酶法修飾對(duì)大豆分離蛋白凝膠性質(zhì) 影響的研究進(jìn)展

王佳蓉，丁陽月，姜云慶，董和亮，王秋野，程建軍,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，黑龍江 哈爾濱 150028）

隨著現(xiàn)代大豆加工業(yè)的發(fā)展，目前可利用的大豆蛋白種類和產(chǎn)品日益增多，如脫脂大豆粉、大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）、大豆?jié)饪s蛋白及大豆組織蛋白等[1]。其中SPI是以低溫脫溶大豆粕為原料，去除可溶性及不可溶性碳水化合物、灰分等得到的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)90%（干基）以上的一種全價(jià)蛋白，具有來源廣泛、經(jīng)濟(jì)價(jià)值以及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高等特點(diǎn)，是一種被廣泛應(yīng)用的食品基料[2]。

SPI分子經(jīng)熱處理而發(fā)生解聚，未折疊分子通過二硫鍵、氫鍵、疏水相互作用和/或范德華力發(fā)生不可逆排列和聚集，從而形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[3-4]。SPI凝膠具有較高的黏度、彈性和可塑性，既可以作為水、糖類和其他物質(zhì)的載體，也可作為風(fēng)味物質(zhì)。近年來，SPI凝膠常被用作新型食品包材[5-6]。該類包裝薄膜常具有適度的機(jī)械性能以及突出的氧與油脂阻隔能力；此外，SPI凝膠的物理性質(zhì)與肌肉蛋白（尤其是肌球蛋白）凝膠類似，在肉品工業(yè)中還常被用作黏合劑[7]，以改善粉碎肌肉食品的功能特性。同時(shí)，SPI凝膠還可用作生產(chǎn)具有緊密組織狀結(jié)構(gòu)的肉類類似物[8]，以降低配方成本，具有較高的增值潛力。在醫(yī)藥方面，基于SPI凝膠制得的生物聚合物納米載體[9-10]可以防止藥物受到工藝和環(huán)境條件的破壞，將藥物安全地輸送到靶向器官和細(xì)胞。

然而，因加工過程和工藝參數(shù)的差異，SPI的凝膠性質(zhì)常受到破壞；其中采用“堿溶酸沉”傳統(tǒng)方法生產(chǎn)的SPI往往發(fā)生部分變性。特別是因SPI分子質(zhì)量較大，一旦體系堿性降低，靜電斥力隨之減弱，蛋白質(zhì)會(huì)迅速折疊與聚集，最終常會(huì)以熱力學(xué)穩(wěn)定的水不溶性大聚集體和/或 沉淀形式出現(xiàn)[11]，對(duì)其凝膠性能產(chǎn)生不利影響。為了更好地滿足食品工業(yè)發(fā)展的需要，通常要對(duì)SPI進(jìn)行改性。

與物理、化學(xué)改性相比，酶法改性不僅能改善蛋白的各種功能特性，而且還具有安全性高、專一性強(qiáng)、能提高SPI制品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等優(yōu)點(diǎn)。有很多研究者在此方面做了大量研究，例如趙新淮等[12]將SPI經(jīng)胰蛋白酶酶解后，發(fā)現(xiàn)其凝膠性得到顯著改善，主要表現(xiàn)在SPI的凝膠結(jié)構(gòu)變得更為緊密。酶法修飾是大豆蛋白降解改性方法中的一種，通過限制性水解肽鍵，可使大豆蛋白體系中的官能團(tuán)暴露量增加，為后續(xù)改性提供更多的反應(yīng)位點(diǎn)。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)酶法修飾對(duì)SPI凝膠性能產(chǎn)生影響的作用機(jī)理主要包括利用酶限制性水解蛋白的肽鍵或酰胺鍵以暴露出更多的SPI反應(yīng)位點(diǎn)、連接特殊的功能基團(tuán)以及增加蛋白分子間/內(nèi)交聯(lián)3 個(gè)方面[13]。因此，本研究分析了SPI凝膠的形成機(jī)理，重點(diǎn)討論了3 種酶法修飾手段（即限制性酶解、酶誘導(dǎo)的側(cè)鏈接枝反應(yīng)以及酶誘導(dǎo)的交聯(lián)反應(yīng)）對(duì)于SPI凝膠性能（如凝膠強(qiáng)度、持水能力以及凝膠表面形貌等）產(chǎn)生的影響，為以SPI凝膠為基質(zhì)的產(chǎn)品生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1 SPI凝膠形成機(jī)理

