食品中常見過敏原及檢測技術(shù)研究進(jìn)展

寧亞維，楊 正，馬夢戈，劉 茁，陳 藝，趙忠情，李 強(qiáng)*，張 巖*

（1.河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050000）

食物過敏是指過敏原蛋白引起的異?；蜻^強(qiáng)的免疫反應(yīng)，從免疫學(xué)機(jī)制而言，可以將食物過敏反應(yīng)分為4 種類型，即：免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）E介導(dǎo)的I型超敏反應(yīng)、II型細(xì)胞毒性超敏反應(yīng)、III型免疫復(fù)合型超敏反應(yīng)以及T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)性超敏反應(yīng)。目前可以從廣義的角度將食物過敏分為IgE介導(dǎo)和非IgE介導(dǎo)兩大類，其中以IgE介導(dǎo)的食物過敏反應(yīng)最為常見。IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)是指過敏原與特異性抗體形成復(fù)合物后，與細(xì)胞（如肥大細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞）相結(jié)合，隨后細(xì)胞釋放組胺、5-羥色胺及白三烯等大量活性介質(zhì)[1]，這些物質(zhì)作用于組織與器官，引起局部或者全身性的過敏反應(yīng)。誘發(fā)非IgE介導(dǎo)的食物過敏所需食物量較大，臨床表現(xiàn)為一系列 胃腸道紊亂，如過敏蛋白刺激產(chǎn)生的結(jié)腸炎、乳糜瀉等主要由非IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)引起[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，食物過敏的患病率在成人中約為5%，兒童由于自身免疫器官發(fā)育尚未成熟，過敏性疾病的患病率約為8%[3]。雖然一些兒童過敏患者隨著年齡增長可自愈，但大部分過敏反應(yīng)會(huì)伴隨患者終身[4]。食物過敏原是指能使機(jī)體產(chǎn)生過敏反應(yīng)的抗原分子，一般為蛋白質(zhì)或者糖蛋白。過敏原蛋白主要通過食物攝入，少數(shù)過敏原蛋白氣化后由呼吸道吸入[5]。 大多數(shù)食物過敏原具有極高的穩(wěn)定性，不僅耐高溫高壓，同時(shí)耐水解、耐消化[6]。例如雞蛋中的主要過敏原卵白蛋白經(jīng)過烘烤和煮沸后，近紫外光譜學(xué)檢測結(jié)果顯示其三級結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化[7]，原因在于其含有較多二硫鍵，形成的高度穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)不容易被降解以及失去活性[8]。采取恰當(dāng)?shù)姆椒梢圆糠纸档瓦^敏原的致敏性，目前食品過敏原的消減技術(shù)主要有化學(xué)法、物理法和微生物發(fā)酵法[9-10]，由于微生物發(fā)酵法對食品風(fēng)味、質(zhì)地破壞程度小而得到了更多關(guān)注，但目前相關(guān)的微生物資源還十分有限，同時(shí)微生物的分子機(jī)制和菌株特異性以及臨床試驗(yàn)效果方面還需要進(jìn)一步闡述。因此目前避免食用過敏原仍然是保護(hù)過敏人群健康的唯一有效手段[11]， 國外一些發(fā)達(dá)國家要求對食品生產(chǎn)過程中的潛在過敏原進(jìn)行標(biāo)識，例如美國、日本以及歐盟等國家對致敏物質(zhì)清單和食物過敏原標(biāo)識方式管理等方面都有詳細(xì)的 說明[12-14]。而我國對食物過敏原的標(biāo)簽法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)要求還在起步階段，對過敏原的標(biāo)識也沒有采取強(qiáng)制的規(guī)定[15]。 事實(shí)上，食品標(biāo)簽難以對食品在生產(chǎn)、運(yùn)輸和存儲(chǔ)過程中由于交叉污染產(chǎn)生的過敏原進(jìn)行標(biāo)注[16]，此外食品行業(yè)過度使用預(yù)防標(biāo)簽會(huì)限制消費(fèi)者對商品的自由選擇，因此利用適當(dāng)?shù)臋z測技術(shù)來驗(yàn)證過敏原標(biāo)簽的準(zhǔn)確性，并評估食物過敏的潛在風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。

本綜述介紹了8 類常見致敏食品中主要過敏原的結(jié)構(gòu)與致敏特點(diǎn)，對常用的食物過敏原方法以及現(xiàn)階段一些新興的檢測技術(shù)進(jìn)行了綜述，并對檢測方法未來的發(fā)展方向進(jìn)行展望，期望能對促進(jìn)食物過敏原檢測方法的開發(fā)提供參考。

1 食品中常見過敏原

含有過敏原的食品高達(dá)170余種，其中最主要的食品有8 種，分別為大豆、小麥、堅(jiān)果、花生、牛奶、雞蛋、魚類、甲殼及貝類，引起約90%的過敏反應(yīng)[17]。食品中過敏原結(jié)構(gòu)與致敏特性的明確有助于過敏原檢測技術(shù)的開發(fā)，從而有助于推動(dòng)過敏原的標(biāo)識及相關(guān)法規(guī)的建立。常見食品中的主要過敏原的結(jié)構(gòu)與致敏特性如表1所示。

表1 食品中主要過敏原及致敏特性Table 1 Major food allergens and allergic symptoms caused by their ingestion

