噬菌體療法在疾病中的應(yīng)用進(jìn)展

符小妹，王悅，陳倩，郭曉奎，劉暢

1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與微生物學(xué)系，上海 200025； 2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院-國家熱帶病研究中心全球健康學(xué)院，上海 200025

噬菌體作為能特異性感染細(xì)菌、真菌及放線菌的微生物，在環(huán)境中廣泛存在。其經(jīng)典應(yīng)用主要體現(xiàn)在對耐藥菌的治療，已有多個臨床成功案例，成為抗生素替代療法中可操作性最強的方法之一。此外，隨著對人體微生物群與宿主健康之間關(guān)系的研究不斷深入，調(diào)控微生物群以達(dá)到預(yù)防或治療疾病目的的方法引起了廣泛關(guān)注。噬菌體具有宿主特異性，能通過與宿主菌間的相互作用裂解宿主菌，因此利用噬菌體靶向降低與疾病發(fā)展正相關(guān)的特征性細(xì)菌的豐度被視為一種精準(zhǔn)靶向調(diào)控微生物群的可行策略，該策略在腫瘤、糖尿病和酒精性肝病等非感染性疾病中應(yīng)用的臨床前研究成果不斷出現(xiàn)。

1 噬菌體的分類和作用特點

噬菌體是在環(huán)境中廣泛存在的可感染原核細(xì)胞型微生物及真菌的病毒，對可感染的宿主菌具有特異性。噬菌體在人體腸道中的豐度達(dá)108～109/g糞便，是人體病毒組的主要構(gòu)成部分[1]。根據(jù)形態(tài)結(jié)構(gòu)特點，噬菌體可分為有尾噬菌體、無尾噬菌體及絲狀噬菌體。國際病毒分類委員會(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)對噬菌體進(jìn)行了系統(tǒng)的劃分，將噬菌體中數(shù)目最多的以雙鏈DNA(double-stranded DNA，dsDNA)為基因組的有尾噬菌體歸為有尾噬菌體目，并進(jìn)一步分為4個科：阿克曼噬菌體、肌尾噬菌體、長尾噬菌體和短尾噬菌體(https://talk.ictvonline.org/)。根據(jù)噬菌體感染宿主細(xì)胞后的生命周期，可分為烈性噬菌體和溶原性噬菌體[2]。烈性噬菌體在入侵宿主細(xì)胞后利用宿主的代謝機制進(jìn)行核酸復(fù)制及蛋白質(zhì)合成，組裝成子代病毒顆粒后通過裂解宿主細(xì)胞而釋放。溶原性噬菌體的遺傳物質(zhì)注入宿主體內(nèi)后，可將自身基因組整合到宿主基因組中，形成前噬菌體。當(dāng)外界環(huán)境發(fā)生變化如DNA損傷，這些噬菌體可自發(fā)地從宿主基因組中脫離，進(jìn)入裂解期。但最新的觀點認(rèn)為，除這兩種經(jīng)典的噬菌體復(fù)制周期外，還存在第三種慢性感染周期。例如，絲狀噬菌體感染宿主菌后可在宿主菌中長期慢性感染，合成子代噬菌體，通過專用分泌器釋放出宿主菌，并不裂解細(xì)菌[3]。

烈性噬菌體在復(fù)制后期還可表達(dá)穿孔素和溶菌酶，通過穿孔素-溶菌酶相互作用特異性裂解細(xì)菌。穿孔素為一種疏水性蛋白，裂解過程開始后穿孔素在胞質(zhì)膜上打孔，使裂解酶接觸細(xì)菌細(xì)胞壁并水解肽聚糖骨架的共價鍵，破壞細(xì)胞壁，從而達(dá)到裂解宿主菌的目的[4]。

與抗生素不同，噬菌體的殺菌作用具有菌株特異性，對非宿主菌和真核細(xì)胞沒有直接影響, 安全性強且精準(zhǔn)性高。細(xì)菌會對噬菌體產(chǎn)生耐受性，如通過成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)/ CRISPR相關(guān)蛋白(CRISPR-associated protein，Cas)系統(tǒng)抵抗噬菌體的入侵[5]；而噬菌體也進(jìn)化出相應(yīng)的機制如表達(dá)anti-CRISPR蛋白來對抗細(xì)菌的耐受性[6]。此外，細(xì)菌感染過程中能形成生物膜，這種由多糖、蛋白質(zhì)和脂類組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使得抗生素難以滲透并發(fā)揮作用；而噬菌體可合成多種細(xì)菌胞外聚合物水解酶，對生物膜進(jìn)行降解[7]。越來越多的證據(jù)表明，噬菌體還可通過影響人體共生細(xì)菌群的結(jié)構(gòu)和功能來影響宿主健康[8-10]。