凝膠是由變性蛋白分子經(jīng)聚集而形成的具有特定空間結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。這種特定的空間結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)分子間斥力（如靜電斥力與蛋白質(zhì)的水合作用）與引力（如靜電引力、蛋白質(zhì)分子間/內(nèi)氫鍵、二硫鍵、疏水相互作用及范德華力）達(dá)到平衡（圖1）的作用結(jié)果[14-15]。此外，凝膠在微觀上表現(xiàn)為蛋白分子間的引力與斥力達(dá)到平衡，在宏觀上則表現(xiàn)為形成了半固體倒置不流動(dòng)的膠狀物質(zhì)。此外，蛋白質(zhì)凝膠的形成還與諸多外界條件，如溫度、pH值或離子強(qiáng)度有關(guān)，這些因素增強(qiáng)了原來有限的蛋白質(zhì)-蛋 白質(zhì)相互作用，弱化了蛋白質(zhì)的水合作用，從而誘導(dǎo)凝膠形成；在酶法修飾SPI的凝膠形成過程中，外界條件可能會(huì)通過影響酶的活性從而影響最終的凝膠性能[16-17]。

圖1 SPI分子中的化學(xué)鍵[14]Fig.1 Chemical bonds in SPI molecules[14]

1.1 SPI熱凝膠的形成

SPI凝膠的制備主要是通過高溫處理或加入鹽類、酸類凝固劑等方法。大多數(shù)球蛋白經(jīng)加熱可形成凝膠，SPI中球蛋白相對(duì)含量最高可達(dá)90%[18]，故SPI受熱時(shí)易形成凝膠。SPI熱凝膠的形成一般包括4 個(gè)階段[19-20]（圖2）：1）天然SPI球蛋白的小聚集體在加熱過程中解離；2）分離后的蛋白再次結(jié)合，形成半徑在30～50 nm致密且近似球形的顆粒；3）這些顆粒隨機(jī)聚集，形成分形維數(shù)約為2的自相似聚集體，且這些聚集體中蛋白分子間的鍵作用力足夠強(qiáng)，可以抵抗外力的破壞；4）這些聚集體之間通過各種相互作用形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

圖2 熱致SPI凝膠化示意圖[19-20]Fig.2 Schematic diagram of thermally induced SPI gelation[19-20]

1.2 SPI冷凝膠的形成

Bryant等[21]發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)冷凝膠的形成可以分為兩個(gè)階段：1）熱變性球蛋白溶液的制備；2）在室溫下誘導(dǎo)變性蛋白的凝膠化，其中誘導(dǎo)因素包括酸和鹽兩種。

利用熱變性的大豆蛋白溶液可以通過逐漸酸化來誘導(dǎo)形成凝膠。SPI的酸化方式[22]主要有兩種：1）當(dāng)體系中有產(chǎn)酸微生物存在時(shí)，在乳酸發(fā)酵過程中，糖代謝成乳酸，使pH值逐漸降低[23-24]；2）利用葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯（glucono-δ-lactone，GDL）誘導(dǎo)凝膠的形成（圖3）。這主要因?yàn)镚DL是水溶性的，可緩慢地水解成葡萄糖酸，使體系pH值均勻下降且操作過程無需攪攔。當(dāng)體系的pH值向蛋白質(zhì)等電點(diǎn)靠近時(shí)，蛋白分子間的靜電斥力逐漸減小，通過隨機(jī)聚集誘導(dǎo)凝膠形成。此類凝膠通常由大的隨機(jī)聚集體組成，最終會(huì)形成較粗糙的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)。

