黑苦蕎中總黃酮2種提取方法的工藝優(yōu)化

賀平 王午豪 尚麗君 孫紅梅 魏亮亮 劉冰杰 周曉華 魏紅 王鐵良 郭潔

摘要 [目的]提高苦蕎黃酮類化合物的綜合利用率，優(yōu)化提取工藝。[方法]以乙醇為提取液，通過(guò)超聲波和恒溫水浴振蕩2種方法進(jìn)行提取，分別通過(guò)提取的時(shí)間、溫度、乙醇濃度、固液比、超聲功率進(jìn)行單因素試驗(yàn)，再在單因素的基礎(chǔ)上通過(guò)正交試驗(yàn)確定最佳提取條件和方法。[結(jié)果]超聲法的最佳優(yōu)化方案：超聲功率250 W，固液比1∶50，乙醇濃度70%，超聲時(shí)間40 min;恒溫水浴振蕩法最佳方案：恒溫45 ℃，水浴振蕩時(shí)間2.0 h，乙醇濃度80%，固液比1∶30。[結(jié)論]經(jīng)驗(yàn)證，優(yōu)化方案科學(xué)合理，可作為黑苦蕎中黃酮類化合物開(kāi)發(fā)和研究的依據(jù)。

關(guān)鍵詞 黑苦蕎;黃酮類化合物;提取工藝

中圖分類號(hào) TQ 914.1? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）16-0178-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.16.048?? 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Process Optimization of Two Extraction Methods of Total Flavonoids from Black Bitter Buckwheat

HE Ping1，2，3，WANG Wu-hao1，3， SHANG Li-jun1 et al （1.Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology， Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou，Henan 450002;2.Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Agro-products （Zhengzhou）， Ministry of Agriculture，Zhengzhou，Henan 450002;3.Henan Key Laboratory of Grain Quality and Safety and Testing， Zhengzhou，Henan 450002）

Abstract [Objective]To improve the comprehensive utilization rate of total flavonoids from black buckwheat and optimize the extraction process. [Method]Using ethanol as the extract， and total flavonoids were extracted by ultrasonic wave and constant temperature water bath. The single factor experiment is carried out by extraction time， temperature， ethanol concentration， solid-liquid ratio and ultrasonic power.Based on the orthogonal test， the optimal extraction conditions and methods are determined.[Result]The best optimization scheme for ultrasonic method： ultrasonic power 250 W， solid-liquid ratio 1∶50， ethanol concentration 70%， ultrasonic time 40 min.The best solution for constant temperature water bath oscillation method： constant temperature 45 ℃， water bath oscillation time 2.0 h， ethanol concentration 80%， solid-liquid ratio 1∶30. [Conclusion]The optimized scheme has been verified to be scientific and reasonable， and can be used as the basis for the development and research of flavonoids in black tartary buckwheat.

Key words Black buckwheat;Total flavonoids;Extraction process

苦蕎麥，蓼目蓼科植物，又叫菠蕎麥、烏蕎麥、花蕎麥等，一年生植物。生長(zhǎng)在田野邊、道路旁、山坡上、河谷中等潮濕的地方，主產(chǎn)川渝地區(qū)，在我國(guó)山東、河南、陜西等地也有分布。苦蕎麥性味稍微帶苦、屬寒，有益氣長(zhǎng)力、續(xù)精增神、降氣寬腸健脾胃的作用。苦蕎的不同部位含有不同活性成分，其成分中黃酮類物質(zhì)含量最高。因此，食用黑苦蕎可以補(bǔ)充其他主食谷物中含量較少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如面粉、玉米以獲得營(yíng)養(yǎng)的均衡。對(duì)于苦蕎中生物活性物質(zhì)的研究，主要集中于苦蕎提取產(chǎn)物。苦蕎中含量較高的生物活性物質(zhì)是多酚中的黃酮類物質(zhì)[1-3]。其中蘆丁含量最高，占總黃酮的70%～90%[4]。

目前，提取原料中總黃酮方法有溶劑提取法、超聲波提取法、微波萃取提取法、索氏提取法、酶解-溶劑法、超高壓提取法等方法。Oliveira等[5]在用超聲輔助提取法提取黃果西番蓮種籽油粕時(shí)，發(fā)現(xiàn)提取物中含有黃酮，且有較強(qiáng)的抗氧化作用和抑菌活性。王楠等[6]在研究沙棗總黃酮的提取工藝時(shí)，使用溶劑提取、超聲波提取和微波萃取提取3種方法，用單因素試驗(yàn)確定了總黃酮提取的最佳條件，然后采用響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行分析，得出超聲波提取率最高，溶劑提取率最差，微波萃取提取節(jié)省時(shí)間，而張艷等[7]用上述3種方法提取紫蘇油粕總黃酮時(shí)，得出總黃酮提取效果表現(xiàn)為微波萃取>超聲法>乙醇法。微波和超聲2種方法在具體操作時(shí)，受儀器參數(shù)和使用條件的影響而結(jié)果差異較大。王琳琳等[8]在提取枸杞總黃酮時(shí)，采用乙醇回流法、超聲波提取法、超聲波-微波聯(lián)用提取法3種方法，得出超聲波-微波聯(lián)用提取法提取效率最高。Alara等[9]用微波萃取提取斑鳩菊葉中黃酮類物質(zhì)。

