黑加侖果實(shí)降解多糖理化特性、結(jié)構(gòu) 及體外降血糖活性

徐雅琴，楊海紅，李大龍，陳 哲，王麗波，楊 昱,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

近年來(lái)，植物多糖因其廣泛的生物活性、功能性和低毒性而備受關(guān)注[1-3]。多糖的生物活性與其分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)等密切相關(guān)[2,4-5]。天然多糖大多分子質(zhì)量大、水溶性差，限制了其在體內(nèi)發(fā)揮生理作用[2,3,6]。研究表明，通過(guò)降解手段降低多糖的分子質(zhì)量可有效提高多糖生物活性[2,6]。

目前多糖降解方法主要包括化學(xué)降解（氧化降解、酸解等）、物理降解（超聲波降解、輻射降解、高壓降解等）和酶解[2-3,7-8]。其中H2O2氧化降解法和超聲波降解法具有高效、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于多糖的降解中。超聲輔助氧化降解可以將兩種方法的優(yōu)勢(shì)結(jié)合，協(xié)同發(fā)揮作用。如Li Junhui等利用超聲輔助VC-H2O2法制備低分子質(zhì)量果膠多糖，結(jié)果表明超聲提高了 VC-H2O2反應(yīng)體系對(duì)果膠分子的降解效率，其主要通過(guò)增加自由基數(shù)量、降低化學(xué)反應(yīng)的活化能及超聲波的機(jī)械效應(yīng)實(shí)現(xiàn)[9]。此外，研究表明超聲輔助氧化降解法沒(méi)有改變多糖的主要結(jié)構(gòu)，但能夠有效降低多糖分子質(zhì)量，提高多糖生理活性[9-11]。

黑加侖作為一種有益健康的小漿果，含有多糖、多酚（花色苷、黃酮、酚酸等）和各種有機(jī)酸等活性 物質(zhì)[12]。研究表明黑加侖果實(shí)含有不同組分的多糖，不同提取方法得到的多糖組分也不同[8,13-14]；同時(shí)，黑加侖果實(shí)多糖具有抗氧化、降血糖、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理活性[8,13]。本課題組前期針對(duì)熱水提取及復(fù)合酶提取得到的黑加侖果實(shí)多糖存在分子質(zhì)量較大、水溶性差的問(wèn)題，分別采用超聲波和Fe2+-H2O2法對(duì)黑加侖果實(shí)多糖進(jìn)行了降解，結(jié)果顯示經(jīng)降解處理后，黑加侖果實(shí)多糖分子質(zhì)量明顯降低，抗氧化活性顯著提高，而其主要結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)生變化[13,15]。因此，采用適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)黑加侖果實(shí)多糖進(jìn)行降解是改善其生物活性的有效手段。目前，關(guān)于超聲波輔助Fe2+-VC-H2O2法對(duì)黑加侖多糖進(jìn)行降解還鮮見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，且黑加侖多糖某些功能特性如吸濕和保濕性能也鮮見(jiàn)研究。故本實(shí)驗(yàn)以微波輔助溶劑法提取得到的高分子質(zhì)量黑加侖果實(shí)多糖為原料，利用超聲波輔助Fe2+-VC-H2O2法降解，并對(duì)兩種降解多糖的理化特性、結(jié)構(gòu)及體外降血糖活性進(jìn)行研究。以期拓寬黑加侖多糖的應(yīng)用范圍，并為進(jìn)一步探究多糖和結(jié)構(gòu)之間的構(gòu)效關(guān)系提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘黑豐’黑加侖果實(shí)由黑龍江省農(nóng)科院牡丹江農(nóng)科所提供，果實(shí)清洗并真空包裝后，置于-20 ℃冰箱冷凍保存。

D4006大孔吸附樹(shù)脂 南開(kāi)大學(xué)化工廠；瓊脂糖凝膠Sepharose 6B、對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG） 上海源葉生物科技有限公司；阿卡波糖 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品 北京拜爾迪生物公司；α-葡萄糖苷酶（100 U/g） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；α-淀粉酶（3 700 U/g） 北京博奧拓達(dá)科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XH-800C電腦雙控微波消解儀 北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；TU-1901紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器公司；7890B氣相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；JY92-IIV超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；ALPHA-T傅里葉變換紅外光譜儀 德國(guó)Bruker公司；2695/2414高效液相色譜儀 美國(guó)Waters 公司；AVANCEIII 500 MHz核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）波譜儀 德國(guó)Bruker公司；STA 449/F5同步熱分析儀 耐馳科學(xué)儀器商貿(mào)（上海）有 限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑加侖果實(shí)降解多糖的制備

