紋帶棒狀桿菌耐藥特征研究

魏孔嬌，王嘉正，邱小彤，徐帥，朱雄，李歡，王曉霞，王成玲，范仕弘，韓李超，劉志國(guó), 李振軍,

1. 西藏大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西藏自治區(qū) 拉薩 850000； 2. 山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院(山東省千佛山醫(yī)院)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，山東省醫(yī)藥衛(wèi)生臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250000； 3. 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206； 4. 海南省三亞市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，中心實(shí)驗(yàn)室，海南 三亞 572000

棒狀桿菌屬(Corynebacterium)是一類(lèi)無(wú)芽孢，大多數(shù)菌株為無(wú)動(dòng)力的革蘭染色陽(yáng)性桿菌，主要寄生在人的鼻腔、咽喉、眼結(jié)膜、外陰、皮膚等部位。一般無(wú)致病性，通常被認(rèn)為是皮膚和黏膜的正常菌群[1-2]。然而，近年來(lái)已有大量研究表明棒狀桿菌存在潛在致病力，特別是紋帶棒狀桿菌(Corynebacteriumstriatum,Cs)，為多種院內(nèi)感染的病原體，如敗血癥[1]、呼吸道感染[2-3]等。紋帶棒狀桿菌作為條件致病菌，它的多重耐藥性特征使其成為一種院內(nèi)感染病原體，且在免疫力低下人群中的感染率日趨增高[2-6]。為了解我國(guó)紋帶棒狀桿菌的藥物敏感性特征，本研究對(duì)2017年3月—2020年6月山東省某三甲醫(yī)院臨床分離的83株紋帶棒狀桿菌進(jìn)行抗菌藥物敏感性檢測(cè)，并探討其耐藥機(jī)制，期望為該菌的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與試劑主要儀器：生化培養(yǎng)箱(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)、B2生物安全柜(北京東聯(lián)公司)、恒溫金屬浴(北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器股份有限公司)、基因擴(kuò)增熱循環(huán)儀(西安天隆科技有限公司)、電泳儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)，超微量分光光度計(jì)(德國(guó)Lmplen公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(西安天隆科技有限公司)。主要試劑：哥倫比亞血平板(英國(guó)OXOID公司)，核酸染料Gold View(北京索萊寶科技有限公司)，細(xì)菌基因組DNA、RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]，TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ (日本TAKARA公司)，四環(huán)素鹽酸鹽、紅霉素鹽酸鹽(上海YEASEN公司)，所有試劑均按說(shuō)明書(shū)指定條件保藏并在有效期內(nèi)使用。藥敏板購(gòu)自上海星佰生物技術(shù)有限公司，均在有效期內(nèi)使用并按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)保存。耐藥基因檢測(cè)引物設(shè)計(jì)如表1所示，由北京天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司合成。

1.1.2 菌株本研究收集的83株實(shí)驗(yàn)菌株來(lái)源于山東某三甲醫(yī)院2017年3月—2020年6月分離的紋帶棒狀桿菌(已剔除重復(fù)菌株)。在哥倫比亞血瓊脂平板上35 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，并用16SrDNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，用blast進(jìn)行序列比對(duì)。細(xì)菌基因組DNA提取嚴(yán)格按照TIANGEN生物公司試劑盒說(shuō)明的方法進(jìn)行，并采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，制備好的DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 實(shí)驗(yàn)用引物設(shè)計(jì)