1.1 大豆

大豆引發(fā)的過敏為IgE抗體介導(dǎo)的速發(fā)型過敏反應(yīng)，會(huì)損害患者的皮膚系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)以及消化系統(tǒng)，引發(fā)蕁麻疹和皮疹等皮膚病，呼吸障礙、呼吸急促、哮喘等呼吸道疾病，腹痛、腹瀉等消化道癥狀，甚至?xí)?dǎo)致過敏人群發(fā)生過敏性休克[18]。世界過敏原數(shù)據(jù)庫收錄數(shù)據(jù)顯示，引起過敏反應(yīng)的大豆過敏原43 種，但大多數(shù)過敏反應(yīng)由兩種主要過敏原蛋白引起，即大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白。β-伴大豆球蛋白是由α’亞基、α亞基和β亞基組成的三聚體，大豆球蛋白是由包括G1、G2、G3、G4、G5在內(nèi)的5 個(gè)亞基組成的六聚體，組成這兩種過敏蛋白的各亞基具有免疫原性且蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在自然狀態(tài)下難以被破壞[19]。

1.2 小麥

小麥中蛋白含量占10%～15%，按其在不同溶劑中的溶解度不同主要分為4 類：清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和麥谷蛋白，這些蛋白成分是小麥中的重要營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也是小麥過敏原的主要來源[20]。與小麥過敏相關(guān)的疾病主要有小麥運(yùn)動(dòng)激發(fā)過敏癥、接觸性蕁麻疹、特異性皮炎、面包師哮喘癥、惡心嘔吐以及腹瀉等[21]，大多數(shù)小麥過敏涉及的是輕度反應(yīng)，在某些特殊情況下也會(huì)導(dǎo)致生命危險(xiǎn)。世界衛(wèi)生組織/國際免疫學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)過敏原命名小組分委員會(huì)已經(jīng)提供了13 種小麥過敏原，包括Tri a 14、Tri a 18、Tri a 19、Tri a 20、Tri a 25、Tri a 26、Tri a 36、Tri a 37、Tri a 41～Tri a 45[11]。其中，Tri a 14是一種非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白，是引起面包師哮喘癥和鼻炎的主要過敏原；Tri a 19 被認(rèn)為是主要的小麥過敏原，是導(dǎo)致小麥運(yùn)動(dòng)激發(fā)過敏癥的主要過敏蛋白[22]；Tri a 25是一種硫氧化蛋白，有研究表明硫氧化蛋白可以緩解過敏反應(yīng)，因此對于Tri a 25是否為過敏原尚存爭議；Tri a 36是引起食物過敏的主要蛋白，是一種低分子質(zhì)量的麥谷蛋白，有研究表明重組Tri a 36比 Tri a 19在小麥?zhǔn)澄镞^敏診斷中具有更高的敏感性[23]。

1.3 堅(jiān)果類

能夠引起過敏反應(yīng)的堅(jiān)果類食物主要包括杏仁、腰果、核桃、榛子、開心果、巴西堅(jiān)果等，過敏人群食用后，會(huì)出現(xiàn)胸悶、咽喉痛，呼吸困難以及惡心、胃痙攣，嘔吐腹瀉等癥狀。堅(jiān)果一般作為植物的種子或者果實(shí)，因此大多數(shù)堅(jiān)果蛋白屬于3 種保守的種子貯藏蛋白，包括2S白蛋白、7S豆球蛋白和11S豆球蛋白[24]。 2S白蛋白屬于醇溶蛋白超家族，此家族中的植物源性過敏原具有低分子質(zhì)量和序列中含有多個(gè)半胱氨酸殘基的特征。通常，8 個(gè)半胱氨酸參與建立4 條鏈內(nèi)的二硫鍵，構(gòu)成蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)所必需的α-螺旋。醇溶蛋白超家族的大多數(shù)過敏原由于其結(jié)構(gòu)小而緊湊，對熱、pH值和胃腸道酶具有高度耐受性。多種堅(jiān)果中的蛋白成分屬于2S白蛋白，如巴西堅(jiān)果（Ber e 1）、 核桃（Jug r 1）、榛子（Cor a 14）、腰果（Ana o 3）、開心果（Pis v 1）。另外兩種種子貯藏蛋白7S豆球蛋白和11S豆球蛋白屬于Cupin超家族。7S球蛋白通常為三聚體蛋白，其亞基分子質(zhì)量為40～80 kDa，7S球蛋白的氨基酸序列不包含半胱氨酸，因此缺乏二硫鍵，蛋白的穩(wěn)定性較弱。11S球蛋白是成熟的三聚體蛋白，每個(gè)亞基由分子質(zhì)量在30～40 kDa之間的酸性亞基和20 kDa左右的堿性亞基組成，兩個(gè)亞基都由二硫鍵連接。屬于這兩類蛋白的堅(jiān)果過敏成分有核桃（7S球蛋白Jug r 2、11S球蛋白Jug r 4）、腰果（7S球蛋白Ana o 1、11S球蛋白Ana o 2）、榛子（7S球蛋白Cor a 11、11S球蛋白Cor a 9）。此外，其他堅(jiān)果類中的主要過敏原也經(jīng)常引起人體過敏反應(yīng)，如杏仁過敏原Pru du 6、山核桃過敏原Car i 4、榛子果仁過敏原Cor a 9、巴西堅(jiān)果過敏原Ber e 2、腰果過敏原Ana o 2、開心果過敏原Pis v 2/5、核桃過敏原Jug n/r 4等[25]。由于堅(jiān)果類食物眾多，新的堅(jiān)果類食物過敏原可能還會(huì)被持續(xù)發(fā)現(xiàn)。