采用課題組前期方法[8]，以黑加侖果實(shí)為原料，微波輔助溶劑法提取多糖，經(jīng)D4006大孔樹(shù)脂初步純化后，得到黑加侖果實(shí)多糖。將4.0 mL H2O2（1 mol/L）、4.0 mL VC（1 mol/L）和0.5 mL FeSO4加入到25.0 mL多糖溶液（2.0 mg/mL）中。混合液置于超聲波細(xì)胞粉碎儀中，且超聲探頭浸沒(méi)于液面2 cm處。在超聲功率600 W下，分別超聲40 min和60 min。超聲后的多糖溶液經(jīng)去離子水透析（透析膜截留分子質(zhì)量3 500 Da，透析72 h），真空濃縮、凍干，得到兩種降解粗多糖。

將兩種降解多糖配制成15.0 mg/mL的溶液，負(fù)載在Sepharose 6B（2.6 cm×60 cm）柱上純化。以去離子水為洗脫劑，上樣量為1.0 mL，洗脫流速為0.8 mL/min。洗脫液每管收集1 mL，繪制洗脫曲線。 采用苯酚-硫酸法測(cè)定洗脫液的吸光度，通過(guò)吸光度跟蹤檢測(cè)多糖含量[16]，收集主要多糖組分，經(jīng)濃縮、凍干后，得兩種純化降解多糖DP-1和DP-2。利用公式（1）計(jì)算多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

式中：ρ為苯酚-硫酸法測(cè)定的多糖質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為樣品溶液體積/mL；m為凍干樣品的質(zhì)量/mg。

1.3.2 降解多糖理化性質(zhì)測(cè)定

1.3.2.1 pH值、粒徑和溶解度測(cè)定

配制質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的多糖溶液，室溫下利用pH計(jì)測(cè)定其pH值。將20.0 mg降解多糖溶于適量去離子水中，離心后取上清液，25 ℃下利用動(dòng)態(tài)光散射粒度檢測(cè)分析儀測(cè)定粒徑。參考Chen Jialun等的方法[17]測(cè)定降解多糖的溶解度。

1.3.2.2 分子質(zhì)量測(cè)定

采用高效液相色譜法測(cè)定降解多糖的分子質(zhì)量。首先，以不同分子質(zhì)量（T-10、T-40、T-70、T-110和T-2000）的葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品配制溶液（2.0 mg/mL）。溶液經(jīng)0.45 μm過(guò)濾器過(guò)濾后進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μL，以超純水為流動(dòng)相，流速為0.6 mL/min，測(cè)定保留時(shí)間。根據(jù)保留時(shí)間與分子質(zhì)量，利用GPC軟件擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。相同條件下，測(cè)定多糖溶液（2.0 mg/mL）的出峰時(shí)間，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算DP-1和DP-2的分子質(zhì)量。

1.3.2.3 單糖組成分析

根據(jù)文獻(xiàn)[14]測(cè)定多糖中單糖組成。將40.0 mg多糖樣品溶解在2.0 mL三氟乙酸（2.0 mol/L）溶液中，110 ℃條件下水解4 h。將酸水解后的樣品和單糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行乙?；?，利用氣相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 熱穩(wěn)定性分析

采用同步熱分析儀分析降解多糖的熱行為。在流速為50 mL/min的N2中進(jìn)行，升溫速率為10 ℃/min，測(cè)定溫度范圍為30～600 ℃。

1.3.4 吸濕性與保濕性測(cè)定

1.3.4.1 吸濕性

多糖吸濕性測(cè)定參考文獻(xiàn)[6]并稍加修改。多糖在105 ℃的烘箱條件下，烘干至恒質(zhì)量，并在干燥器中室溫冷卻。準(zhǔn)確稱(chēng)取100.0 mg多糖于干燥的培養(yǎng)皿上，將其放置于相對(duì)濕度為81%的干燥器中（干燥劑為飽和硫酸銨）。室溫條件下每隔1 h稱(chēng)量1 次質(zhì)量（共進(jìn)行13 h），以甘油為陽(yáng)性對(duì)照。通過(guò)公式（2）計(jì)算吸濕率。