圖3 GDL酸誘導(dǎo)大豆蛋白凝膠[22]Fig.3 Glucono-δ-lactone acid induced soybean protein gelation[22]

鹽誘導(dǎo)也是SPI冷凝膠形成的常用途徑，不同鹽離子對(duì)SPI凝膠的作用機(jī)制差異較大[25]，其中較為常用的是向大豆蛋白溶液中添加鈣離子鹽，可以通過Ca2+的“鹽橋”作用充當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子帶電羧基間的橋梁，以降低蛋白質(zhì)分子間的靜電斥力，誘導(dǎo)SPI三維凝膠結(jié)構(gòu)形成[26-27]。Kao等[27]研究發(fā)現(xiàn)，與其他凝固劑（如MgCl2、MgSO4和CaCl2）相比，利用CaSO4制備形成的凝膠結(jié)構(gòu)更均勻、平滑。

2 限制性酶解改善SPI凝膠性

2.1 限制性酶解

Lamsal等[28]發(fā)現(xiàn)通過控制SPI的酶水解過程可以獲得具有所需特定功能的成分。其中，具有高凝膠強(qiáng)度和高黏度的大豆蛋白可以在粉碎的肉制品和肉汁中用作保水劑，而具有較弱凝膠特性和低黏度的大豆蛋白則在酸奶、湯料和嬰兒配方食品中應(yīng)用廣泛。水解對(duì)蛋白質(zhì)凝膠的增強(qiáng)作用是水解產(chǎn)物的特殊性質(zhì)，Panyam等[29]發(fā)現(xiàn)酶水解會(huì)導(dǎo)致蛋白水解產(chǎn)物的分子質(zhì)量降低，電離基團(tuán)數(shù)目增加，同時(shí)使先前包埋于分子內(nèi)部的疏水性基團(tuán)暴露。關(guān)于酶解處理對(duì)SPI凝膠性能的影響，早期研究主要集中在水解對(duì)大豆蛋白凝乳與即食豆腐的生產(chǎn)中[30-31]。鐘芳等[32]通過添加6 種商用蛋白酶誘導(dǎo)大豆蛋白膠凝以制備速凝豆腐粉，并探究此過程體系黏彈性質(zhì)的變化，研究發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶具有較強(qiáng)使大豆蛋白膠凝的 能力；同時(shí)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)通過添加以上兩種酶誘導(dǎo)SPI膠凝，維持凝膠結(jié)構(gòu)的主要作用力是氫鍵和疏水相互作用（次級(jí)鍵），而離子鍵和二硫鍵的貢獻(xiàn)則較低[32-33]。

根據(jù)酶解后蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的范圍及酶解程度，可將蛋白酶解過程分為輕度酶解（約90%的多肽分子質(zhì)量大于5 000 Da）、中度酶解（約46%的多肽分子質(zhì)量大于5 000 Da）及深度酶解（90%的多肽分子質(zhì)量小于500 Da）3 類[28]。其中限制性酶解（輕度或中度酶解）與SPI凝膠性能關(guān)系密切，這主要因?yàn)槟z的形成有賴于蛋白分子間的相互作用，而水解程度過高可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)-蛋 白質(zhì)相互作用減少、水解物表面疏水性降低和/或水解肽之間電荷排斥力增加，降低酶解蛋白的凝膠能力，以及引起食品中不良風(fēng)味“苦味肽”的產(chǎn)生[34-35]；反之，適當(dāng)?shù)乃獬潭扔欣陔逆溨蟹磻?yīng)位點(diǎn)的暴露，可以增加蛋白分子間相互作用的可能性[36]。Creusot等[30]的研究表明，適度的酶促水解可使埋藏在蛋白分子內(nèi)部的非極性氨基酸殘基暴露，增強(qiáng)蛋白分子間的疏水相互作用，改善凝膠結(jié)構(gòu)。