2 噬菌體療法在感染性疾病中的應(yīng)用

噬菌體最早被用于治療傷寒、痢疾、皮膚感染和外科傷口感染等感染性疾病[11]。早期噬菌體療法存在一定局限性，如缺乏科學(xué)的方法設(shè)計、質(zhì)量控制、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)等。更重要的是，抗生素被發(fā)現(xiàn)后，其顯著的治療優(yōu)勢使得噬菌體療法相關(guān)研究大量減少，僅局限于東歐少數(shù)國家[11]。目前，由于耐藥菌在世界范圍內(nèi)不斷播散以及新抗生素研發(fā)周期變長，噬菌體療法再次得到重視。噬菌體療法主要分為單一噬菌體療法或多種噬菌體混合的雞尾酒療法，后者可有效減緩治療過程中耐受菌產(chǎn)生的速度[12]。噬菌體療法給藥方式包括局部、口服及靜脈注射。其臨床創(chuàng)新用法也在不斷開發(fā)中，包括噬菌體-抗生素組合、噬菌體衍生酶、噬菌體生物工程等[13-14]。Ott等對5例有癥狀的慢性復(fù)發(fā)艱難梭菌感染(Clostridioidesdifficileinfection，CDI)患者進(jìn)行無菌糞便濾液 (fecal filtrate transfer，F(xiàn)FT)治療，結(jié)果顯示所有患者至少在6個月內(nèi)恢復(fù)了正常大便習(xí)慣，消除了CDI癥狀，表明FFT中的細(xì)菌成分、代謝物或噬菌體發(fā)揮了作用，并且大大降低了糞菌移植(fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT)轉(zhuǎn)移不確定的活細(xì)菌的安全性風(fēng)險[15]。

噬菌體療法目前尚未被列為常規(guī)的細(xì)菌感染治療手段，但越來越多的多重耐藥菌感染病例獲得了噬菌體療法許可。表1列舉了一些近幾年使用噬菌體治療多重耐藥細(xì)菌感染的臨床個案，包括敗血癥、尿路感染和關(guān)節(jié)感染等。雖然未經(jīng)過大規(guī)模的臨床試驗，但這些結(jié)果對于建立現(xiàn)代噬菌體治療方案有幫助。在未來幾年，噬菌體治療感染性疾病的臨床研究會不斷增加。

表1 噬菌體療法的臨床病例

3 噬菌體療法在非感染性疾病中的應(yīng)用探索

多項研究顯示，人體微生物群主要是腸道菌群，與人體健康密切相關(guān)，腸道菌群結(jié)構(gòu)及其相應(yīng)代謝產(chǎn)物的變化與肥胖、腸易激綜合征、癌癥、抑郁、動脈粥樣硬化和自閉癥等多種非感染性疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[24-27]。隨著對人體微生物群與宿主健康之間關(guān)系的研究不斷深入，通過調(diào)控人體微生物群來輔助治療或預(yù)防疾病的策略成為疾病干預(yù)方向之一。現(xiàn)有的靶向微生物群的治療策略如抗生素、益生菌、FMT等均存在引起感染、攜帶耐藥基因等安全風(fēng)險，同時對微生物群的整體組成存在影響，且精準(zhǔn)性不足，因此療效較難評價。基于噬菌體的作用特點，噬菌體療法有望成為精準(zhǔn)調(diào)控人體微生物群的策略之一。近年來，該策略嘗試用于炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)、糖尿病及酒精性肝病等動物模型，獲得了有效結(jié)果。在腫瘤免疫治療中，影響治療效果的腸道菌也可作為噬菌體的調(diào)控靶標(biāo)而有望 “增效”[28]。