1.4 花生

花生常引起食物過敏反應(yīng)，過敏癥狀包括血管性水腫、低血壓、腹痛到危及生命的哮喘和過敏性休克等[26]。 目前花生中已鑒定出16 種蛋白質(zhì)過敏原，并將其命名為Ara h 1～17，由于Ara h 4與Ara h 3的序列重復(fù)率大于90%，因此2012年Ara h 4被重新命名為Ara h 3.0201，將其與Ara h 3作為相同的過敏原[27]。50%以上過敏患者血清IgE檢測結(jié)果表明，最常見的花生過敏原為Ara h 1～3和Ara h 6。這4 種過敏原都是種子貯藏蛋白，Ara h 1屬于種子貯藏蛋白中的7S球蛋白，Ara h 3屬于11S球蛋白，而Ara h 2和Ara h 6都屬于2S白蛋白。研究表明Ara h 2和 Ara h 6比Ara h 1和Ara h 3更耐高溫和蛋白酶，可能是由于存在較多二硫鍵，導(dǎo)致了過敏反應(yīng)的持久性[28-30]，花生過敏被多數(shù)國家認(rèn)定為最嚴(yán)重的食物過敏之一。

1.5 牛奶

牛奶含有豐富的蛋白質(zhì)，主要包括酪蛋白和乳清蛋白兩類，分別占乳蛋白總量的80%和20%。乳蛋白是主要的食物過敏原，常引起嬰幼兒過敏性疾病。牛奶過敏通常表現(xiàn)為濕疹、特異性皮膚炎等皮膚癥狀以及惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉和大便干燥等消化道癥狀。牛奶中的過敏原主要有3 種，分別是酪蛋白以及乳清蛋白中的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白[31]。酪蛋白分為4 個(gè)亞型：α-S1酪蛋白、α-S2酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白，它們的結(jié)構(gòu)特征為存在一個(gè)中心疏水部分和親水層的磷酸化位點(diǎn)。其中α-S1酪蛋白是4 個(gè)亞型中致敏性最強(qiáng)的，有近70%的無序結(jié)構(gòu)，只有少量的二級結(jié)構(gòu)，如α-螺旋或β-折疊；α-乳白蛋白屬于c-型溶菌酶/α-乳白蛋白家族，是一種參與乳糖合成的鈣結(jié)合蛋白，側(cè)鏈結(jié)構(gòu)由大量α-螺旋以及β-折疊組成，穩(wěn)定性高，保護(hù)其內(nèi)部不受 溶劑的破壞[32]；β-乳球蛋白是脂質(zhì)轉(zhuǎn)載蛋白家族的一員，作為脂質(zhì)、激素、類固醇等的轉(zhuǎn)運(yùn)體，存在于反芻動(dòng)物的乳清蛋白中，由6 個(gè)不同的短肽鏈片段組成，主要位于β鏈，在過敏原表面形成一個(gè)平坦區(qū)域[33]。由于α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和酪蛋白這3 種主要的牛奶過敏原在牛奶中的含量豐富，因此導(dǎo)致較高的牛奶過敏發(fā)生率。

1.6 雞蛋

雞蛋也是引起食物過敏的主要食品之一，過敏癥狀主要表現(xiàn)為濕疹、皮炎和風(fēng)團(tuán)疹，消化道出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、胃食道反流等。雞蛋中的主要過敏原有6 種，蛋黃中存在2 種，分別是α-卵黃蛋白和卵黃糖蛋白；蛋清中有4 種，分別是卵類黏蛋白、卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和溶菌酶，這4 種蛋白分別占蛋清蛋白總量的11%、54%、12%和3.5%[34]。卵類黏蛋白的分子質(zhì)量約為28 kDa，由186 個(gè)氨基酸殘基組成，含有9 個(gè)二硫鍵，分子結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，因此其對熱加工以及胰蛋白酶酶解處理均具有很好的耐受性。卵白蛋白在蛋清蛋白中的含量最豐富，致敏能力較強(qiáng)，分子質(zhì)量約為44.5 kDa，由385 個(gè)氨基酸殘基組成，含有一個(gè)二硫鍵和多個(gè)巰基基團(tuán)。卵轉(zhuǎn)鐵蛋白是一種易溶解的非結(jié)晶蛋白，致敏性也比較強(qiáng)，分子質(zhì)量約為77.9 kDa，由686 個(gè)氨基酸殘基組成，分子內(nèi)含有15 個(gè)二硫鍵，卵轉(zhuǎn)鐵蛋白是蛋清蛋白中唯一一個(gè)轉(zhuǎn)鐵蛋白家族的糖蛋白，含有一個(gè)可以與Fe3+結(jié)合的位點(diǎn)，此位點(diǎn)賦予了其很多生物活性，同時(shí)與金屬離子相結(jié)合后結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。溶菌酶是一種較弱的過敏原，目前對溶菌酶更多的研究是在其抑菌性質(zhì)上，實(shí)際上溶菌酶也具有潛在的致敏性，溶菌酶分子質(zhì)量約14.3 kDa，由198 個(gè)氨基酸殘基組成，分子內(nèi)含有4 個(gè)二硫鍵，結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，但作為一種酶，其穩(wěn)定性會(huì)受到pH值的影響，pH值越低越不穩(wěn)定。