式中：mt為時(shí)間t后樣品質(zhì)量/mg；m0為質(zhì)量恒定的樣品質(zhì)量/mg。

1.3.4.2 保濕性

將1.3.4.1節(jié)中吸水達(dá)到飽和的樣品放置于裝有硅膠的干燥器中，室溫下進(jìn)行保濕實(shí)驗(yàn)，每隔1 h稱(chēng)量1 次質(zhì)量（共進(jìn)行10 h），按公式（3）計(jì)算保濕率。

式中：m為吸水達(dá)到飽和的樣品質(zhì)量/mg；mt為時(shí)間t后的樣品質(zhì)量/mg；m0為質(zhì)量恒定的樣品質(zhì)量/mg。

1.3.5 降解多糖的結(jié)構(gòu)表征

1.3.5.1 傅里葉變換紅外光譜分析

采用KBr壓片法對(duì)多糖進(jìn)行壓片處理，在4 000～ 500 cm-1范圍內(nèi)，利用傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)兩種降解多糖進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.3.5.2 高碘酸氧化分析

高碘酸氧化分析參考文獻(xiàn)[18]的方法并略作修改。將30.0 mg多糖溶于30.0 mL高碘酸鈉溶液（15.0 mmo1/L） 中，在室溫條件下避光反應(yīng)。每隔6 h取0.1 mL反應(yīng)溶液，用去離子水定容至25.0 mL。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定223 nm波長(zhǎng)處吸光度，待吸光度穩(wěn)定后加入乙二醇終止反應(yīng)。根據(jù)高碘酸鈉濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到消耗高碘酸鈉物質(zhì)的量。以酚酞為指示劑，用0.008 0 mol/L氫氧化鈉溶液滴定反應(yīng)溶液，計(jì)算生成的甲酸物質(zhì)的量。

1.3.5.3 NMR分析

將20.0 mg多糖用D2O溶解于NMR管中，在500 MHz NMR儀中進(jìn)行1H-NMR和13C-NMR測(cè)定。

1.3.6α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[13]，測(cè)定不同質(zhì)量濃度（0.2～2.0 mg/mL） 的多糖樣品對(duì)α-淀粉酶（底物為淀粉）和α-葡萄糖苷酶（底物為pNPG）的抑制活性，以阿卡波糖作為陽(yáng)性對(duì)照。按公式（4）計(jì)算α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率。

式中：Aa為樣品實(shí)驗(yàn)組的吸光度（樣品+酶+底物的吸光度）；Ab為樣品對(duì)照組的吸光度（樣品+底物的吸光度）；Ac為空白實(shí)驗(yàn)組的吸光度（酶+底物的吸光度）；Ad為空白對(duì)照組的吸光度（底物的吸光度）。

1.3.7α-淀粉酶抑制動(dòng)力學(xué)分析

參考文獻(xiàn)[8]，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程研究降解多糖對(duì)α-淀粉酶的抑制動(dòng)力學(xué)，確定降解多糖的抑制類(lèi)型，并通過(guò)雙倒數(shù)曲線計(jì)算Ki值。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以3 次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解多糖的理化性質(zhì)

由表1可知，DP-1和DP-2多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)接近，并且都是酸性多糖。同DP-1相比，DP-2的分子質(zhì)量降低了17.05%，且平均粒徑較小。超聲降解和氧化（Fe2+-VC-H2O2） 降解具有協(xié)同作用，超聲波可以促進(jìn)Fe2+催化VC-H2O2體系產(chǎn)生更多·OH，該自由基會(huì)進(jìn)攻多糖鏈，經(jīng)過(guò)一系列化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致糖苷鍵斷裂，分子質(zhì)量降低[7,9,11]。 兩種降解多糖均由6 種單糖構(gòu)成，不同單糖相對(duì)含量不同，表明超聲波輔助Fe2+-VC-H2O2法降解沒(méi)有改變多糖的組成。此外，DP-1和DP-2的溶解度分別為 （24.50±0.02）mg/mL和（26.30±0.03）mg/mL，高于原黑加侖果實(shí)多糖的溶解度（（19.30±0.03）mg/mL）[8]， 由此可見(jiàn)，超聲波輔助Fe2+-VC-H2O2降解提高了多糖的溶解度。