3.1 IBD

IBD包括克羅恩病(Crohn’s disease，CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)，是一種慢性復(fù)發(fā)性胃腸道疾病。IBD的確切病因尚不明確，但被認(rèn)為是環(huán)境因素與遺傳易感性相互作用，最終導(dǎo)致黏膜免疫異常應(yīng)答[29]。許多研究發(fā)現(xiàn)，IBD患者腸道微生物群的生物多樣性顯著降低[30-31]。在CD患者腸道黏膜中，具有黏附性的侵襲性大腸埃希菌(adherent invasiveEscherichiacoli，AIEC)的定植概率顯著增加，而針對AIEC定植提出的治療策略包括抗生素治療、FMT、營養(yǎng)干預(yù)或給予益生菌治療等結(jié)果均不理想[32]。一項針對AIEC的噬菌體療法取得了較好結(jié)果：研究人員篩選了3種烈性噬菌體，混合后進(jìn)行動物實驗，結(jié)果顯示噬菌體能在AIEC定植的小鼠回腸、盲腸和結(jié)腸中復(fù)制，引起AIEC水平下降伴隨結(jié)腸炎癥狀減輕[33]。

近年來，關(guān)于IBD與腸道噬菌體組關(guān)系的研究逐漸增多。有研究表明，與對照組相比，CD患者的噬菌體增多[34]。一項針對UC、CD患者及正常人糞便中病毒樣顆粒測序和細(xì)菌16S rRNA序列的詳細(xì)分析顯示，UC和CD患者中有尾噬菌體豐度增加，更重要的是隨著IBD相關(guān)噬菌體豐度顯著增加，細(xì)菌的豐度和多樣性下降。該研究首次表明，腸道病毒組的噬菌體成分在CD和UC患者中發(fā)生了獨特變化，可能增加了發(fā)病的可能性[35]，這為發(fā)現(xiàn)IBD的病毒診斷標(biāo)記和開發(fā)新治療策略提供了理論基礎(chǔ)。

然而，在小鼠模型中噬菌體干預(yù)可能導(dǎo)致天然免疫和適應(yīng)性免疫增強，這是噬菌體本身或噬菌體裂解導(dǎo)致細(xì)菌釋放脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等的結(jié)果。有研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體可作為抗原結(jié)合Toll樣受體9(Toll-like receptor 9，TLR9)，激活腸道黏膜的干擾素γ(interferon γ，IFNγ)通路而加劇腸炎癥狀。因此，在實際應(yīng)用之前，需要精確評估噬菌體干預(yù)對免疫系統(tǒng)的影響[36]。

3.2 結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)

多項研究表明，結(jié)腸菌群失調(diào)是CRC發(fā)生的重要原因之一。有證據(jù)顯示，具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum，F(xiàn)n)能促進(jìn)CRC的發(fā)生[26,37]。與CRC發(fā)生發(fā)展相關(guān)的微生物還包括脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)及AIEC等[38]。鑒于腸道菌群與CRC之間的關(guān)系，輔助治療和預(yù)防CRC的菌群調(diào)控策略備受關(guān)注[39]。

來自武漢大學(xué)的研究團(tuán)隊報道了一種噬菌體介導(dǎo)的納米藥物，他們選擇了一株可特異性抑制Fn生長的溫和噬菌體并通過化學(xué)方法將其疊氮化，然后將疊氮化的噬菌體與加工過的化學(xué)藥物連接，形成以噬菌體為載體的納米藥物。動物實驗證明該噬菌體能抑制Fn增殖，并介導(dǎo)藥物在腫瘤組織局部富集，提升了CRC的化療效果[40]。近期，該研究團(tuán)隊又利用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建了一株表達(dá)特異結(jié)合Fn蛋白的M13噬菌體，并將納米銀(silver nanoparticle，AgNP)顆粒靜電組裝在其表面衣殼蛋白(M13@Ag)上，實現(xiàn)了對Fn富集部位的精確識別，繼而促進(jìn)藥物在腫瘤組織發(fā)揮作用[41]。他們的研究主要將噬菌體作為藥物載體而非直接利用噬菌體的殺菌能力，增加了其通用性。另一個研究團(tuán)隊則使用AIEC特異性噬菌體治療AIEC定植的CRC小鼠，結(jié)果顯示AIEC定植顯著減少，腫瘤縮小，小鼠生存率提升。與此相一致的是，小腸組織轉(zhuǎn)錄組分析顯示，與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和胃腸道癌侵襲有關(guān)的基因在噬菌體治療的小鼠體內(nèi)表達(dá)明顯下調(diào)[36]。以上這些結(jié)果為腸道腫瘤的治療提供了新思路。

