganglia；CX：cortex）in each group；C：representa?tive microphotographs and quantitative analysis of Fluoro-Jade C（FJC）-positive neurons in the surrounding tissues of hema?toma（scale bar=50μm）；D：representative image of the surrounding tissues of hematoma.Mean±SEM.n=6.*P<0.05 vs shamgroup；#P<0.05 vs ICH group.圖3 腦出血大鼠神經(jīng)損傷情況

4 抑制caspase-1對(duì)ICH大鼠患側(cè)紋狀體中cas?pase-1和GSDMD蛋白表達(dá)及激活的影響

Western blot結(jié)果顯示，與sham組比較，ICH大鼠腦組織中caspase-1、pro-caspase-1、caspase-1/pro-cas?pase-1、GSDMD-N、GSDMD和GSDMD-N/GSDMD均顯著升高（P<0.05），而抑制caspase-1顯著降低了上述蛋白的表達(dá)及激活水平（P<0.05），見圖4。

5 抑制caspase-1對(duì)ICH大鼠血腫周圍腦組織中TUNEL和GSDMD陽(yáng)性神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞的影響

免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示，與sham組比較，ICH大鼠血腫周圍腦組織中GSDMD陽(yáng)性表達(dá)小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量顯著增加（P<0.01），而抑制caspase-1顯著減少了GSDMD陽(yáng)性表達(dá)小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量（P<0.01），見圖5A。免疫熒光與TUNEL共染色結(jié)果顯示，與sham組比較，ICH大鼠血腫周圍腦組織中TUNEL陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量顯著增加（P<0.01），而抑制caspase-1顯著減少了TUNEL陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量（P<0.05），見圖5B。免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示，ICH組大鼠血腫周圍腦組織中GSDMD陽(yáng)性表達(dá)神經(jīng)元數(shù)量與sham組比較無(wú)顯著差異，見圖5C。

6 抑制caspase-1對(duì)ICH大鼠患側(cè)紋狀體中IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與sham組比較，ICH大鼠腦組織中IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05），而抑制caspase-1顯著降低了IL-1β和IL-18的表達(dá)（P<0.05），見圖6。

Figure 4.Western blot results showed that Ac-YVAD-CMK inhibited the activation and protein expression of caspase-1（A）and GSDMD（B）.Mean±SEM.n=6.*P<0.05 vs shamgroup；#P<0.05 vs ICH group.圖4 Ac-YVAD-CMK抑制caspase-1和GSDMD的激活及蛋白表達(dá)

討 論

1 由caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡在ICH后神經(jīng)損傷中發(fā)揮重要作用

細(xì)胞焦亡是一種炎癥程序性細(xì)胞死亡方式，兼具凋亡和壞死的特征［13］。焦亡細(xì)胞病理表現(xiàn)為核固縮，DNA斷裂，TUNEL染色為陽(yáng)性，但胞體增大，胞膜完整性被破壞，胞膜上形成1~2 nm的膜孔［5］。GSDMD是細(xì)胞焦亡的效應(yīng)蛋白，屬于gasdermin家族。GSDMD被激活的caspase剪切，釋放N末端與細(xì)胞膜的脂質(zhì)融合，形成膜孔，改變細(xì)胞的滲透壓，破壞細(xì)胞膜的功能，使得細(xì)胞膜破裂，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡［14］。

焦亡途徑包括caspase-11或caspase-4/5介導(dǎo)的非經(jīng)典焦亡途徑和caspase-1介導(dǎo)的經(jīng)典焦亡途徑。在刺激信號(hào)作用下，pro-caspase-1被招募到炎癥小體后二聚體化，激活其自身的蛋白酶活性，自剪切形成具有催化活性的caspase-1，caspase-1切割pro-IL-1β和pro-IL-18，使其活化成為有活性的IL-1β和IL-18，活化后的炎癥因子通過GSDMD形成的膜孔釋放至細(xì)胞外，募集更多的炎癥細(xì)胞聚集，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)［15-16］。研究結(jié)果顯示，ICH大鼠患側(cè)紋狀體中cas?pase-1和GSDMD的表達(dá)及活化在72 h內(nèi)逐漸升高，表明ICH大鼠腦組織中出現(xiàn)了細(xì)胞焦亡。

