大鼠體外膜肺氧合設(shè)備的研制與模型應(yīng)用

陳原森，劉子泉，王海旺，蔡金霞，李文莉，侯世科，樊毫軍，張偉麗，劉燕青

體外膜肺氧合（Extracorporeal Membrane Oxygenation，ECMO）作為一種重要的體外生命支持（Extracorporeal Life Support，ECLS）技術(shù)，臨床上主要用于常規(guī)治療無效的嚴(yán)重心臟衰竭和/或肺衰竭患者的輔助支持治療[1]。由于該技術(shù)可在較長時間內(nèi)全部或部分替代患者的心肺功能，迅速改善危重癥患者的低氧血癥和循環(huán)衰竭狀態(tài)，為心肺疾患的救治和功能恢復(fù)贏得時間，有效降低患者的死亡率，目前ECMO已經(jīng)成為治療難以控制的嚴(yán)重心力衰竭和呼吸衰竭的關(guān)鍵技術(shù)[2]。但受患者自身疾病及ECMO技術(shù)特點所限，接受ECMO輔助治療的患者常面臨繼發(fā)多種并發(fā)癥的可能[3,4]。為了探索ECMO的最佳救治方案，防治相關(guān)并發(fā)癥，國內(nèi)外學(xué)者建立了多種ECMO動物模型，模型動物主要選用豬、狗、羊和大鼠[5-9]。大鼠價格低廉，易于飼養(yǎng)，心血管系統(tǒng)與人類相似，可用于大樣本研究的篩選和論證實驗，也適合進(jìn)行基因敲除等分子機(jī)制研究，因此，近年來利用大鼠制作ECMO模型的研究逐漸增多[10]，本文就目前大鼠用ECMO系統(tǒng)及ECMO模型應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 大鼠用ECMO系統(tǒng)

1.1 循環(huán)回路的組成大鼠ECMO系統(tǒng)，如圖1所示，主要由血泵、小動物專用膜肺、熱交換器、血管內(nèi)插管及連接管路等組件構(gòu)成。有研究在引流端插管和泵間加入含有預(yù)充液的注射器作為蓄水池以支持系統(tǒng)血液循環(huán)并消除可能產(chǎn)生的氣泡[11]。

圖1 大鼠ECMO循環(huán)回路

1.1.1 血泵臨床常用的血泵有滾壓泵和離心泵兩種。滾壓泵依靠轉(zhuǎn)輾對管路交替擠壓和釋放來驅(qū)動血液，離心泵則依靠葉輪旋轉(zhuǎn)來驅(qū)使血液流動。離心泵作為新的技術(shù)彌補(bǔ)了滾壓泵的一些缺陷：如轉(zhuǎn)輾與管路的直接接觸會增加滾壓泵管路破裂的風(fēng)險；需要適當(dāng)校準(zhǔn)以保證滾壓泵功能正常[12]。目前臨床上離心泵已經(jīng)被廣泛用于ECLS，但對于大鼠模型來說，離心泵泵頭預(yù)充量過大，如ECMO系統(tǒng)中常用的離心泵泵頭最小預(yù)充量為16 ml，但有些品牌的泵頭最小充量則超過30 ml[13]。此外，大鼠ECMO運轉(zhuǎn)所需的流速較低，通常不超過100 ml/min，而離心泵誤差一般為0.1 L/min[13]，無法實現(xiàn)大鼠ECMO流量的精確控制?；谝陨显?，目前大鼠ECMO一般采用小型蠕動泵，通過選擇合適的泵管及轉(zhuǎn)速，可實現(xiàn)對流速的精確控制；此外，使用蠕動泵也可減小回路預(yù)充量。