2.2 限制性酶解對(duì)SPI熱致凝膠性質(zhì)的影響

酶解處理對(duì)SPI凝膠性能的改變是具有高度酶特異性的[12,27-28,37]，為實(shí)現(xiàn)對(duì)SPI水解過程的控制，了解常用蛋白酶的作用特性意義重大（表1）。趙新淮等[12]通過添加中性蛋白酶和胰蛋白酶在不同水解度（1%和2%）下對(duì)SPI進(jìn)行酶解，發(fā)現(xiàn)經(jīng)中性蛋白酶在較低水解度下處理后，SPI的凝膠性能良好；而經(jīng)胰蛋白酶處理后，SPI的凝膠性可以得到顯著改善。這主要是因?yàn)橹行缘鞍酌复呋磻?yīng)的作用位點(diǎn)比胰蛋白酶多，水解程度大，水解產(chǎn)物分子質(zhì)量較低，由此會(huì)形成較弱的凝膠結(jié)構(gòu)。Hr?ková等[17]通過添加Alcalase堿性蛋白酶、Novo蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶對(duì)脫脂大豆粉進(jìn)行酶解，發(fā)現(xiàn)經(jīng)風(fēng)味酶水解處理后，大豆蛋白凝膠強(qiáng)度顯著提高。這是因?yàn)轱L(fēng)味蛋白酶兼有內(nèi)切蛋白酶與外切肽酶兩種活性，產(chǎn)生的作用效果更明顯。此外，部分研究還發(fā)現(xiàn)菠蘿蛋白酶會(huì)對(duì)SPI凝膠的硬度造成損害。Fuke等[37]發(fā)現(xiàn)采用菠蘿蛋白酶誘導(dǎo)SPI凝膠化時(shí)，菠蘿蛋白酶主要作用于大豆球蛋白，并將其水解成低分子質(zhì)量片段繼而誘導(dǎo)蛋白聚集；與熱致SPI凝膠相比，經(jīng)菠蘿蛋白酶誘導(dǎo)的凝膠結(jié)構(gòu)較柔軟。Lamsal等[28]采用菠蘿蛋白酶對(duì)大豆蛋白產(chǎn)品正己烷脫脂豆粉、擠壓膨化大豆粉、大豆?jié)饪s蛋白和SPI進(jìn)行水解改性，使其水解度分別達(dá)到2%和4%，結(jié)果表明在水解過程中盡管儲(chǔ)能模量下降明顯，但水解產(chǎn)物一直保有膠凝能力；而與未水解的大豆蛋白產(chǎn)品相比較，經(jīng)水解后，蛋白凝膠的硬度均有所下降。

表1 SPI酶解過程中商用酶的種類及特征Table 1 Types and characteristics of commercial enzymes used for SPI enzymatic hydrolysis

2.3 限制性酶解對(duì)SPI酸致凝膠性質(zhì)的影響

由于SPI的水解過程可以在室溫下發(fā)生，因此酶水解是改善SPI冷凝膠性質(zhì)一種有效手段。Kuipers等[16]通過Carlsberg枯草桿菌蛋白酶制備了水解度高達(dá)10%的SPI水解產(chǎn)物，并添加GDL誘導(dǎo)冷凝膠形成，研究表明隨著水解度的增加，SPI水解物的凝膠化起始pH值也會(huì)提升，凝膠變得更柔軟。比較明顯的是，未水解的SPI在pH值約為6.0時(shí)形成凝膠，而水解度5%的SPI水解液在pH值約為7.6時(shí)方可形成凝膠。由此可知，在中性或弱酸性的食品中，可以通過控制水解度來提高SPI凝膠化的起始pH值。

3 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶誘導(dǎo)的側(cè)鏈接枝與交聯(lián)反應(yīng)改善SPI 凝膠性

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（transglutaminase，TG）現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于改善包括大豆蛋白、小麥蛋白、豌豆蛋白、乳清蛋白、酪蛋白、肌原纖維蛋白和肌球蛋白在內(nèi)的多種食物蛋白的凝膠性和質(zhì)構(gòu)特性[42]。