3.3 2型糖尿病

糖尿病嚴(yán)重威脅全球人類健康，多項研究表明2型糖尿病(type 2 diabetes，T2D)與腸道微生物群改變有關(guān)，但二者之間的因果關(guān)系與潛在機制仍有待研究[42,43]。一項對71例T2D患者和74例正常人糞便標(biāo)本進(jìn)行的腸道噬菌體組分析顯示，T2D組的腸道噬菌體數(shù)量顯著增加，并且確定了7種與T2D具有相關(guān)性的噬菌體操作分類單元(phage operational taxonomic unit，pOTU)[44]。這一發(fā)現(xiàn)在包含116份 T2D患者樣本和109份對照樣本的獨立數(shù)據(jù)集中得到進(jìn)一步驗證[44]。該研究還對腸道菌群與pOTU進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了人類腸道生態(tài)系統(tǒng)中細(xì)菌與噬菌體之間復(fù)雜的相互作用，表明腸道噬菌體的顯著變化不能簡單地用與細(xì)菌宿主共變異來解釋[44]。

受FFT成功治療難治性CDI的啟發(fā)，Torben等對高脂飲食小鼠進(jìn)行糞便病毒移植(fecal virome transplantation，F(xiàn)VT)，發(fā)現(xiàn)在接受了低脂飲食瘦小鼠的糞便病毒組之后，F(xiàn)VT組小鼠體重增加幅度明顯降低，葡萄糖耐受性恢復(fù)正常。同時，與高脂飲食小鼠相比，F(xiàn)VT組小鼠腸道病毒和細(xì)菌多樣性更接近于瘦小鼠，菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變。FVT組小鼠脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生顯著改變，肝臟和回腸組織中瘦素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、糖代謝和脂解相關(guān)的7個基因差異表達(dá)，可能影響糖耐量和體重增加。該研究為設(shè)計針對人類肥胖和T2D的FVT臨床研究提供了基礎(chǔ)，強調(diào)了在糞便移植治療中去除細(xì)菌的觀點，這樣才能降低細(xì)菌引起的侵襲性感染[45]。

3.4 酒精性肝病

長期大量飲酒引起的酒精性肝病是全球性疾病負(fù)擔(dān)，初期通常表現(xiàn)為脂肪肝，進(jìn)而可發(fā)展成酒精性肝炎、肝纖維化和肝硬化[46]。一項關(guān)于酒精性肝病與腸道微生物的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)腸道微生物能促進(jìn)酒精引起的肝臟疾病[47]。最新研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，酒精性肝炎患者腸道中產(chǎn)溶細(xì)胞毒素的糞腸球菌數(shù)量顯著增加，且溶細(xì)胞毒素產(chǎn)量與疾病嚴(yán)重程度和死亡率有關(guān)，約90%的溶細(xì)胞毒素陽性患者在入院后180 天內(nèi)死亡，而溶細(xì)胞毒素陰性患者中這一比例為4%。研究人員篩選出4株靶向產(chǎn)毒素糞腸球菌的噬菌體，制備成噬菌體混合液，對產(chǎn)毒素糞腸球菌定植的小鼠進(jìn)行灌胃治療，結(jié)果表明噬菌體能降低肝臟中的溶細(xì)胞毒素，并減輕酒精引起的小鼠肝臟病理改變[48]。

3.5 高血壓

研究表明，腸道微生物群與高血壓的發(fā)生有重要關(guān)系[49-50]。Weinbauer等對來自健康組、高血壓前期組和高血壓組的196份糞便標(biāo)本進(jìn)行病毒組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)了397個病毒類群，其中幾種病毒在3組之間有顯著性差異，如鏈球菌噬菌體phiAbc 2、克羅諾桿菌噬菌體(Cronobacterphage)CR3和C.medinalis顆粒病毒[51]。這些以噬菌體為主的病毒首次被發(fā)現(xiàn)與高血壓的發(fā)生存在聯(lián)系，推測其可能參與調(diào)節(jié)腸道菌群的組成，從而影響高血壓的發(fā)展。此外還發(fā)現(xiàn)，與細(xì)菌相比，病毒具有更好的分辨和鑒別高血壓樣本的能力。雖然病毒與高血壓之間的關(guān)系尚不清楚，但這并不妨礙選擇將病毒作為診斷高血壓分期的潛在生物標(biāo)記。在高血壓患者中還發(fā)現(xiàn)了越來越普遍的“病毒-細(xì)菌”連鎖模式。這些結(jié)果均表明腸道病毒的改變與高血壓有關(guān)[51]。