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感性檢測(cè)根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)推薦的抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)[10]，采用微量肉湯稀釋法檢測(cè)83株紋帶棒狀桿菌對(duì)12種常用藥物的敏感性，按照CLSI的標(biāo)準(zhǔn)，判定菌株對(duì)每種藥物的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)范圍，確定MIC50、MIC90值。肺炎鏈球菌ATCC49619和大腸埃希菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株，標(biāo)準(zhǔn)菌株由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心提供。以2016年M45-ED3(CLSI)文件[10]作為折點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn)，確定12種抗生素的MIC值。所有實(shí)驗(yàn)操作均在P2級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2.2 耐藥基因檢測(cè)采用PCR對(duì)四環(huán)素抗性核糖體保護(hù)蛋白基因(tetW)、核糖體甲基化酶基因(ermX)、喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因(gyrA)、3種氨基糖苷類(lèi)修飾酶基因[aph(3”)-Ⅰb、aph(6)-Ⅰd、aac(6’)-Ⅰb]進(jìn)行檢測(cè)。PCR總反應(yīng)體系25 μL：2ΧPCR Master 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL，DNA模板1 μL。PCR反應(yīng)中使用到的引物信息如表1所示。5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下觀察結(jié)果。陽(yáng)性產(chǎn)物送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用blast進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.3 基因表達(dá)差異分析檢測(cè)采用微量肉湯稀釋法檢測(cè)3株紋帶棒狀桿菌的最低抑菌濃度(見(jiàn)表6)，在不同濃度的紅霉素、環(huán)丙沙星作用下，對(duì)ermX和tetW基因的表達(dá)進(jìn)行干預(yù)。在哥倫比亞血平板上接種紋帶棒狀桿菌，35 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后取單菌落置于液體腦心浸液肉湯BHI培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。將菌液以1∶100轉(zhuǎn)接于20 mL液體BHI，每種藥物接種3管，其中1管不加藥物作為對(duì)照，其余2管分別加入該菌株的50% MIC、25%MIC濃度的該藥物，37 ℃，180 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。5000 r/min離心10 min，棄上清，之后用去離子水洗3次。按照細(xì)菌總RNA 提取試劑盒說(shuō)明方法提取細(xì)菌的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明方法將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后按照熒光定量試劑盒說(shuō)明推薦方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：2ΧSYBR Green 10 μL；上、下游引物各0.4 μL；Rox Reference Dye II 0.4 μL；滅菌蒸餾水6.8 μL；模板2 μL。擴(kuò)增條件具體如下。擴(kuò)增曲線(xiàn)：95 ℃預(yù)變性20 s，95 ℃變性10 s，54 ℃退火34 s。溶解曲線(xiàn)：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。采用公式2-ΔΔCt計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量差異倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 菌株基本情況

經(jīng)16S rDNA擴(kuò)增及序列分析顯示，實(shí)驗(yàn)菌株均為紋帶棒狀桿菌。83株紋帶棒狀桿菌樣本來(lái)源及分布病區(qū)如表2、表3所示。

2.2 藥敏實(shí)驗(yàn)

83株紋帶棒狀桿菌對(duì)12種抗生素的敏感性結(jié)果如表4所示。紋帶棒狀桿菌對(duì)萬(wàn)古霉素、利奈唑胺100%敏感，對(duì)紅霉素(MIC50>16 μg/mL、MIC90>16 μg/mL)、環(huán)丙沙星(MIC50>32 μg/mL、MIC90>32 μg/mL)、克林霉素(MIC50>16 μg/mL、MIC90>16 μg/mL)均表現(xiàn)出完全耐藥，對(duì)青霉素、頭孢噻肟、美羅培南的耐藥率分別為97.6%、95.2%、92.8%，對(duì)四環(huán)素的耐藥率為86.7%，對(duì)慶大霉素的耐藥率為38.6%，對(duì)多西環(huán)素和利福平的耐藥率最低，分別為13.3%和6.0%。

表2 83株紋帶棒狀桿菌樣本來(lái)源

表3 83株紋帶棒狀桿菌病區(qū)分布

2.3 耐藥基因檢測(cè)

83株菌均檢測(cè)到喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因(gyrA)；ermX基因的檢出率為100%；在四環(huán)素耐藥菌株中，tetW基因的檢出率為88%；在慶大霉素耐藥的菌株中，aph(3”)-Ⅰb基因的檢出率為36.1%、aph(6)-Ⅰd基因的檢出率為37.3%、aac(6’)-Ⅰb基因的檢出率為15.7%。具體結(jié)果如表5所示。

2.4 耐藥基因的相對(duì)表達(dá)量分析

熒光定量PCR結(jié)果表明，在不同濃度的紅霉素、四環(huán)素的作用下，ermX和tetW基因的相對(duì)表達(dá)量差異倍數(shù)結(jié)果如表6所示。ermX和tetW基因的相對(duì)表達(dá)量均有所變化，但變化不明顯。部分?jǐn)U增產(chǎn)物溶解曲線(xiàn)如圖1所示，候選基因的溶解曲線(xiàn)均為單峰，說(shuō)明所設(shè)計(jì)的引物特異性良好。

表4 83株紋帶棒狀桿菌藥敏判定結(jié)果

表5 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果(n=83)

表6 不同藥物濃度下ermX和tetW基因相對(duì)表達(dá)量差異倍數(shù)

A: secA; B: ermX; C: tetW.