TG作用機(jī)制可分為3 類[43-44]：1）氨基導(dǎo)入交聯(lián)：這也是TG途徑[45]糖基化過程的反應(yīng)機(jī)理，近年來有關(guān)酶催化接枝反應(yīng)對(duì)SPI凝膠性能影響的研究主要集中在探究TG誘導(dǎo)的SPI糖基化接枝反應(yīng)；2）共價(jià)交聯(lián)作用：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)中有賴氨酸、谷氨酰胺等含氨基氨基酸存在時(shí)，該交聯(lián)即可發(fā)生（圖4）；3）脫酰氨基反應(yīng)：體系中無氨基存在時(shí)，水會(huì)成為?；荏w，發(fā)生催化水解，谷氨酰胺殘基脫去氨基生成谷氨酸殘基。

圖4 TG催化的共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)[44]Fig.4 TG-induced covalent cross-linking reaction[44]

TG的催化會(huì)促使蛋白結(jié)構(gòu)改變，從而引起蛋白質(zhì)的多種功能特性（如凝膠性、熱穩(wěn)定性、乳化性、保水性、流變性等）發(fā)生變化，獲得新型的SPI產(chǎn)品。催化技術(shù)的新方向是利用酶對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行不切割的共價(jià)修飾。 研究發(fā)現(xiàn)，添加TG誘導(dǎo)的各種反應(yīng)都會(huì)對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu) 產(chǎn)生影響，這會(huì)導(dǎo)致其功能性質(zhì)發(fā)生變化，影響蛋白的溶解性、凝膠性、乳化性、起泡性與黏性等，并獲得更穩(wěn)定、復(fù)雜且具有增強(qiáng)或創(chuàng)新質(zhì)構(gòu)特性的產(chǎn)物[46]（圖5）。

圖5 TG催化的反應(yīng)對(duì)蛋白功能性質(zhì)的影響[46]Fig.5 Effects of transglutaminase (TG)-induced reactions on the functional properties of proteins[46]

3.1 TG誘導(dǎo)的糖基化接枝反應(yīng)改善SPI凝膠性

Fan Junfu[47]、Yang Anshu[48]和Li Weiwei[49]等研究發(fā)現(xiàn)SPI經(jīng)糖基化接枝改性，可以將親水性的糖類物質(zhì)以共價(jià)鍵的方式插入蛋白質(zhì)分子中，使糖基化蛋白既具有蛋白質(zhì)的功能特性，又具有糖類物質(zhì)的親水能力。

SPI經(jīng)酶解處理后，蛋白中的有序結(jié)構(gòu)含量迅速減少，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量增多，使蛋白的折疊結(jié)構(gòu)打開更充分，有利于后續(xù)接枝反應(yīng)的進(jìn)行。Zhang Yating等[50]以SPI和麥芽糊精為主要原料，采用蛋白酶解-糖基化接枝和糖基化接枝-蛋白酶解兩種復(fù)合改性手段制備多功能食品乳化穩(wěn)定劑；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過以上兩種途徑制備的微膠囊表面均呈現(xiàn)均一、多孔的顯微結(jié)構(gòu)。

3.2 TG誘導(dǎo)的交聯(lián)反應(yīng)改善SPI凝膠性

SPI凝膠的形成依賴于分子間/內(nèi)作用力的平衡，Qin Χinsheng等[51-52]的研究表明TG在SPI的交聯(lián)過程中可以誘導(dǎo)分子間二硫鍵的形成，降低體系游離巰基的含量，從而明顯改善SPI凝膠的流變性，形成更致密均勻的凝膠三維網(wǎng)絡(luò)。Χing Guangliang等[53-54]在以大豆蛋白/牛奶蛋白為原料研制“生物豆腐”的過程中發(fā)現(xiàn)，添加TG可以有效地控制能量的攝入以及降低蛋白的致敏性?？傮w而言，添加TG可以使SPI中的賴氨酸免受化學(xué)反應(yīng)的破壞，且酶促反應(yīng)條件溫和而廣泛，有助于改善蛋白凝膠的彈性和保水能力。與其他化學(xué)交聯(lián)劑如單寧酸、京尼平等相比，TG具有更高的安全性與經(jīng)濟(jì)性。