表1 DP-1、DP-2的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of DP-1 and DP-2

2.2 降解多糖的熱重分析結(jié)果

熱重分析（thermogravimetric analysis，TGA）曲線如圖1所示，DP-1和DP-2的TGA曲線類(lèi)似，主要分為3 個(gè)階段。第一階段（30～150 ℃），多糖質(zhì)量損失較小，約為7%，主要來(lái)自多糖自由水和結(jié)合水的蒸發(fā)。第二階段（150～430 ℃），多糖出現(xiàn)明顯的質(zhì)量損失，在該階段中 DP-1、DP-2的質(zhì)量損失率分別為56.09%和57.28%，其中DP-1和DP-2開(kāi)始降解的溫度分別為178.12 ℃和188.64 ℃（質(zhì)量損失率達(dá)到10%時(shí)的溫度）。此階段質(zhì)量明顯減少歸因于多糖鏈的熱分解，從而產(chǎn)生氣體或者發(fā)生碳化，包括羧基脫羧反應(yīng)和糖鏈斷鍵等[19]。第三階段（430～600 ℃），多糖的質(zhì)量損失減緩，DP-1、DP-2質(zhì)量分別減少了7.87%和6.56%。最終，DP-1和DP-2總質(zhì)量損失分別為71.32%和70.72%，均略低于原黑加侖果實(shí)多糖（71.92%）[8]。研究發(fā)現(xiàn)，從室溫升高到590 ℃，白色和黃色羽扇豆多糖總質(zhì)量損失率分別為78.21%和74.75%[20]；而從25 ℃升高至180 ℃鷹嘴豆殼多糖質(zhì)量損失率為73.30%[21]，均高于黑加侖降解多糖熱重?fù)p失。因此，兩種黑加侖降解多糖具有一定的熱穩(wěn)定性。

圖1 DP-1和DP-2的TGA曲線Fig.1 Thermogravimetric analysis curves of DP-1 and DP-2

2.3 降解多糖的吸濕性和保濕性分析結(jié)果

由圖2A可知，多糖和甘油的吸濕率隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增大，在5 h之前DP-2的吸濕率明顯高于DP-1和甘油。11 h時(shí)DP-1和DP-2吸濕能力趨于飽和，吸濕率分別為（51.90±1.76）%和（66.08±1.63）%，明顯低于甘油（（92.65±1.71）%）。由圖2B可知，多糖及甘油的保濕率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而下降?？傮w上，甘油的保濕效果優(yōu)于DP-1和DP-2。在10 h時(shí)DP-1、DP-2和甘油的保濕率分別為（30.73±1.03）%、（37.14±0.93）%和（52.25±0.49）%。多糖具有吸濕與保濕能力主要是由于多糖分子中存在的羥基、羧基等親水基，這些基團(tuán)可與水分子形成氫鍵，從而達(dá)到吸濕和保濕的效果[6,22]。此外，多糖分子間相互交纏形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對(duì)其保水性也具有重要影響[23]。

圖2 DP-1和DP-2的吸濕（A）與保濕（B）能力Fig.2 Moisture absorption (A) and retention (B) capacity of DP-1 and DP-2

2.4 降解多糖的結(jié)構(gòu)表征結(jié)果

2.4.1 傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

兩種多糖的傅里葉變換紅外光譜見(jiàn)圖3，多糖DP-1和DP-2的紅外譜圖類(lèi)似，在4 000～500 cm-1范圍內(nèi)均具有明顯的多糖特征吸收峰。在3 403.40、2 901.61 cm-1和1 726.51 cm-1處的吸收峰歸因于O—H、C—H和C＝O伸縮振動(dòng)[14]。1 608.86 cm-1和1 427.42 cm-1附近的吸收峰歸因于COO-的伸縮振動(dòng)，說(shuō)明兩種多糖中含有糖醛酸[8,24]。 此結(jié)果和氣相色譜測(cè)定結(jié)果一致。1 097.14 cm-1和1 017.76 cm-1處對(duì)應(yīng)的強(qiáng)吸收峰證明存在吡喃糖苷[4,13]。此外，在908.61 cm-1和820.73 cm-1處的吸收峰表明存在α-和β-型糖苷鍵[8,25]。