4 結(jié)語

4.1 噬菌體在感染性疾病治療中應(yīng)用的局限性

雖然采用噬菌體治療嚴(yán)重感染的成功案例不斷增加，但目前噬菌體療法仍存在許多問題亟待解決，其中最重要的是噬菌體制劑的安全性和有效性。作為一種有活性的生物制劑，其生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)和要求不能完全沿用藥物生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，但目前還沒有明確的指南對標(biāo)人用噬菌體的生產(chǎn)，相關(guān)規(guī)范和要求有待完善。公認(rèn)的對治療性噬菌體的要求是不含有編碼溶原性、毒力因子及抗生素耐藥的基因，然而這可能會導(dǎo)致在一些細(xì)菌中使用噬菌體療法受限，如目前還未發(fā)現(xiàn)以艱難梭菌為宿主的烈性噬菌體[52]。還需考慮到烈性噬菌體短期大量裂解細(xì)菌可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)、LPS和核酸過度積累，進(jìn)一步加劇炎癥的問題[35]。令人鼓舞的是，迄今為止噬菌體療法相關(guān)臨床研究均未發(fā)現(xiàn)噬菌體引起的嚴(yán)重不良反應(yīng)[53]。此外，制備成本較高、噬菌體制劑穩(wěn)定性的保持以及快速篩選噬菌體方法的開發(fā)等都是需要在應(yīng)用中解決的問題。

4.2 利用噬菌體調(diào)節(jié)腸道微生物群的思考

利用噬菌體調(diào)節(jié)腸道微生物群來輔助治療疾病正處于起步階段，不僅面臨與感染性疾病治療相同的問題，還有其他挑戰(zhàn)。首先是基礎(chǔ)研究相對不足，雖然能在一些疾病中觀察到微生物組成改變，但是這些改變的機制仍未探明，僅有少數(shù)研究表明微生物群改變與疾病存在明確的因果關(guān)系。因此，噬菌體組與疾病的關(guān)系還有待在更多人群中進(jìn)行檢測和分析。限于目前的數(shù)據(jù)分析水平，人體噬菌體組尚未被全面了解。宏基因組學(xué)研究證實，腸道內(nèi)80%～90%的噬菌體未被注釋，已知的噬菌體僅占人體腸道噬菌體的少部分[54]。新的生物信息學(xué)工具和逐步豐富的參考數(shù)據(jù)庫提供了更精確的分辨率，將會進(jìn)一步促進(jìn)腸道噬菌體相關(guān)研究。此外，噬菌體顆?？赡軙鳛槊庖咴|發(fā)機體免疫反應(yīng)[55]，而免疫系統(tǒng)對各種噬菌體相關(guān)抗原在腸道系統(tǒng)的反應(yīng)還未得到充分探索。因此，雖然在本綜述涉及病例中已觀察到噬菌體調(diào)控菌群的作用，但其具體機制仍有待明確。

4.3 展望

由于噬菌體療法在感染性和非感染性疾病的預(yù)防和輔助治療中有潛在應(yīng)用前景，其從基礎(chǔ)研究向臨床轉(zhuǎn)化勢在必行。然而，利用噬菌體或其他微生態(tài)制劑干預(yù)腸道微生物群并不能取代疾病常規(guī)治療手段，只是提供了一種輔助治療方式以延緩病程，或在一定程度上起到預(yù)防作用，不能罔顧實驗證據(jù)而夸大調(diào)控微生物群的作用。目前，人體微生物群與健康之間存在聯(lián)系的證據(jù)越來越明確，因此不應(yīng)忽視調(diào)控微生物群對疾病治療的作用，在深入的基礎(chǔ)研究、有效的臨床試驗、革新的監(jiān)管體系，以及相應(yīng)的教育和培訓(xùn)等多方位共同推進(jìn)下，噬菌體療法有望在醫(yī)療實踐中得到進(jìn)一步驗證。