微型氫化物發(fā)生-原子熒光法測(cè)定水產(chǎn)品汞形態(tài)

程雪萌，羅明標(biāo)*，席群麗，左麗華，李咸宇，王為民，楊梅，龔治湘

（1.東華理工大學(xué)江西省合成化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330013；2.譜焰實(shí)業(yè)（上海）有限公司，上海 200000）

汞是影響人類和生態(tài)系統(tǒng)健康的環(huán)境污染物之一[1]，所有汞都是有毒的，汞的毒性、生物利用度和流動(dòng)性不僅取決于其總濃度，而且還取決于其化學(xué)形式[2]，形態(tài)不同，產(chǎn)生的毒性也不同，其中有機(jī)汞化合物通常比無(wú)機(jī)汞更具毒性[3]。蝦蟹等水產(chǎn)品處于水生食物鏈較高位置，經(jīng)食物鏈累積和生物放大作用，其體內(nèi)通常積累了高濃度的有機(jī)汞，并通過(guò)食物鏈富集到人體內(nèi)，對(duì)人體產(chǎn)生毒害作用[4-5]。因此，水產(chǎn)品中的形態(tài)分析具有非常重要的社會(huì)意義。汞形態(tài)分析最常見(jiàn)的方法是將一種強(qiáng)大的分離技術(shù)與一種靈敏的原子光譜檢測(cè)儀聯(lián)用，例如氣相色譜（gas chromatography，GC）、液相色譜（liquid chromatography，LC），或者是毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）與電感耦合等離子體發(fā)射光譜（inductively coupled atomic emission spectroscopy，ICP-AES）、電感耦合等離子質(zhì)譜（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）、原子熒光光譜（atomic fluorescence spectroscopy，AFS）、原子吸收光譜（atomic absorption spectroscopy，AAS）等聯(lián)用[6-13]，盡管這些聯(lián)用技術(shù)強(qiáng)大，可以提供更多的信息，但是也存在一些缺點(diǎn)，大多儀器造價(jià)昂貴不適于普及，且均需要分離富集等復(fù)雜的預(yù)處理步驟[14-17]。而本試驗(yàn)不需聯(lián)用技術(shù)，單用成本低廉、靈敏度高，基體干擾小的原子熒光光度計(jì)[18-19]即可實(shí)現(xiàn)汞形態(tài)的準(zhǔn)確檢測(cè)。試驗(yàn)利用汞不同形態(tài)的化學(xué)行為，以溴化劑作為有機(jī)汞的消解劑，以非色譜方法將有機(jī)汞轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)汞，在有無(wú)溴化劑的條件下，檢測(cè)水產(chǎn)品中總汞和無(wú)機(jī)汞，利用差減法即可得出有機(jī)汞的含量。采用具有新型微型氫化物發(fā)生裝置的原子熒光光度計(jì)[20]，將氫化物發(fā)生控制在一個(gè)非常狹小的空間里，使氫化物可以在最短的時(shí)間和路徑內(nèi)被快速送入原子化器，可以有效地降低汞的記憶效應(yīng)，使得原子熒光光度計(jì)在檢測(cè)有機(jī)汞的同時(shí)提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。本文以溴化劑作為有機(jī)汞消解劑，微型氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法作為檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)水產(chǎn)品中汞形態(tài)準(zhǔn)確檢測(cè)，該方法高效、簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉，為水產(chǎn)品中汞形態(tài)的測(cè)定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽酸（優(yōu)級(jí)純）、硝酸（優(yōu)級(jí)純）、溴酸鉀（分析純）、鹽酸羥胺（分析純）、硼氫化鈉（分析純）、高錳酸鉀（分析純）、過(guò)硫酸鈉（分析純）、氫氧化鈉（分析純）：西隴化工股份有限公司；溴化鉀（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；Hg標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（10 μg/L）、氯化甲基汞、氯化乙基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液：Merck公司；水產(chǎn)品：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

CAF-1800原子熒光光度計(jì)：譜焰實(shí)業(yè)（上海）有限公司；TG18-WS臺(tái)式高速離心機(jī)：長(zhǎng)沙市維爾康湘鷹離心機(jī)有限公司；摩爾分析型超純水器制備：上海摩勒生物科技有限公司；0.45 μm濾膜：美國(guó)Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 提取方法