1.7 魚類

魚類肉質(zhì)鮮嫩且營養(yǎng)價(jià)值高，但是魚類常引起過敏人群發(fā)生食物過敏反應(yīng)。過敏癥狀主要表現(xiàn)為臉紅、蕁麻疹、惡心嘔吐、腹瀉、體溫逆轉(zhuǎn)、視力模糊等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀以及血壓下降、心傳導(dǎo)阻滯等心血管癥狀[35]。魚類主要過敏原為小清蛋白、醛縮酶和烯醇化酶。小清蛋白具有保守蛋白結(jié)構(gòu)，分子質(zhì)量為10～13 kDa，屬于食物過敏原中最大的蛋白質(zhì)家族之一的鈣結(jié)合蛋白。小清蛋白的熱穩(wěn)定性極高，對食品加工和酶消化的耐受能力極強(qiáng)，不容易通過物理化學(xué)方法去除，因此小清蛋白是導(dǎo)致70%以上的魚及魚類產(chǎn)品引起過敏反應(yīng)的原因[36]。其次，醛縮酶和β-烯醇化酶也是重要的魚類過敏原，分子質(zhì)量分別為40 kDa和47～50 kDa。醛縮酶和烯醇化酶對熱處理敏感，對食品加工的耐受度低于小清蛋白，因此過敏反應(yīng)的發(fā)生概率也低于小清蛋白。其中2013年的一項(xiàng)調(diào)查顯示，不同魚類中的致敏作用有13%～37%來自醛縮酶A，14%～56%來自β-烯醇化酶[37]。另一種魚類過敏原原肌球蛋白在貝類中作為重要的過敏原存在，但在魚類中引起的過敏反應(yīng)相對較少。在世界衛(wèi)生組織/國際免疫學(xué)聯(lián)合會(huì)僅有一種魚類過敏原被注冊，即莫桑比克羅非魚[38]。目前對于魚類中的原肌球蛋白研究甚少，尚需進(jìn)一步確定其他魚類中的原肌球蛋白是否會(huì)引起過敏反應(yīng)。此外，由于魚類產(chǎn)品種類繁多，除了上述過敏原外，仍不斷有其他潛在的魚類過敏原被發(fā)現(xiàn)，包括醛磷酸脫氫酶、磷酸三脂異構(gòu)酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和肌酸激酶等，然而這些分子的致敏特性仍有待確定。

1.8 甲殼及貝類

甲殼及貝類食品味道鮮美且營養(yǎng)豐富，然而因含有過敏原常引起過敏人群發(fā)生海鮮過敏反應(yīng)。過敏癥狀表現(xiàn)為惡心嘔吐、腹瀉腹痛的胃腸道癥狀，也會(huì)導(dǎo)致指尖和腳趾的刺痛感，甚至出現(xiàn)肌肉麻痹。甲殼及貝類過敏原主要存在于肉的可食用部分，其主要過敏原包括原肌球蛋白和精氨酸激酶[39]。原肌球蛋白被認(rèn)為是所有的可食用甲殼類動(dòng)物中都存在的無脊椎動(dòng)物泛變應(yīng)原，參與脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物的肌肉收縮。原肌球蛋白是由α-螺旋盤繞而成的同源二聚體蛋白質(zhì)，其螺旋結(jié)構(gòu)是由7 個(gè)氨基酸組成的重復(fù)序列，在整個(gè)蛋白質(zhì)的長度上與每個(gè)位于第一和第四位的疏水氨基酸的相互作用，這種二級和三級結(jié)構(gòu)賦予原肌球蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，因此能夠經(jīng)受高溫和高壓處理保持其致敏性[40]。另一種主要過敏原精氨酸激酶（arginine kinase，AK）廣泛分布于無脊椎動(dòng)物中，通常作為單體存在，但也觀察到一些二聚體。AK分子質(zhì)量為38～45 kDa，是一種熱不穩(wěn)定蛋白，有研究證實(shí)在經(jīng)過熱處理后其IgE反應(yīng)活性喪失，并且經(jīng)過熱處理和酸處理后致敏性降低[41]。除了上述兩種主要過敏原，還發(fā)現(xiàn)了一些其他能夠引起過敏反應(yīng)的甲殼及貝類過敏原，例如肌球蛋白輕鏈、肌質(zhì)鈣結(jié)合蛋白和肌鈣蛋白，這3 種過敏原能夠引起輕微的過敏反應(yīng)，過敏反應(yīng)頻率在15%～50%之間。此外還有許多未知的蛋白質(zhì)會(huì)引起甲殼類動(dòng)物的過敏反應(yīng)，這些蛋白質(zhì)的致敏特性尚不明確，還需進(jìn)一步的研究。

2 食物過敏原常用檢測技術(shù)

目前食物過敏原的常用檢測技術(shù)主要為：基于蛋白水平的免疫學(xué)檢測技術(shù)，包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法、免疫層析技術(shù)、免疫印跡技術(shù)以及生物傳感器技術(shù)；基于蛋白水平的非免疫學(xué)檢測技術(shù)質(zhì)譜技術(shù)；以及基因水平的分子生物學(xué)檢測方法，包括實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reation，PCR）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測（loop mediate isothermal amplification，LAMP）。同時(shí)，仍不斷有新的檢測技術(shù)被開發(fā)，用于準(zhǔn)確檢測食品中隱藏的過敏原以及降低生產(chǎn)過程中的交叉污染帶來的風(fēng)險(xiǎn)[42]，從而更好地保證過敏人群的生命健康。

2.1 基于蛋白水平的免疫學(xué)檢測技術(shù)