3 討論

本研究從醫(yī)院臨床標(biāo)本中獲得了83株紋帶棒狀桿菌(Cs)，其中ICU病區(qū)的最多，占比48%(40株)；從痰液標(biāo)本中獲得了44株(53%)。Verroken 等[3]在進(jìn)行流行病學(xué)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在醫(yī)院發(fā)現(xiàn)1株新的紋帶棒狀桿菌時(shí)，至少會(huì)有1名患者被收入ICU病區(qū)或是呼吸道感染科室，而本研究中ICU病區(qū)有27例的臨床診斷是呼吸道感染，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道類(lèi)似。本研究的菌株是否來(lái)自同一克隆群，進(jìn)一步的分子流行病學(xué)分析將提供重要的線(xiàn)索。

藥物敏感性分析表明，83株紋帶棒狀桿菌均為多重耐藥菌株，而來(lái)自北京、廣東、河北唐山地區(qū)醫(yī)院的分離菌株的多重耐藥率分別為88.8%、100%、97.3%[8]。此外，重慶地區(qū)醫(yī)院分離菌株同樣表現(xiàn)出100%多重耐藥率[11]。本研究中的菌株對(duì)紅霉素、環(huán)丙沙星、克林霉素表現(xiàn)出完全耐藥，對(duì)萬(wàn)古霉素、利奈唑胺表現(xiàn)出完全敏感，這與在河南地區(qū)某醫(yī)院分離的紋帶棒狀桿菌有相似的耐藥譜[12]，同樣的情況也出現(xiàn)在內(nèi)蒙古地區(qū)[13]。這和國(guó)外的情況亦類(lèi)似[1, 3, 14-17]，例如：2010—2014年從日本醫(yī)院分離的24株紋帶棒狀桿菌對(duì)萬(wàn)古霉素(MIC50為0.5 μg/mL、MIC90為 0.5 μg/mL)完全敏感，對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物(MIC50>16 μg/mL、MIC90>16 μg/mL)完全耐藥，對(duì)克林霉素(MIC50>8 μg/mL、MIC90>8 μg/mL)也表現(xiàn)出完全耐藥[1]；2011年1月—8月在美國(guó)倫敦醫(yī)院分離的24株紋帶棒狀桿菌也表現(xiàn)出了相似的耐藥譜，對(duì)紅霉素、克林霉素耐藥，對(duì)萬(wàn)古霉素敏感[3]。

通常，雙歧桿菌和棒狀桿菌對(duì)紅霉素類(lèi)耐藥是由菌株的染色體攜帶ermX基因所致[18]。本研究中對(duì)紅霉素和克林霉素耐藥的菌株均檢測(cè)到ermX基因，提示紋帶棒狀桿菌攜帶的核糖體甲基化酶基因使紅霉素作用靶點(diǎn)的核糖體蛋白甲基化，從而降低藥物作用，這是紋帶棒狀桿菌對(duì)紅霉素耐藥的潛在機(jī)制。50%MIC、25%MIC紅霉素作用濃度對(duì)ermX基因的表達(dá)無(wú)顯著影響，提示耐藥菌株對(duì)紅霉素的耐藥方式屬于內(nèi)在型耐藥[19-20]，無(wú)論誘導(dǎo)劑存在與否，核糖體甲基化酶基因(ermX)都可持續(xù)而穩(wěn)定的表達(dá)。

楊雪靜等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，紋帶棒狀桿菌對(duì)四環(huán)素的耐藥性主要與tet基因簇有關(guān)。本研究中除1株對(duì)四環(huán)素耐藥的菌株未檢測(cè)到tetW基因，其余耐藥菌株均擴(kuò)增到了tetW基因。測(cè)序結(jié)果與耐藥質(zhì)粒Pja144188的tetW基因相似度為99%。研究發(fā)現(xiàn)，在50%MIC、25%MIC四環(huán)素濃度作用下，tetW基因的表達(dá)無(wú)顯著變化，推測(cè)tetW基因編碼核糖體保護(hù)蛋白繼而對(duì)四環(huán)素等產(chǎn)生耐藥性是一個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的過(guò)程，并不會(huì)因?yàn)樗幬锸欠翊嬖诙淖兤浔磉_(dá)。

本研究對(duì)山東地區(qū)分離的83株紋帶棒狀桿菌進(jìn)行了藥物敏感性、耐藥機(jī)制檢測(cè)。結(jié)果顯示，該地區(qū)的紋帶棒狀桿菌有較廣的耐藥譜和耐藥基因攜帶率。這將為后續(xù)的紋帶棒狀桿菌耐藥流行病學(xué)研究及院內(nèi)感染防控提供參考，而對(duì)于紋帶棒狀桿菌的耐藥機(jī)制還須進(jìn)一步研究。