稱取樣品 0.50 g～2.0 g（精確至 0.000 1 g），置于15 mL塑料離心管中，加入10 mL的鹽酸溶液（5 mol/L），25℃下超聲30 min并放置過(guò)夜。25℃超聲水浴提取60 min，期間振搖數(shù)次。4℃下以8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min。隨后吸取上清液，并用0.45 μm濾膜過(guò)濾，保存于4℃。

1.3.2 樣品中有機(jī)汞及無(wú)機(jī)汞的測(cè)定

取2.5 mL溶液置于離心管中，加入5 mL 50% HCl，定容至25 mL后，直接上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果為無(wú)機(jī)汞含量。取2.5 mL溶液置于離心管中，加入5 mL 50% HCl，0.5 mL溴化劑（30 g/L溴化鉀+10 g/L溴酸鉀），塞上瓶蓋，放40 min，后滴加1滴～3滴鹽酸羥胺溶液（30 g/L），用力振搖100次，至溶液由黃色轉(zhuǎn)為無(wú)色，定容至25 mL，上機(jī)檢測(cè)總汞含量。有機(jī)汞的含量為兩者之差。同時(shí)做空白試驗(yàn)。

1.3.3 有機(jī)汞對(duì)無(wú)機(jī)汞測(cè)定的影響

從 50 ng/mL Hg 標(biāo)準(zhǔn)溶液里分別取 0、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 于 25 mL 容量瓶中，各加入5 mL 50% HCl，用水稀釋至刻度搖勻備用，配制成系列濃度為 0、0.2、0.4、0.6、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ng/mL 的無(wú)機(jī)汞溶液。從25 ng/mL氯化甲基汞和氯化乙基汞混標(biāo)溶液（其中氯化甲基汞溶液與氯化乙基汞溶液濃度相同）里分別取 0、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于25 mL容量瓶中，各加入5 mL 50% HCl，用水稀釋至刻度搖勻備用，配制成系列濃度為 0、0.2、0.4、0.6、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ng/mL 的有機(jī)汞溶液。

1.3.4 溴化劑用量及消解時(shí)間方法建立

兩組樣品，第一組分別取樣品組織液2.5 mL置于若干個(gè)離心管中，加入5 mL 50% HCl，2.5 mL 10 ng/mL的氯化甲基汞乙基汞混標(biāo)溶液，再分別加入0.3、0.5、1、2、3 mL溴化劑，塞上瓶蓋，在25℃下分別放置20、40、60、80、100、120 min，后滴加 1 滴～3 滴鹽酸羥胺溶液，用力振搖100次，至溶液由黃色轉(zhuǎn)為無(wú)色，定容至25 mL。第二組不加氯化甲基汞乙基汞混標(biāo)溶液，其它條件同上，上機(jī)檢測(cè)并計(jì)算回收率。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

汞標(biāo)準(zhǔn)工作液：用10 μg/L Hg標(biāo)準(zhǔn)溶液（含5% HNO3）稀釋至 100 ng/mL（含 5% HNO3），臨用時(shí)將此溶液稀釋成5 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液（含2% HNO3）。分別取此溶液 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 于 25 mL 容量瓶中，各加入5 mL 50% HCl，用水稀釋至刻度搖勻備用，配制成系列濃度為 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 ng/mL 的 Hg溶液。

1.3.6 參數(shù)優(yōu)化

配制0.5 ng/mL的Hg標(biāo)準(zhǔn)溶液，固定其它條件不變，分別改變NaBH4溶液在0.02%～0.50%之間，優(yōu)化出最佳NaBH4濃度；固定其它條件不變，分別改變鹽酸溶液濃度在5%～20%之間，優(yōu)化出最佳鹽酸濃度；固定其它條件不變，分別改變燈電流在5 mA～35 mA之間，優(yōu)化出最佳燈電流；固定其它條件不變，分別改變負(fù)高壓在200 V～250 V之間，優(yōu)化出最佳負(fù)高壓。