2.1.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法

ELISA法基于免疫酶的特點(diǎn)對待測物質(zhì)進(jìn)行免疫測定，檢測結(jié)果可根據(jù)底物與酶反應(yīng)后的產(chǎn)物顏色對抗原進(jìn)行定性或定量分析。ELISA法根據(jù)檢測原理以及檢測對象的不同分為多種類型，用于食物過敏原檢測的主要是夾心法和競爭法[43]。Orcajo等[44]開發(fā)了一種標(biāo)準(zhǔn)化的競爭性ELISA法用于檢測牛奶中主要過敏原β-乳球蛋白，通過優(yōu)化檢測條件、IgE與β-乳球蛋白比例和試劑濃度，確定了最佳檢測參數(shù)，最后β-乳球蛋白的檢測限低于0.2 mg/mL，提高了檢測方法的靈敏度。張潔瓊等[45]分別制備了兔和鼠多克隆抗體，建立了雙抗體夾心ELSIA法檢測中國甜杏仁過敏原蛋白苦杏仁球蛋白。結(jié)果表明，中國苦杏仁及美國大杏仁中苦杏仁球蛋白的檢測限分別為（12.11±1.70）μg/L和（18.95±1.52）μg/L，且與常見的14 種植物性蛋白沒有交叉反應(yīng)，表明該方法具有良好的特異性。ELISA法是目前在食物過敏原的檢測中應(yīng)用最廣泛的一種方法[46]，特異性強(qiáng)、靈敏度高，現(xiàn)階段多采用成品化的試劑盒進(jìn)行樣品檢測。ELISA法檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性依賴于抗體對致敏蛋白的識別，但由于食品加工過程中蛋白結(jié)構(gòu)的改變使抗體無法準(zhǔn)確識別結(jié)合部位，導(dǎo)致檢測靈敏度下降[47-48]，容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。雖然ELISA法存在一定局限性，但其仍是主要的食品過敏原定量方法，尤其是在檢測花生、大豆和雞蛋等過敏食物中的致敏組分應(yīng)用較廣。

2.1.2 免疫層析技術(shù)

免疫層析技術(shù)是酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)原理的擴(kuò)展應(yīng)用，層析時(shí)，標(biāo)記物與待測物之間形成的復(fù)合物被相應(yīng)的配體捕獲而聚集到硝化纖維膜上的檢測線上，之后復(fù)合物在膜上呈現(xiàn)出標(biāo)記物所帶有的顏色，最后可通過纖維膜上顯色條的有無、顏色的深淺和反射光線強(qiáng)弱等實(shí)現(xiàn)定性或定量檢測[49]。免疫層析技術(shù)多應(yīng)用于花生、榛子等堅(jiān)果的過敏原檢測，也有研究人員將其應(yīng)用到魚類過敏原的檢測中。李夢銀[50]建立了金磁免疫層析檢測方法對魚類及其制品中的小清蛋白進(jìn)行檢測，結(jié)果表明所制備的金磁免疫層析試紙條檢測特異性及檢測穩(wěn)定性良好，最低檢測質(zhì)量濃度為4 ng/mL，為檢測魚類中的小清蛋白提供了一種有效方法。免疫層析技術(shù)是將色譜層析和免疫技術(shù)相結(jié)合的一種快速分析方法，檢測的關(guān)鍵在于著色標(biāo)記物的靈敏度，隨著近代納米材料科學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了一些新型的納米材料如膠體金、膠體銀、超順磁性納米微球作為標(biāo)記物可以顯著提高檢測靈敏度，實(shí)現(xiàn)食品中痕量水平過敏原的檢測同時(shí)，基于其原理制備快速 檢測試紙，可以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測。因此應(yīng)用免疫層析檢測技術(shù)結(jié)合新型納米材料作為標(biāo)記物，優(yōu)化層析體系，提高檢測效率將是未來研究的熱點(diǎn)。

2.1.3 免疫印跡技術(shù)

免疫印跡技術(shù)，又稱蛋白質(zhì)印跡技術(shù)。該法首先利用凝膠電泳根據(jù)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的不同將樣品分離，隨后將凝膠上的蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，使用放射性物質(zhì)或者酶標(biāo)記抗體來進(jìn)行樣品的檢測與分析。免疫印跡技術(shù)主要用于食物過敏原的鑒定以及半定量分析，Willison等[51]利用小鼠單克隆抗體4C10對杏仁主要過敏原Pru du 6的構(gòu)象表位進(jìn)行定位，免疫印跡實(shí)驗(yàn)的分析中，該單克隆抗體與非還原性的Pru du 6發(fā)生反應(yīng)，證明了該過敏原構(gòu)象表位識別的準(zhǔn)確性。Harish Babu等[52]從濃縮的茄子皮以及層析物中獲得了茄子蛋白樣品，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白樣品分離后進(jìn)行免疫印跡分析，最后將茄子中重要的多酚氧化酶識別為重要過敏原。對于蛋白成分比較復(fù)雜的樣品，可以采用雙向免疫印跡技術(shù)實(shí)現(xiàn)蛋白樣品更高的分離程度，Lu Mei等[53]利用4 例大豆過敏者血清和6 例大豆致敏者血漿的雙向凝膠電泳免疫印跡法鑒定大豆IgE結(jié)合蛋白，并結(jié)合四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜從染色凝膠中分離出相應(yīng)的斑點(diǎn)，并對其進(jìn)行消化和分析。結(jié)果表明β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白為大豆中主要的過敏原。免疫印跡技術(shù)實(shí)現(xiàn)了凝膠電泳的高分辨率與固相免疫分析的結(jié)合，只需少量試劑即可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的快速、高靈敏度分析。但免疫印跡技術(shù)在樣品分析時(shí)花費(fèi)的時(shí)間過長，同時(shí)食品基質(zhì)的復(fù)雜性將會(huì)影響分析的準(zhǔn)確度。