經(jīng)查閱大量資料，傳統(tǒng)溶劑提取法、超聲提取法和微波萃取提取法是3種常用方法也有一些區(qū)別，微波萃取提取法主要用于一些種皮和葉[10]中總黃酮提取，具有用時(shí)短、效率高等優(yōu)點(diǎn)，但是受到儀器參數(shù)和型號(hào)的限制，提取溶劑是不同濃度乙醇，有一定的爆罐風(fēng)險(xiǎn)，并不實(shí)用;傳統(tǒng)溶劑提取法是普遍的方法，具有提取時(shí)間較長(zhǎng)、浪費(fèi)人力、提取不完全等缺點(diǎn)。超聲和恒溫水浴振蕩法使用普遍，操作簡(jiǎn)單，提取效果理想，但是溫度、提取時(shí)間等因素影響提取率，相關(guān)研究較少。該研究通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲法[11]和恒溫水浴振蕩法提取黑苦蕎中總黃酮的最優(yōu)條件。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 試驗(yàn)儀器和試驗(yàn)試劑分別見(jiàn)表1、2。

1.2 溶液的配制

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。用電子天平準(zhǔn)確稱取0.277 6 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，加入無(wú)水乙醇溶解，定容于250 mL容量瓶中，配成濃度為1.000 mg/mL儲(chǔ)備液，然后吸取25 mL溶液于250 mL容量瓶中，配成0.1 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，振蕩搖勻，于4 ℃冷藏備用。

1.2.2 乙酸鉀溶液的配制。用電子天平稱取49.073 0 g乙酸鉀，加去離子水溶解，定容于500 mL容量瓶中，制成98 g/L溶液，振蕩搖勻。

1.2.3 硝酸鋁溶液的配制。稱取Al（NO 3） 3·9H 2O固體176.0 g，加入去離子水溶解，定容于1 000 mL容量瓶中，制成100 mg/L溶液，振蕩搖勻。

1.2.4 30%乙醇溶液的配制。用量筒量取300 mL無(wú)水乙醇，加入700 mL去離子水制成30%乙醇溶液，置于試劑瓶中備用。50%、60%、70%、80%乙醇溶液、無(wú)水乙醇溶液同法配制，備用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的前處理和保存。

1.3.1.1 樣品的前處理。將黑苦蕎置于45 ℃烘箱中干燥12 h，拿出后冷卻至室溫，再用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)70目篩。

1.3.1.2 樣品的保存。過(guò)篩樣品干燥粉末裝入密封罐，放在干燥器中備用。

1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

移液管精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1 mg/mL） 0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 mL于50 mL容量瓶中，配成濃度分別為1、2、5、10、15、20 mg/L;加無(wú)水乙醇至總體積為15 mL，先加硝酸鋁溶液1 mL，再加醋酸鉀溶液1 mL，振蕩搖勻后加水至刻度線，搖勻，放置1 h，用紫外分光光度計(jì)于420 nm處，以30%乙醇溶液作為空白，測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[12-13]。

1.3.3 空白試驗(yàn)。不加試樣，其他均按上述步驟操作。

1.3.4 吸光度和總黃酮含量測(cè)定。

移液管吸取待測(cè)溶液2 mL移入50 mL容量瓶中，按“1.3.2”操作。以試劑空白為參照，用紫外分光光度計(jì)在420 nm處測(cè)定樣品溶液的吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品溶液中黃酮類化合物的濃度（mg/L）。吸光度應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。

1.3.5 樣品總黃酮提取率的計(jì)算。

X=C×V 1×V 22×m×1 000×100%

式中，X為樣品中總黃酮的提取率，%;C為根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算出的 濃度，mg/L; V 1為樣 品稀釋定容時(shí)的體積， mL;

V 2為 加顯色劑后定容的體積， mL; m 為稱取的樣品重量，g。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 超聲法提取單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.4.1.1 超聲功率。稱取1.00 g樣品于錐形瓶中，加入30 mL無(wú)水乙醇，蓋上塞子，分別在125、250、375、500 W功率進(jìn)行超聲提取40 min，每處理3次重復(fù)，過(guò)濾，用無(wú)水乙醇定容至50 mL容量瓶中待測(cè)。