Ac-YVAD-CMK是一種caspase-1選擇性抑制劑，有研究顯示其可以改善膠原酶誘導(dǎo)的ICH小鼠或大鼠的神經(jīng)功能障礙和caspase-1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［11，17］。為了進(jìn)一步證實(shí)caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡對(duì)ICH后神經(jīng)損傷的影響，我們?cè)谥苽銲CH模型前，將Ac-YVAD-CMK注入側(cè)腦室，觀察其對(duì)大鼠神經(jīng)損傷和神經(jīng)功能的作用。結(jié)果顯示，Ac-YVAD-CMK顯著改善了大鼠的神經(jīng)功能障礙、組織病理學(xué)變化和腦組織水腫，減少了退行性神經(jīng)元的數(shù)量，說明抑制caspase-1顯著地改善了ICH大鼠的神經(jīng)功能障礙和神經(jīng)損傷，與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致。同時(shí)，Ac-YVAD-CMK顯著降低了ICH大鼠患側(cè)紋狀體內(nèi)caspase-1和GSDMD的表達(dá)及激活水平，降低了IL-1β和IL-18的表達(dá)水平，說明抑制caspase-1顯著抑制了ICH大鼠腦組織中的細(xì)胞焦亡。這些結(jié)果表明，caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡在ICH大鼠的神經(jīng)損傷和神經(jīng)功能障礙中發(fā)揮重要作用。

2 ICH后激活的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)特有的固有免疫細(xì)胞，約占腦內(nèi)所有細(xì)胞總數(shù)的5%~10%［18］。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損害時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)分鐘即被激活，并遷移到損傷部位［19-20］。激活后的小膠質(zhì)細(xì)胞存在M1和M2兩種狀態(tài)：M1狀態(tài)下的小膠質(zhì)細(xì)胞主要作用為釋放多種促炎因子來(lái)加強(qiáng)炎癥反應(yīng)，例如IL-1β、IL-18和MCP-1等［21］，M2狀態(tài)下的小膠質(zhì)細(xì)胞主要作用則為抑制炎癥反應(yīng)［22-23］。當(dāng)小膠質(zhì)細(xì)胞被過度活化，其釋放大量的促炎細(xì)胞因子、趨化因子和氧化代謝物等會(huì)加劇神經(jīng)損傷［24］。有研究顯示，ICH發(fā)生后數(shù)分鐘內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞即被激活，且主要表現(xiàn)為M1型，產(chǎn)生IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加重腦組織損傷［25］。雖然我們的研究結(jié)果顯示，ICH大鼠腦組織中發(fā)生caspase-1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞焦亡，但焦亡發(fā)生在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)還是神經(jīng)元內(nèi)仍不清楚。為了進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證，我們采用免疫熒光雙標(biāo)和免疫熒光與TUNEL共染色的方法進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示，ICH大鼠血腫周圍腦組織中GSDMD和TUNEL陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著增加，Ac-YVAD-CMK可以顯著減少GSDMD和TUNEL陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量。然而，對(duì)照組與ICH組大鼠血腫周圍腦組織中GSDMD陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量無(wú)顯著差異。這些結(jié)果說明ICH大鼠腦組織中caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡主要發(fā)生在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)。

Figure 5.The results of double immunofluorescence labeling and co-staining of immunofluorescence and TUNEL.A：representative microphotographs and quantitative analysis of GSDMD-positive microglia in the surrounding tissues of hematoma；B：repre?sentative microphotographs and quantitative analysis of TUNEL-positive microglia in the surrounding tissues of hematoma；C：representative microphotographs and quantitative analysis of GSDMD-positive neurons in the surrounding tissues of he?matoma.The scale bar=50μm.Mean±SEM.n=6.**P<0.01 vs sham group；#P<0.05，##P<0.01 vs ICH group.圖5 免疫熒光雙標(biāo)和免疫熒光與TUNEL共染色結(jié)果

Figure 6.Western blot results showed that Ac-YVAD-CMK in?hibited the expression of IL-1β（A）and IL-18（B）.Mean±SEM.n=6.*P<0.05，**P<0.01 vs sham group；#P<0.05 vs ICH group.圖6 Ac-YVAD-CMK抑制IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)

綜上所述，大鼠ICH發(fā)生后，小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，發(fā)生caspase-1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞焦亡，釋放大量炎癥因子，造成周圍神經(jīng)元退化，導(dǎo)致神經(jīng)損傷和神經(jīng)功能障礙。然而，造成小膠質(zhì)細(xì)胞激活和神經(jīng)元退化的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。