2.1.4 生物傳感器技術(shù)

生物傳感器主要由生物識別元件和信號轉(zhuǎn)換元件兩大部分組成，通過將目標(biāo)分析物與識別元件進(jìn)行特異性結(jié)合后將產(chǎn)生的物理、化學(xué)信號轉(zhuǎn)化為可以檢測的光、電信號以達(dá)到檢測目的[54]。目前用于食物過敏原檢測的傳感器主要為免疫傳感器，根據(jù)測定原理的不同可進(jìn)一步分為電化學(xué)免疫傳感器、場效應(yīng)生物傳感器和表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）傳感器等。Ruiz-Valdepe?as等[55]報(bào)道了一個(gè)敏感的磁力免疫傳感器來檢測β-乳球蛋白，最低檢測限可達(dá)0.8 ng/mL，將該方法應(yīng)用于不同類型乳制品中β-乳球蛋白的檢測時(shí)，其檢測結(jié)果與商業(yè)ELISA方法提供的結(jié)果完全一致，因此有望成為一個(gè)可靠的替代方法。生物傳感器的識別元件有多種形式，開發(fā)新的識別方法并與其他技術(shù)聯(lián)用可以實(shí)現(xiàn)不同樣品的檢測。蔣棟磊[56]以食物過敏原作為 研究對象，將免疫系統(tǒng)中的RBL-2H3肥大細(xì)胞作為識別元件，結(jié)合電化學(xué)傳感、熒光質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、磁納米粒子標(biāo)記、微流控芯片等技術(shù)構(gòu)建了一系列快速、靈敏、新穎的細(xì)胞傳感器，為食品安全檢測研究提供了一條嶄新的途徑。近年來SPR生物傳感器得到了較多關(guān)注，Pollet等[57]報(bào)道了一種具有納米信號增強(qiáng)的光纖SPR生物傳感器檢測復(fù)雜食品基質(zhì)中的花生過敏原，采用磁鐵礦納米顆粒作為輔助標(biāo)記，將SPR生物測定Ara h 1的檢出限提高了兩個(gè)數(shù)量級，從9 μg/mL提高到0.09 μg/mL，同時(shí)SPR纖維可以很容易地再生，一根纖維可以重復(fù)使用35 次而不喪失敏感性。生物傳感器技術(shù)是一種快速檢測技術(shù)，具有靈敏度高、檢測成本低、檢測儀器微型化的優(yōu)勢，在開發(fā)生物傳感器技術(shù)時(shí)，需要充分考慮制備材料的性能，選擇合適的制備材料可以提高傳感器的檢測靈敏度。利用磁珠開發(fā)電化學(xué)免疫傳感器已被證明是一個(gè)有用的工具，可以提高其靈敏度，縮短分析時(shí)間，并降低基質(zhì)效應(yīng)。但目前生物傳感器技術(shù)儀器的制備復(fù)雜，對樣品預(yù)處理的要求高，這些在一定程度上限制了其實(shí)現(xiàn)商業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化。利用研制新型的納米材料來將其應(yīng)用到生物傳感器，可以實(shí)現(xiàn)樣品的快速優(yōu)化處理，將是免疫傳感器技術(shù)未來的發(fā)展趨勢。

2.2 基于基因水平的分子生物學(xué)檢測技術(shù)

2.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在體外模擬體內(nèi)的DNA復(fù)制，利用擴(kuò)增后的核酸產(chǎn)物來進(jìn)行樣品檢測。通過在PCR體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光基團(tuán)產(chǎn)生的熒光信號變化來動(dòng)態(tài)監(jiān)測整個(gè)反應(yīng)過程的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在食物過敏原的檢測中應(yīng)用更加廣泛。傳統(tǒng)PCR技術(shù)主要對樣品進(jìn)行定性檢測，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以實(shí)現(xiàn)多種復(fù)雜食品中過敏原的定性定量分析以及物種的鑒定。Sanchiz等[58]首次建立了一種以Cas s 9過敏原編碼基因?yàn)榘悬c(diǎn)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，在板栗與小麥的二元混合物中最低檢測限為100 mg/kg。此外，實(shí)時(shí)熒光定量PCR還適用于食品中痕量蛋白的檢測，Villa等[59]建立了一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)篩選用于復(fù)雜肉制品中的牛奶成分，結(jié)果顯示篩選出來的兩個(gè)線粒體基因（cytb和12S rRNA）以及兩個(gè)核基因（β-乳球蛋白和β-酪蛋白），在生肉以及金華火腿的樣品中牛奶濃縮蛋白的最低檢測限為500 mg/kg。 PCR技術(shù)與毛細(xì)管電泳技術(shù)的結(jié)合可以實(shí)現(xiàn)多種過敏原的同時(shí)檢測，有效提高了食物過敏原的檢測效率。Cheng Fang等[60]采用十重PCR技術(shù)結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)，同時(shí)檢測了榛子、開心果、燕麥、芝麻、花生、腰果、大麥、小麥、大豆和山核桃中的10 種常見食物過敏原。該方法的絕對檢測限在2～20 個(gè)單倍體基因組之間，在隨后的20 種商業(yè)食品的應(yīng)用中也驗(yàn)證了該方法的可靠性。 Suh等[61]利用多重PCR技術(shù)擴(kuò)增出4 種軟體動(dòng)物的特異性擴(kuò)增子和一個(gè)通用真核引物擴(kuò)增子，并與毛細(xì)管電泳技術(shù)相結(jié)合，建立了牡蠣、貽貝、鮑魚、蛤蜊原肌球蛋白基因和真核生物18S rRNA基因的多重PCR檢測方法，DNA的檢測限為16 pg，可以廣泛應(yīng)用于海鮮類食物 過敏原的檢測。實(shí)時(shí)定量PCR是在食品過敏原檢測中應(yīng)用最廣的一項(xiàng)基因水平檢測技術(shù)，相比于常規(guī)PCR，特異性更強(qiáng)，靈敏度更高，實(shí)現(xiàn)了定性到定量的飛躍，適用于復(fù)雜食物中多重過敏原的同時(shí)定量分析。在食品基質(zhì)中，過敏原作為蛋白質(zhì)會(huì)在檢測過程中更加容易降解，DNA相較于蛋白質(zhì)降解速度要慢得多，因此，這也是基因水平檢測方法的優(yōu)勢。然而實(shí)時(shí)PCR技術(shù)在檢測過程中容易造成樣品的污染以及假陽性的結(jié)果，造成檢測誤差。