1.4.1.2 超聲時(shí)間。用電子天平各稱取1.00 g樣品加入錐形瓶中，再加入30 mL無(wú)水乙醇，蓋上塞子，分別用超聲125 W功率提取20、40、60、80、100 min，過(guò)濾后用無(wú)水乙醇定容于50 mL 容量瓶，待測(cè)。每處理3次重復(fù)。

1.4.1.3 乙醇濃度。用電子天平各稱取1.00 g樣品加入錐形瓶中，分別加入50%、60%、70%、80%、100%乙醇提取液，蓋上塞子，用超聲125 W 功率提取40 min，過(guò)濾后用各濃度乙醇定容于50 mL容量瓶，待測(cè)。每處理3次重復(fù)。

1.4.1.4 固液比。用電子天平各稱取1.00 g樣品加入錐形瓶中，再加入10、20、30、40、50 mL無(wú)水乙醇，蓋上塞子，分別用超聲125 W提取40 min，過(guò)濾后用無(wú)水乙醇定容于50 mL容量瓶，待測(cè)。每處理3次重復(fù)。

1.4.2 恒溫水浴振蕩法單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.4.2.1 水浴振蕩時(shí)間。用電子天平各稱取1.00 g樣品加入錐形瓶中，再加入30 mL無(wú)水乙醇，蓋上塞子，分別于25 ℃水浴振蕩提取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h，過(guò)濾后用無(wú)水乙醇定容于50 mL容量瓶，待測(cè)。每處理3次重復(fù)。

1.4.2.2 水浴振蕩溫度。用電子天平各稱取1.00 g樣品加入錐形瓶中，再加入30 mL無(wú)水乙醇，蓋上塞子，分別于25、35、45、55、65 ℃水浴振蕩提取1 h，過(guò)濾后用無(wú)水乙醇定容于50 mL容量瓶，待測(cè)。每處理3次重復(fù)。

1.4.2.3 乙醇濃度。用電子天平各稱取1.00 g樣品加入錐形瓶中，分別加入50%、60%、70%、80%、100%乙醇，蓋上塞子，于25 ℃振蕩提取1 h，過(guò)濾后用各濃度乙醇定容于50 mL容量瓶，待測(cè)。每處理3次重復(fù)。

1.4.2.4 固液比。用電子天平各稱取1.00 g樣品加入錐形瓶中，再分別加入10、20、30、40、50 mL無(wú)水乙醇，蓋上塞子，于25 ℃振蕩提取1 h，過(guò)濾后用無(wú)水乙醇定容于50 mL容量瓶，待測(cè)。每處理3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 按照“1.3.2”的方法，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制出蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。結(jié)果表明，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液在該范圍內(nèi)線性良好，符合比爾定律。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 超聲法提取黑苦蕎總黃酮單因素試驗(yàn)結(jié)果。

2.2.1.1 超聲功率對(duì)黑苦蕎總黃酮提取率的影響。

從圖2可以看出，250 W時(shí)的總黃酮提取率遠(yuǎn)大于125 W的，當(dāng)繼續(xù)提高超聲功率，總黃酮提取率反而降低，且375～500 W總黃酮提取率變化不明顯，功率為250 W時(shí)總黃酮提取率最大。

2.2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)黑苦蕎總黃酮提取率的影響。從圖3可以看出，隨著超聲提取時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮提取率也逐漸升高，當(dāng)超聲時(shí)間大于60 min總黃酮提取率變化不明顯，因此最佳時(shí)間條件是超聲60 min。

2.2.1.3 固液比對(duì)黑苦蕎總黃酮提取率的影響。從圖4可看出，隨著固液比的增大，總黃酮提取率也隨之增大，當(dāng)固液比大于1∶40（g∶mL）時(shí)，總黃酮提取率反而下降，因此固液比1∶40是最佳條件。

2.2.1.4 乙醇濃度對(duì)黑苦蕎總黃酮提取率的影響。從圖5可以看出，當(dāng)乙醇濃度為60%，總黃酮提取率達(dá)到最高，乙醇濃度超過(guò)60%對(duì)總黃酮提取率的影響卻變小。因此，60%乙醇為最佳提取條件。

2.2.2 恒溫水浴振蕩法提取黑苦蕎總黃酮單因素試驗(yàn)結(jié)果。

2.2.2.1 水浴振蕩時(shí)間對(duì)黑苦蕎總黃酮提取率的影響。

從圖6可以看出，隨著水浴振蕩時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮提取率逐漸增大，當(dāng)時(shí)間大于3.0 h，總黃酮提取率反而下降。因此，可以得出最佳時(shí)間條件是3.0 h。