在任何以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的食品體系中，TG催化的共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)都比酰基轉(zhuǎn)移和脫酰胺反應(yīng)進(jìn)行得更快[44]。即使在相當(dāng)?shù)偷牡鞍诐舛认拢琓G也可誘導(dǎo)形成具有高彈性和不可逆的凝膠結(jié)構(gòu)[55]。將與TG混合的蛋白溶液平鋪于玻璃板上并烘干后，可獲得透明、耐水和耐熱的蛋白薄膜，這種蛋白膜可被消化酶緩慢消化。相反，未經(jīng)TG處理的薄膜和凝膠則會(huì)立即被消化酶消化。此外， 水包油型乳液中的蛋白也可被TG誘導(dǎo)形成凝膠。此外，TG催化異源蛋白，可誘導(dǎo)形成具有更優(yōu)異機(jī)械性質(zhì)和流體力學(xué)性質(zhì)的雜聚合物凝膠（圖6）。

圖6 由TG催化的異源蛋白間的交聯(lián)[55]Fig.6 Crosslinking between heterologous proteins catalyzed by TG[55]

近幾年的研究中，TG主要被用于催化異源蛋白間的交聯(lián)，這為更精確地改變凝膠食品的微觀結(jié)構(gòu)和質(zhì)構(gòu)特性提供了更大的可操作性。在凝膠類食品的冷凍和解凍過程中，伴隨著冰晶的形成與消失，使得凝膠質(zhì)地受損，影響產(chǎn)品的整體品質(zhì)；研究發(fā)現(xiàn)，明膠具有控制產(chǎn)品中冰晶生長(zhǎng)的能力[56]，Chen Zhenjia等[57]為改善SPI凝膠的凍融穩(wěn)定性，利用TG催化SPI與明膠交聯(lián)制備混合蛋白凝膠，發(fā)現(xiàn)將此復(fù)合凝膠體系冷凍保存后，凝膠的持水率提高，凝膠結(jié)構(gòu)也得到有效保護(hù)。此外，明膠還具備優(yōu)異的成膜能力，可與SPI凝膠協(xié)同使用，現(xiàn)已將此特性用于制作新型食品包裝材料[58]、豆腐乳[59]等。綜上，應(yīng)用TG催化異源蛋白混合制備復(fù)合凝膠，可使SPI和明膠劣勢(shì)性能得到改良。Cui Qiang等[60]應(yīng)用TG催化SPI和乳清分離蛋白交聯(lián)制備復(fù)合凝膠，其中乳清分離蛋白的凝膠性較差，SPI的乳化性較差，將SPI與乳清分離蛋白復(fù)合使用可使兩者優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)。Qin Χinsheng等[51-52]通過TG催化SPI和小麥面筋蛋白交聯(lián)，SPI中富含賴氨酸但缺乏谷氨酰胺，這與小麥面筋蛋白的性質(zhì)截然相反，二者交聯(lián)有助于相互均衡與改良攝入的營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)。此外，由TG催化的交聯(lián)反應(yīng)也存在一定弊端，主要是因?yàn)樵摻宦?lián)反應(yīng)形成了較高分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)聚合物，對(duì)改性蛋白的溶解度、乳化特性和體外消化率等產(chǎn)生了不 利影響[52-53]。Sheng Wenwen等[61]應(yīng)用TG交聯(lián)SPI和明膠后，使用胰蛋白酶對(duì)復(fù)合凝膠材料進(jìn)行水解，發(fā)現(xiàn)水解產(chǎn)物比SPI具有更強(qiáng)的流變性能和持水能力，比SPI與明膠的交聯(lián)凝膠產(chǎn)物具有更好的乳化和吸油能力。這表明經(jīng)TG催化的交聯(lián)產(chǎn)物經(jīng)蛋白酶進(jìn)一步水解后，可能會(huì)對(duì)復(fù)合凝膠的性能有改良作用，是一種潛在的新型食品加工蛋白原料。