2.2.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)

LAMP是近些年發(fā)展起來的一種新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)，通過設(shè)計(jì)4～6 條特異性引物，使用具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在等溫條件下每小時(shí)將目標(biāo)基因擴(kuò)增9～10 倍[62]。由于其操作簡單、檢測時(shí)間短，目前已經(jīng)應(yīng)用于食品微生物檢測、轉(zhuǎn)基因食品檢測以及過敏原成分檢測等多個(gè)方面。張懿翔等[63]設(shè)計(jì)并篩選出了LAMP特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，建立了LAMP技術(shù)對28 種牡蠣陽性樣品、陰性樣品以及相關(guān)食品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明該方法可以檢測出樣品中質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為0.1%的牡蠣成分，以及DNA質(zhì)量濃度為0.01 ng/μL的樣品，同時(shí)反應(yīng)可在25～45 min內(nèi)完成，提高了檢測效率。劉津等[64]設(shè)計(jì)并篩選了食物過敏原澳洲堅(jiān)果LAMP引物，并對反應(yīng)體系以及反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立的LAMP技術(shù)能夠特異性、靈敏、穩(wěn)定地檢測食品中澳洲堅(jiān)果成分，檢測限為0.5%。研究人員采用相同的實(shí)驗(yàn)流程建立了巴西堅(jiān)果的LAMP技術(shù)，同樣取得了可靠的檢測結(jié)果[65]。乳制品中的商業(yè)欺詐現(xiàn)象十分常見，建立可靠的檢測技術(shù)具有重要意義。Kim等[66]開發(fā)了一種可以同時(shí)檢測牛奶和山羊奶的雙重LAMP，縮短了檢測時(shí)間，檢出限可達(dá)2%。LAMP技術(shù)相比于與普通核酸擴(kuò)增技術(shù)，對實(shí)驗(yàn)器材的要求大大降低，無需類似于熱循環(huán)儀的昴貴實(shí)驗(yàn)儀器，優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)流程，縮短了檢測時(shí)間，同時(shí)檢測結(jié)果可以直接通過肉眼觀察是否生成白色渾濁或者綠色熒光來判斷，適用于食物過敏原的快速現(xiàn)場檢測。盡管在引物設(shè)計(jì)上難度較大，但LAMP技術(shù)在食品安全檢測領(lǐng)域仍具有廣闊的發(fā)展前景。

2.3 質(zhì)譜技術(shù)

近年來，隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷成熟與完善，在食品過敏原檢測中的應(yīng)用得到了越來越多的關(guān)注[67]。使用質(zhì)譜法檢測食物過敏原時(shí)多與高效分離純化技術(shù)如液相色譜、毛細(xì)管電泳等相結(jié)合，最常用的檢測方法為 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS），在選擇合適的樣品預(yù)處理方式和穩(wěn)定的特征肽段的前提下，可以提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性。Ma Χiuli等[68]為了對加工食品中的芝麻過敏原進(jìn)行全面定量，優(yōu)化了7 種芝麻過敏原蛋白的提取和胰蛋白酶消化條件，并分別對其進(jìn)行了標(biāo)記和絕對 定量（absolute quantitative，AQUA）肽的篩選。結(jié)果顯示7 個(gè)芝麻過敏原AQUA肽的檢測限和定量限的測定范圍分別為0.1～140.0 fmol/μL和0.4～400 fmol/μL，在多個(gè)實(shí)驗(yàn)中的總體變異系數(shù)小于5%，證明所建立的LC-MS/MS檢測方法在提高芝麻加工食品的安全性的潛在價(jià)值。由于LC-MS/MS法受食品基質(zhì)的影響較小，因此在復(fù)雜食品基質(zhì)中檢測食物過敏原的應(yīng)用十分廣泛，Planque等[69]基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了檢測復(fù)雜食品（巧克力、冰淇淋）和加工食品（曲奇、醬料）中10 種過敏原的方法，該檢測方法達(dá)到了多重過敏原檢測的最低定量限：牛奶蛋白0.5 mg/kg，花生、腰果、榛子和開心果蛋白2.5 mg/kg，雞蛋蛋白3.0 mg/kg，大豆蛋白5 mg/kg，核桃蛋白5 mg/kg，山核桃蛋白5 mg/kg， 適用于實(shí)驗(yàn)中4 種不同的基質(zhì)。此外該實(shí)驗(yàn)中通過標(biāo)記的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校正，將牛奶酪蛋白肽的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差從30.9%降低到10.3%。此外，液相色譜-質(zhì)譜法可以檢測痕量級別的食物過敏原，Inman等[70]建立了一種液質(zhì)色譜-質(zhì)譜方法用于檢測孜然和紅辣椒兩種香料中被杏仁和杏花過敏原污染的情況，結(jié)果表明該方法可以用于鑒別香料中百萬分之一的杏仁堅(jiān)果污染物。盡管質(zhì)譜法在應(yīng)用時(shí)需要昴貴的儀器以及專業(yè)的技術(shù)人員，但質(zhì)譜法具有快速、高特異性、高通量的優(yōu)勢，可以克服免疫學(xué)方法存在的通量低和交叉干擾的弊端，也克服了 PCR技術(shù)不能直接檢測致敏蛋白質(zhì)的缺點(diǎn)，具有較好的開發(fā)潛力[71]。