圖3 DP-1和DP-2的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.3 FTIR spectra of DP-1 and DP-2

2.4.2 高碘酸氧化分析結(jié)果

通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算和滴定分析結(jié)果可知，多糖DP-1和DP-2分別消耗0.164 mmol和0.167 mmol的高碘酸，并且生成了0.068 mmol和0.070 mmol的甲酸，高碘酸的消耗量是甲酸生成量的兩倍多。這些結(jié)果證明，降解多糖中存在1→或1→6、1→2或1→2,6、1→4或1→4,6連接的糖苷鍵[1,18]。

2.4.3 NMR光譜分析結(jié)果

由圖4A、B可知，DP-1和DP-2的NMR光譜圖相似，信號(hào)峰主要集中在δH3.0～5.3和δC60.0～110.0，屬于多糖信號(hào)峰。兩種多糖在δH4.0～5.3和δC90.0～110.0出現(xiàn)的異頭信號(hào)表明其均存在α-和β-構(gòu)型的糖苷鍵[2,8]，這與紅外光譜得到的結(jié)果一致。由1H NMR和13C NMR譜圖可知DP-1和DP-2 H1/C1的化學(xué)位移。DP-1 H1/C1的化學(xué)位移為5.10/109.21、5.18/98.22、5.01/98.01、4.82/100.34、4.55/107.47、4.50/103.39；DP-2 H1/C1的化學(xué)位移為5.10/108.31、5.18/99.07、5.01/98.04、4.82/102.98、4.55/105.56、4.50/103.22?？梢?jiàn)異頭信號(hào)的化學(xué)位移相近，推測(cè)兩種多糖有相同的糖殘基。此外，在δC170附近的信號(hào)峰表明糖鏈中存在糖醛酸。在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，依據(jù)異頭碳和氫的化學(xué)位移及高碘酸氧化分析結(jié)果，推測(cè)這兩種多糖含有相同的6 種糖殘基，分別為→3)-α-L-Araf-(1→[8]、→2)-α-L-Rhap-(1→[4,26]、→4)-α-DGalAp-(1→[8,27]、→4)-β-D-Manp-(1→[1]、→6)-β-DGalp-(1→[28]和→3,6)-β-D-Glcp-(1→[5]。

圖4 DP-1和DP-2的核磁共振譜圖Fig.4 NMR spectra of DP-1 and DP-2

2.5 降解多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性

α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制劑可抑制淀粉、糖原等水解成葡萄糖，延緩淀粉、糖原等在小腸中的吸收，降低餐后血糖水平[8,29]。因此，作為口服降糖藥物，天然的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制劑引起了人們廣泛的關(guān)注。DP-1和DP-2對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用如圖5所示，多糖質(zhì)量濃度在0.2～1.0 mg/mL的范圍內(nèi)增加，對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制率增加。而當(dāng)多糖質(zhì)量濃度從1.0 mg/mL增加至2.0 mg/mL 時(shí)，抑制率變化較小且趨于穩(wěn)定。多糖質(zhì)量濃度為 2.0 mg/mL時(shí)，DP-1、DP-2和阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，分別為（67.45±3.45）%、（73.22±0.48）%和（89.92±2.26）%，半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為0.63、0.48 mg/mL和0.23 mg/mL。 多糖質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時(shí)，DP-1、DP-2和阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶抑制率最高，分別為（64.74±2.08）%、（73.28±2.52）%和（76.86±1.65）%，IC50分別為0.33、0.24 mg/mL和0.17 mg/mL?？梢?jiàn)兩種多糖對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶有較明顯的抑制作用，但均低于阿卡波糖。多糖DP-1和DP-2對(duì)兩種酶具有抑制作用，主要是這兩種多糖糖鏈上含有羥基和羧基，可以和消化酶的氨基酸殘基結(jié)合，從而抑制酶的活性[30]。阿卡波糖是一種治療餐后高血糖癥的臨床藥物，但阿卡波糖治療經(jīng)常伴有如腹脹和腹瀉[29,31]等副作用。