4 其他酶誘導(dǎo)的交聯(lián)反應(yīng)改善SPI凝膠性

漆酶作為一種糖蛋白可以氧化酚羥基在內(nèi)的多種底物，底物中的電子在漆酶的作用下可以轉(zhuǎn)移到氧分子上形成水，漆酶的作用底物廣泛且活性高[62-63]。SPI中的酪氨酸和甜菜果膠中的阿魏酸均可被漆酶高效利用。Feng Liping等[62]以甜菜果膠/SPI為基質(zhì)通過漆酶催化與熱誘導(dǎo)交聯(lián)制備乳液填充凝膠，發(fā)現(xiàn)添加適當(dāng)濃度的乳液有利于改善凝膠的質(zhì)構(gòu)特性和微觀結(jié)構(gòu)；而當(dāng)添加乳液質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到10%時(shí)，凝膠的硬度、黏性達(dá)到最高值，可形成性能穩(wěn)定的緩釋輸送系統(tǒng)。

過氧化物酶是一種血紅素酶，與漆酶類似，過氧化物酶也可作用于多糖中的阿魏酸與蛋白質(zhì)中的酪氨酸，催化多糖與蛋白交聯(lián)形成復(fù)合凝膠。Yan Jinxin等[64]使用過氧化物酶和Ca2+兩種交聯(lián)劑分別誘導(dǎo)阿拉伯木聚糖（arabinoxylans，AΧ）和SPI形成凝膠網(wǎng)絡(luò)，制備混合凝膠。研究發(fā)現(xiàn)，雙誘導(dǎo)AΧ-SPI混合凝膠比AΧ凝膠的內(nèi)部結(jié)構(gòu)更加規(guī)則且均勻。傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果表明，過氧化物酶可誘導(dǎo)AΧ中的阿魏酸與SPI中的酪氨酸產(chǎn)生交聯(lián)。此外，以不同順序加入兩種誘導(dǎo)劑形成的復(fù)合凝膠結(jié)構(gòu)也存在差異；當(dāng)先加入Ca2+時(shí)，SPI分子快速聚集產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)，阻礙AΧ分子的交聯(lián)。這也表明通過調(diào)整交聯(lián)劑的加入順序，可以制備出具有不同力學(xué)性能和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的凝膠。

5 酶法修飾與其他技術(shù)結(jié)合改善SPI凝膠性

5.1 酶解與其他技術(shù)結(jié)合

天然SPI因具有復(fù)雜的三、四級(jí)結(jié)構(gòu)[36]使其酶促反應(yīng)速率低下，在研究中將酶解與其他處理手段，如熱變性[65]、 超聲等相結(jié)合，可以增加SPI的酶切位點(diǎn)。Lamsal等[28]發(fā)現(xiàn)天然與變性SPI在水解過程中的表現(xiàn)截然不同，天然的球狀蛋白通常對(duì)酶水解有抗性，因?yàn)镾PI緊密的三級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)保護(hù)蛋白分子中的肽鍵；而變性蛋白與大多數(shù)經(jīng)過加工的大豆蛋白產(chǎn)品類似，分子內(nèi)部的反應(yīng)位點(diǎn)已暴露出來?？紤]到SPI酶解過程的高成本，加熱已成為一種最高效、直接的輔助處理手段。