3 新型食物過敏原檢測技術(shù)

生物芯片包括基因芯片和蛋白芯片兩種，是食物過敏原檢測的一種新型、有效的檢測工具，因其高特異性、高靈敏度和高通量的特點(diǎn)成為近年來人們研究的熱點(diǎn)[72]。張軼群[73]首次對三維芯片載體的基片進(jìn)行處理，得到了具有良好固定效果的三維芯片載體，并在此基礎(chǔ)上，建立并完善了海產(chǎn)品過敏原的檢測方法，為海產(chǎn)品過敏原的控制提供了必要的技術(shù)儲(chǔ)備。目前生物芯片在食物過敏原檢測領(lǐng)域應(yīng)用并不廣泛，但由于其高效快速檢測的特點(diǎn)，具有很大的發(fā)展前景。此外，為了能夠更好地區(qū)分致敏蛋白與非致敏蛋白，提高食物過敏原檢測的高效準(zhǔn)確性，Lu Wenzhe等[16]開發(fā)了一種基于物理化學(xué)特性基序來區(qū)分過敏原和非過敏原同源物的方法，并定量估計(jì)查詢序列的潛在過敏原性。該方法可對蛋白家族中已知的致敏蛋白進(jìn)行表征，然后從8萬 個(gè)隨機(jī)選擇的非過敏原序列中分離出的過敏原序列進(jìn)行評分，證明了過敏原特異性基序的平均評分與非過敏原的平均評分存在顯著差異。這種評分方法也能將那些具有顯著總體相似性的序列辨別出來，為以后應(yīng)用蛋白質(zhì)序列檢測食品中過敏原提供了依據(jù)。

綜上所述，每種食物過敏原檢測技術(shù)都兼具優(yōu)缺點(diǎn)，沒有一種單獨(dú)的方法能夠?qū)⑺袃?yōu)點(diǎn)結(jié)合起來，對所有相關(guān)的過敏性食品成分進(jìn)行經(jīng)濟(jì)、可靠、快速和明確的識別和定量（圖1）。對于一些復(fù)雜的分析樣品，可能需要使用一種以上的技術(shù)來進(jìn)行全面的檢測。

圖1 食物過敏原檢測技術(shù)基本原理及優(yōu)缺點(diǎn)Fig.1 Basic principles as well as advantages and disadvantages of food allergen detection technologies

4 結(jié) 語

目前在世界范圍內(nèi)，過敏性疾病的發(fā)生率仍呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，明確食品中的過敏原并建立相關(guān)的檢測技術(shù)對于預(yù)防食物過敏的發(fā)生至關(guān)重要。在目前的食物過敏原檢測技術(shù)中，基于蛋白水平的ELISA檢測技術(shù)和基于核酸水平的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用最為廣泛，已經(jīng)逐漸商業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化。蛋白質(zhì)容易在加工過程中發(fā)生變性、聚集等現(xiàn)象，導(dǎo)致其線性表位以及構(gòu)象表位發(fā)生改變，給過敏原的檢測帶來困難，因此更容易造成檢測誤差，出現(xiàn)假陽性以及假陰性結(jié)果。相比之下，核酸檢測更不易于受到外界條件影響，但由于是間接性檢測，無法檢測到蛋白質(zhì)譜引起的過敏反應(yīng)。而質(zhì)譜法既可以改善免疫學(xué)方法中存在的檢測通量低和交叉干擾的影響，同時(shí)避免了核酸檢測技術(shù)不能直接檢測致敏蛋白的缺點(diǎn)，能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)和多肽進(jìn)行明確鑒定，并且可以同時(shí)檢測多種過敏原。但昴貴的儀器成本以及對檢測人員的高素質(zhì)要求在一定程度上限制了其進(jìn)一步的發(fā)展。為了減少過敏性疾病的發(fā)生，未來的主要發(fā)展方向有兩點(diǎn)：一方面，開發(fā)有效的過敏原減除技術(shù)，如通過熱加工、高壓及微生物發(fā)酵降解等方式降解過敏原蛋白從而降低致敏性；另一方面，開發(fā)便捷、快速、高效的過敏原檢測技術(shù)，以幫助消費(fèi)者更好地避免攝入過敏原。