1.1.2 微型氧合器大鼠血量約為64 ml/kg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于人體，因此人用的氧合器（膜肺）不適用于大鼠，需要研制大鼠專用的氧合器。大鼠氧合器要求預(yù)充量少并具有足夠的氣體交換面積。在早期的大鼠體外循環(huán)和ECMO模型實驗中，研究者一般自制氧合器[11,14-19]。隨著近年來大鼠ECMO和體外循環(huán)研究逐漸增多，一些公司研制并推出了大鼠專用的膜式氧合器[20-21]。如某公司研制的Micro-1大鼠膜式氧合器，預(yù)充量僅為3.5ml，氣體交換面積達(dá)到0.05 m2，被多個研究團(tuán)隊的大鼠ECMO模型所采用[22-25]。

1.1.3 熱交換器熱交換器用于調(diào)節(jié)ECMO運轉(zhuǎn)時的血液溫度，維持大鼠體溫。在大鼠ECMO模型中常用的熱交換器有加熱燈和恒溫水箱[14,26]。加熱燈不能精確控制溫度。而通過恒溫水箱加熱則需要在回路中添加熱交換裝置，會增加回路的預(yù)充量，通過定制專用熱交換裝置能有效控制回路預(yù)充量。You等[14]自制熱交換器及水箱，在循環(huán)期間約有1～2 ml血液留在熱交換器中。

1.2 ECMO的模式根據(jù)血液回輸途徑不同，大鼠ECMO通常分為多種模式：靜脈-動脈（Veno-Arterial，V-A）ECMO，靜脈-靜脈（Veno-Venous，V-V）ECMO和動脈-靜脈（Arterio-Venous，A-V）ECMO。V-A ECMO將血液從大鼠靜脈系統(tǒng)引出，經(jīng)過體外氧合并排出二氧化碳，再通過動脈泵入，可同時為大鼠提供呼吸和循環(huán)支持；V-V ECMO將血液從大鼠靜脈系統(tǒng)引出，經(jīng)過體外氧合并排出二氧化碳，再通過靜脈回輸，可為大鼠提供呼吸支持[27-28]。A-V ECMO則是利用動靜脈壓力差驅(qū)動血液，該模式通常用于患者的呼吸支持。相較于V-A ECMO，目前V-V ECMO和A-VECMO相關(guān)的大鼠模型鮮見報道。2020年，Yutaka等[29]建立了一種簡單、可維護(hù)的新型大鼠V-V ECMO模型以探討ECMO循環(huán)過程中的生物反應(yīng)機(jī)制。有些研究根據(jù)其研究內(nèi)容和實驗設(shè)計，可選擇其他循環(huán)模式，如Nao等[30]制作大鼠A-V ECMO模型探索ECMO循環(huán)過程中肝素用量對氧合器血栓形成的影響，該模式下減小了引流端引流難度。

2 大鼠ECMO模型的一些問題

2.1 關(guān)于穿刺置管一般根據(jù)實驗大鼠體質(zhì)量和置管部位血管口徑選擇合適的血管內(nèi)插管。大鼠ECMO模型常以頸靜脈作為系統(tǒng)的引流端，一般將引流插管置于上腔靜脈、下腔靜脈與右心房交界處。為保證引流端的順利引流，一些研究選擇帶有多個側(cè)孔的導(dǎo)管[29]或自制多孔導(dǎo)管[26]作為靜脈引流插管，如圖2所示。此外，將插管經(jīng)頸靜脈推送至右心房也可保證順利引流[23]。V-A ECMO大鼠模型常以頸動脈，尾動脈和股動脈等作為系統(tǒng)的回流端；V-V ECMO大鼠模型常以股靜脈作為系統(tǒng)的回流端。

圖2 多孔導(dǎo)管示意圖

2.2 關(guān)于肝素抗凝在大鼠ECMO循環(huán)過程中為了防止凝血和血栓形成，通常會在循環(huán)開始前給大鼠注射肝素以達(dá)到全身抗凝的目的，常用的肝素劑量為500 IU/kg[23-24,31-33]。常用激活全血凝固時間（Activated Clotting Time，ACT）評價抗凝效果。Chang等[22]使用劑量為500 IU/只肝素使模型大鼠ACT維持300 s以上；Yutaka等[29]建立的大鼠V-V ECMO模型則將ACT維持在200-250 s之間。但目前多數(shù)大鼠ECMO模型相關(guān)研究沒有檢測ACT。