2.2.2.2 水浴振蕩溫度對(duì)黑苦蕎總黃酮提取率的影響。從圖7可以看出，隨著水浴溫度的升高，總黃酮提取率逐漸增大，當(dāng)溫度達(dá)到55 ℃時(shí)，總黃酮的提取率最高，隨著水浴溫度的繼續(xù)升高，總黃酮提取率反而降低。因此，最佳提取溫度為55 ℃。

2.2.2.3 固液比對(duì)黑苦蕎總黃酮提取率的影響。從圖8可以看出，固液比1∶40時(shí)總黃酮提取率最大，隨后開(kāi)始降低，因此最佳固液比是1∶40。

2.2.2.4 乙醇濃度對(duì)黑苦蕎總黃酮提取率的影響。

從圖9可以看出，當(dāng)乙醇濃度逐漸升高，總黃酮提取率也隨之提高，當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，總黃酮提取率達(dá)最高，繼續(xù)增大乙醇濃度，對(duì)總黃酮提取率影響減小，考慮到研究和生產(chǎn)中的資源合理利用，確定60%乙醇為最佳濃度條件。

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.3.1 恒溫水浴振蕩法。

在恒溫水浴振蕩單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行固液比、乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間4因素4水平L 16（44）正交試驗(yàn)。因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表3。

2.3.2 超聲法。 在超聲法單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行固液比、乙醇濃度、提取時(shí)間、超聲功率4因素3水平L 9（34）正交試驗(yàn)。因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表4。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 超聲法。由表5可知，超聲法各因素對(duì)總黃酮提取率的影響表現(xiàn)為乙醇濃度（D）>固液比（B）>提取時(shí)間（C）>超聲功率（A），優(yōu)化方案結(jié)果是A 2B 3C 1D 3，即超聲功率250 W，固液比1∶50，超聲時(shí)間40 min，乙醇濃度70%。

2.4.2 水浴振蕩法。由表6可知，各因素對(duì)總黃酮提取率影響表現(xiàn)為乙醇濃度（C）>固液比（D）>提取時(shí)間（B）>提取溫度（A），正交試驗(yàn)優(yōu)化方案結(jié)果為A 3B 3C 4D 3，即水浴振蕩溫度45 ℃，水浴振蕩時(shí)間2.0 h，乙醇濃度80%，固液比1∶30。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)和穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.5.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)。

超聲法和恒溫水浴振蕩法各隨機(jī)挑選1組試驗(yàn)，即超聲最大功率500 W，100%乙醇，超聲60 min，固液比為1∶30;水浴振蕩溫度55 ℃，時(shí)間2.0 h，100%乙醇，固液比1∶30。2組同時(shí)進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)：取試驗(yàn)組樣品溶液每1.0 h進(jìn)行1次吸光度的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表7，樣品溶液在3.0 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.2 驗(yàn)證試驗(yàn)。將2種方法通過(guò)正交分析得出的最佳優(yōu)化條件進(jìn)行3次重復(fù)性驗(yàn)證試驗(yàn)。按照超聲法最佳方案：超聲功率250 W，固液比1∶50，70%乙醇，超聲時(shí)間40 min，總黃酮平均提取率4.36%，高于正交試驗(yàn)中最大提取率4.28%，因此工藝優(yōu)化條件合理，符合預(yù)期結(jié)果。恒溫水浴振蕩法最佳方案：恒溫溫度45 ℃，水浴振蕩時(shí)間2.0 h，80%乙醇，1∶30固液比，總黃酮平均提取率4.16%，高于正交試驗(yàn)中最高提取率（4.12%）。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)采用超聲法和恒溫水浴振蕩法，以乙醇為溶劑提取黑苦蕎中總黃酮，每種方法分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，再在單因素的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，通過(guò)正交分析得到各因素的影響主次順序，其中超聲法影響因素表現(xiàn)為乙醇濃度>固液比>提取時(shí)間>超聲功率;恒溫水浴振蕩法為乙醇濃度>

固液比>提取時(shí)間>提取溫度。通過(guò)正交試驗(yàn)得到最佳優(yōu)化方案，其中超聲法最佳方案：超聲功率250 W，固液比1∶50，乙醇濃度70%，超聲時(shí)間40 min;恒溫水浴振蕩法最佳方案：恒溫45 ℃，水浴振蕩時(shí)間2.0 h，乙醇濃度80%，固液比1∶30。由此可以看出，2種方法最佳優(yōu)化方案得到的總黃酮提取率差別微小，可以忽略，但是超聲法提取時(shí)間要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于恒溫水浴振蕩法。

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