圖5 DP-1和DP-2對(duì)α-葡萄糖苷酶（A）和α-淀粉酶（B）的抑制作用Fig.5 Inhibitory effects of DP-1 and DP-2 on α-glucosidase (A) and α-amylase (B)

2.6 降解多糖對(duì)α-淀粉酶抑制動(dòng)力學(xué)

多糖對(duì)α-淀粉酶抑制作用的雙倒數(shù)曲線（Lineweaver-Burk）見(jiàn)圖6A、B。隨多糖質(zhì)量濃度的增加 （0～1.0 mg/mL），曲線與縱坐標(biāo)截距保持不變，表明vmax保持不變；而米氏常數(shù)Km（x軸截距的負(fù)倒數(shù)）隨多糖質(zhì)量濃度增大而增大。因此DP-1和DP-2對(duì)α-淀粉酶為競(jìng)爭(zhēng)型抑制[8,29]。根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)性抑制動(dòng)力學(xué)方程[32]可得，DP-1和DP-2的Ki值分別為0.40 mg/mL和0.27 mg/mL，可見(jiàn)低分子質(zhì)量多糖DP-2對(duì)α-淀粉酶抑制作用更明顯，此結(jié)果和2.5節(jié)得到的結(jié)論一致。

圖6 DP-1（A）和DP-2（B）對(duì)α-淀粉酶的抑制動(dòng)力學(xué)Fig.6 Inhibition kinetics of DP-1 (A) and DP-2 (B) on α-amylase

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助Fe2+-VC-H2O2法制備的兩種降多糖同本課題組先前報(bào)道的原黑加侖果實(shí)多糖相比[8]， 多糖鏈糖殘基構(gòu)成相同，但分子質(zhì)量明顯降低。此外，本課題組前期研究表明，原黑加侖果實(shí)多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制的IC50分別為0.82 mg/mL和0.69 mg/mL[8]； 本研究中兩種降解多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的IC50均小于原黑加侖果實(shí)多糖。因此與原黑加侖果實(shí)多糖相比，降解多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性顯著增加。原因是多糖分子質(zhì)量的降低使位于多糖內(nèi)核中的活性基團(tuán)暴露，形成多糖和酶的復(fù)合物，從而有效抑制酶活性[2,30]。Zhi Zijian等采用超聲輔助Fe2+-H2O2降解高分子質(zhì)量的肝素（酸性多糖）并探討其降解機(jī)理及低分子質(zhì)量肝素的抗凝血活性。結(jié)果表明，同單獨(dú)超聲或氧化降解相比，超聲輔助氧化降解可以產(chǎn)生更多羥自由基，利于解聚高分子，是制備低分子質(zhì)量肝素高效和簡(jiǎn)便的方法；此外該方法得到的低分子質(zhì)量肝素主要結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變，但是抗凝血活性顯著升高，副作用減小[11]。Li Junhui等采用超聲輔助H2O2-VC 降解果膠多糖，結(jié)果表明此方法不僅加速了降解過(guò)程，提高了降解效率，且增強(qiáng)了果膠降解多糖抗腫瘤活性[9]。 由此可見(jiàn)采用超聲波輔助氧化法可有效降低天然多糖分子質(zhì)量，進(jìn)而改善多糖的生物活性。

4 結(jié) 論

超聲波輔助Fe2+-VC-H2O2法制備的兩種降解多糖（DP-1和DP-2）屬于酸性雜多糖，由阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸構(gòu)成。DP-1和DP-2具有相同結(jié)構(gòu)特征，含有6 種糖殘基；且均具有一定的吸濕、保濕能力和熱穩(wěn)定性，具有作為添加劑應(yīng)用于化妝品和食品行業(yè)的潛力。此外，這兩種多糖對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均具有明顯的抑制作用，且對(duì)α-淀粉酶為競(jìng)爭(zhēng)型抑制。