2.3 關(guān)于運行時間不同大鼠模型ECMO的運行時間有所不同，但目前大多數(shù)大鼠ECMO模型運行時間控制在2 h以內(nèi)[14-17,20,33]。其可能原因是大鼠ECMO管路不具有抗凝涂層，長時間運轉(zhuǎn)可能會增加血栓等并發(fā)癥的風(fēng)險。

3 大鼠ECMO模型的應(yīng)用

3.1 心臟驟停（Cardiac Arrest，CA）研究體外心肺復(fù)蘇術(shù)（Extracorporeal Cardiopulmonary Resuscitation，ECPR）治療難治性CA是ECMO動物模型一個重要的應(yīng)用方向。雖然目前已經(jīng)建立了大動物的ECPR模型[5]，但利用小動物進(jìn)行ECPR研究不僅經(jīng)濟(jì)而且適合開展大規(guī)模的實驗研究，還可引入分子和免疫學(xué)等手段。Andreas等[34]的研究比較了ECPR和傳統(tǒng)心肺復(fù)蘇（Cardiopulmonary Resuscitation，CPR）對CA大鼠的救治效果：首先制作室顫致大鼠CA模型，在CA持續(xù)6 min后，分別使用ECPR和傳統(tǒng)CPR進(jìn)行救治，結(jié)果表明在CA 6 min后ECPR是可行的，但與傳統(tǒng)CPR相比未見顯著優(yōu)勢。Magnet等[35]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠CA持續(xù)10 min后，分別用采用傳統(tǒng)CPR和低溫ECPR救治進(jìn)行對照，結(jié)果表明低溫ECPR救治效果顯著優(yōu)于傳統(tǒng)CPR。

3.2 急性肺損傷研究急性肺損傷是臨床常見重癥，ECMO可以在無機(jī)械通氣輔助的情況下改善患者氧合。在救治急性呼吸窘迫綜合征方面有著廣闊的應(yīng)用前景。陳永梅等[36]探索了ECMO救治內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠的可行性：將30只大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組和ECMO組，監(jiān)測ECMO運行過程中各組動物的血氣分析數(shù)據(jù)，實驗結(jié)束后稱量各組大鼠肺組織的干濕重比，結(jié)果表明ECMO體外轉(zhuǎn)流可減輕肺水腫，有助于改善內(nèi)毒素致肺損傷后的氣體交換。

3.3 ECMO運行期間炎癥反應(yīng)研究ECMO運行過程可能引發(fā)全身的炎癥反應(yīng)并導(dǎo)致多器官功能損傷。目前部分研究利用大鼠模型探索ECMO運行期間發(fā)生的炎癥反應(yīng)。Yutaka等[37]觀察了大鼠ECMO運行期間動脈氧分壓（Partial Pressure Of Arterial Oxygen，PaO2） 對炎癥反應(yīng)和肺組織的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在ECMO運行期間出現(xiàn)了全身性的炎癥反應(yīng)并引發(fā)了多器官功能損害，包括肺水腫的產(chǎn)生；此外，ECMO運行期間產(chǎn)生了腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）等炎性因子，而較高的動脈氧分壓（PaO2≥300mmHg）會加劇炎性因子的產(chǎn)生。Fabian等[21]觀察了不同小動物氧合器對機(jī)體炎癥反應(yīng)的影響：比較兩種不同大小和排列方式的中空纖維膜氧合器（Micro-1和SAMO）對炎癥反應(yīng)的影響和不同灌流量對大鼠稀釋性貧血的影響，檢測ECMO運行前后的血紅蛋白（Hemoglobin，Hb）濃度來評估稀釋性貧血，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Micro-1組大鼠的TNF-α和IL-6水平更高。