5.2 TG催化交聯(lián)反應(yīng)與其他技術(shù)結(jié)合

將TG處理與蛋白物理改性技術(shù)相結(jié)合可明顯改善SPI的凝膠性能，該復(fù)合改性技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于豆腐、奶酪、肉類蛋白、香腸、火腿腸和蛋白飲料等食品蛋白凝膠工業(yè)中。Cui Qiang等[60]發(fā)現(xiàn)經(jīng)超聲處理后，利用TG催化交聯(lián)的SPI/乳清蛋白復(fù)合凝膠強(qiáng)度和持水率均顯著提高，這可能是由于超聲處理產(chǎn)生的空化效應(yīng)使蛋白分子內(nèi)部基團(tuán)暴露，增加了TG作用位點(diǎn)。此外，Zhou Guowei等[66]發(fā)現(xiàn)適度的超聲處理（360 W）可以提高SPI凝膠的凍融穩(wěn)定性。Qin Χinsheng等[42]的研究也表明，適當(dāng)?shù)奈⒉A(yù)處理（700 W）可加速蛋白結(jié)構(gòu)的展開和反應(yīng)位點(diǎn)的暴露，促進(jìn)酶促交聯(lián)反應(yīng)。Qin Χinsheng等[51]還探討了超高壓（100～400 MPa）預(yù)處理對(duì)TG誘導(dǎo)的SPI和小麥面筋蛋白混合凝膠特性的作用，發(fā)現(xiàn)超高壓處理可誘導(dǎo)SPI/面筋蛋白分子內(nèi)去折疊和聚集，促使體系中游離巰基含量和表面疏水性增加，最終形成更致密均勻的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

6 結(jié) 語

SPI凝膠用途日漸廣泛，大量研究發(fā)現(xiàn)天然SPI凝膠性能較差，因此使用多種手段來改善其功能特性。其中， 酶法處理已被證實(shí)對(duì)SPI凝膠結(jié)構(gòu)有著明顯的修飾效果，且更多元的酶改性方式也逐漸被探索。酶法修飾對(duì)SPI凝膠性能的作用方式主要有3 種：1）利用蛋白酶限制性水解蛋白的肽鍵或酰胺鍵以暴露出更多的SPI反應(yīng)位點(diǎn)，而且酶解處理對(duì)SPI凝膠性能的改變具有高度酶特異性，主要與不同種類酶的活性中心、作用方式有關(guān)。2）利用酶使蛋白側(cè)鏈連接特殊的功能基團(tuán)，如利用TG誘導(dǎo)SPI的糖基化接枝反應(yīng)，使改性糖基化蛋白既具有蛋白質(zhì)的功能特性，又具有糖類物質(zhì)的親水特性，同時(shí)有助于SPI凝膠表面形貌的改善。3）酶誘導(dǎo)蛋白分子間/分子內(nèi)的交聯(lián)會(huì)對(duì)蛋白的凝膠、乳化和起泡性質(zhì)有明顯改善效果；此外，利用TG、漆酶及過氧化物酶等催化SPI與其他蛋白交聯(lián)，形成性能互補(bǔ)的新型SPI凝膠現(xiàn)已成為研究熱點(diǎn)。

近年來，對(duì)SPI采用復(fù)合處理手段進(jìn)行改性逐漸成為一大研究熱點(diǎn)，但總體還存在過程復(fù)雜、轉(zhuǎn)化率低、產(chǎn)品得率低等問題，故未能充分運(yùn)用到生產(chǎn)中。今后可從以下幾個(gè)方面對(duì)SPI的凝膠化進(jìn)行深入研究：1）探討如何將酶修飾處理手段與其他處理手段協(xié)同以平衡不同因素的負(fù)面影響，同時(shí)將酶修飾手段與新型加工技術(shù)（脈沖電場(chǎng)、脈沖光技術(shù)）相結(jié)合研究其對(duì)SPI凝膠品質(zhì)和功能性的影響。2）研究SPI凝膠結(jié)構(gòu)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的包埋和輸送傳遞的控制以及如何通過多種技術(shù)的結(jié)合獲得更穩(wěn)定和高效的凝膠聚集體。3）熱量對(duì)豆奶顆粒特性與凝膠化行為的影響尤為顯著，通過分析熱量在豆奶和豆奶凝膠加工中的作用，將有助于設(shè)計(jì)特定的加熱條件以生產(chǎn)新型的SPI凝膠制品。4）SPI與異源蛋白混合形成的凝膠具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)與性能，但對(duì)凝膠體系質(zhì)構(gòu)與營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響還有待探究。5）將其他來源的球狀蛋白與SPI進(jìn)行功能特性的比較，有助于深入了解多種球蛋白并開發(fā)新型產(chǎn)品。6）不同加工過程與其他食品填充物料對(duì)SPI凝膠結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)的影響也有待研究。