3.4 ECMO血栓并發(fā)癥研究出血和血栓形成是ECMO常見的并發(fā)癥。血栓形成會大大縮短氧合器的使用壽命，抗凝劑雖然可以抑制血栓形成，但會造成出血并發(fā)癥，因此需要限制使用[38]。目前已經(jīng)建立了一些大動物模型以探索氧合器中血栓形成的機(jī)制[39]。但關(guān)于大鼠ECMO模型的血栓并發(fā)癥研究則極為鮮見。原因可能是大多數(shù)大鼠ECMO模型使用了高劑量的抗凝策略，利用大鼠研究ECMO的血栓并發(fā)癥存在困難；此外，大鼠ECMO模型回路預(yù)充量相對較大，易造成稀釋性貧血，不利于研究血栓等并發(fā)癥。Nao等[30]使用3D打印的模擬氧合器研究大鼠ECMO系統(tǒng)血栓形成與抗凝劑的關(guān)系，該研究所用的3D打印模擬氧合器尺寸為20.0 mm×7.3 mm×3.0 mm，腔體內(nèi)填充有實心棒模擬中空纖維，填充密度為50%，該氧合器具有和目前市售氧合器近似的結(jié)構(gòu)和表面積體積比，同時整個回路的預(yù)充量僅為2.5 ml，減少了對血液的稀釋作用。使用模擬氧合器的ECMO系統(tǒng)循環(huán)8 h后紅細(xì)胞壓積（Hematocrit，HCT）和Hb濃度僅比基線值降低20%～30%，表明該模型模擬氧合器血栓形成是可行的，但該模擬氧合器不具備氣體交換的功能，不能用于疾病模型的 研究。

4 局限性

目前，雖然大鼠ECMO模型有著越來越廣闊的應(yīng)用前景，但該模型還存在一些局限：第一，由于氧合器、熱交換器等設(shè)備所限，多數(shù)大鼠ECMO回路的預(yù)充量大于10 ml，這會造成血液很大程度的稀釋，導(dǎo)致稀釋性貧血，使得大鼠模型和臨床存在差異；第二，由于大鼠專用氧合器和管路缺乏抗凝涂層，為防止凝血和血栓形成，目前大鼠ECMO模型常采用大劑量肝素抗凝，以致ECMO相關(guān)的凝血等并發(fā)癥難以在大鼠模型中開展實驗研究；第三，大鼠ECMO模型制作難點主要集中在動靜脈置管等操作上，這需要長時間、反復(fù)地練習(xí)，才能提高模型成功率和穩(wěn)定性；第四，目前的大鼠ECMO模型主要為V-A ECMO模式，相關(guān)的疾病研究也主要集中在心臟疾病等方面，急需開發(fā)更多、更穩(wěn)定的大鼠V-V ECMO模型。

5 展 望

目前，ECMO主要用于難治性心源性休克、CA、急性呼吸衰竭等疾病的支持治療，而ECMO相關(guān)并發(fā)癥的防治將是未來研究的重點。針對大鼠ECMO模型和設(shè)備的缺陷，改善大鼠ECMO系統(tǒng)的各個環(huán)節(jié)，改進(jìn)氧合器等關(guān)鍵設(shè)備，減少系統(tǒng)預(yù)充量，構(gòu)建更簡單、穩(wěn)定和更貼近臨床的大鼠ECMO模型將是未來的發(fā)展方向。隨著大鼠ECMO模型的逐步完善，其不僅可用于治療方案的優(yōu)化和并發(fā)癥的防治研究，ECMO聯(lián)合其他治療手段的實驗研究也是頗具潛力的發(fā)展方向[40-41]。隨著ECMO設(shè)備性能、臨床操作技術(shù)和基礎(chǔ)實驗研究的不斷進(jìn)步，未來ECMO將為危重癥患者提供更安全的心肺支持功能，發(fā)揮更好的救治效果。