1.3.7 CAF-1800原子熒光光度計(jì)儀器工作條件

光電倍增管負(fù)高壓：220 V；燈電流：15 mA；原子化器高度：9 mm；載帶氣流量：500 mL/min；屏蔽氣流量：1 000 mL/min；延遲時(shí)間：0 s；讀數(shù)時(shí)間：10 s；進(jìn)樣量：2 mL；測(cè)量方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法；讀數(shù)方式：峰面積。

1.4 數(shù)據(jù)處理

樣品分析均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。采用數(shù)學(xué)圖形分析軟件Origin85繪圖，用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)汞對(duì)無(wú)機(jī)汞測(cè)定的影響

分別配制無(wú)機(jī)汞系列和有機(jī)汞系列，在不加溴化劑的情況下，上機(jī)測(cè)定無(wú)機(jī)汞和有機(jī)汞的熒光強(qiáng)度。有機(jī)汞對(duì)無(wú)機(jī)汞測(cè)定的影響見(jiàn)圖1。

圖1 有機(jī)汞對(duì)無(wú)機(jī)汞測(cè)定的影響Fig.1 The influence of reducing agent on the determination of organic mercury

圖1表明，無(wú)機(jī)汞能與NaBH4反應(yīng)且呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，而有機(jī)汞只能與部分NaBH4反應(yīng)[21]，5 ng/mL的有機(jī)汞產(chǎn)生的信號(hào)小于同濃度無(wú)機(jī)汞信號(hào)的3%。因此在實(shí)際樣品分析中，有機(jī)汞的存在不會(huì)影響到無(wú)機(jī)汞的測(cè)定，直接測(cè)出的是無(wú)機(jī)汞。將樣品氧化后，有機(jī)汞可以轉(zhuǎn)化成可測(cè)定的無(wú)機(jī)汞，實(shí)現(xiàn)無(wú)機(jī)汞和有機(jī)汞的測(cè)定。

2.2 有機(jī)汞氧化劑的選擇

將有機(jī)汞轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)汞，常用的氧化劑有高錳酸鉀、過(guò)硫酸鈉、溴化劑等[22]。利用高錳酸鉀溶液（2%）、過(guò)硫酸鈉（2%）、溴化劑等氧化劑對(duì)1 ng/mL烷基汞標(biāo)液進(jìn)行氧化。表1為不同氧化劑及不同條件下對(duì)標(biāo)液中有機(jī)汞的氧化結(jié)果。

表1 25℃下不同氧化劑的消解效果（n=6）Table 1 Digestion effect of different oxidants at room temperature（n=6）

由表1可知，過(guò)硫酸鈉在25℃下不能很好地將有機(jī)汞轉(zhuǎn)化成無(wú)機(jī)汞，通常通過(guò)加熱、微波或紫外線輔助處理，以提高有機(jī)汞的轉(zhuǎn)化率[23]。高錳酸鉀在25℃下可以很好地轉(zhuǎn)化有機(jī)汞，但其作為氧化劑時(shí)，容易在管路內(nèi)壁生成二氧化錳，既會(huì)造成管路堵塞又會(huì)對(duì)元素產(chǎn)生吸附[5]。溴化劑在25℃下就可以很好地將有機(jī)汞轉(zhuǎn)化成無(wú)機(jī)汞，且不會(huì)出現(xiàn)管路堵塞的情況。綜合考慮，選擇溴化劑作為氧化劑。

2.3 溴化劑用量及消解時(shí)間的選擇

有機(jī)汞是否能夠消解完全，溴化劑的用量以及消解時(shí)間是關(guān)鍵因素。取若干份相同的螃蟹組織樣品提取液，改變溴化劑的用量和消解時(shí)間對(duì)其進(jìn)行氧化，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 溴化劑在不同用量和消解時(shí)間下對(duì)有機(jī)汞氧化結(jié)果的影響Fig.2 The effect of brominating agent on the results of organic mercury oxidation under different dosages and digestion times

由圖2可知，當(dāng)溴化劑含量在0.5 mL，消解時(shí)間達(dá)到40 min時(shí)回收率最好，因此最終選擇溴化劑用量為0.5 mL，消解時(shí)間為40 min。

2.4 無(wú)機(jī)汞和有機(jī)汞的標(biāo)準(zhǔn)曲線

為了驗(yàn)證溴化劑消解后的有機(jī)汞和無(wú)機(jī)汞溶液能否用同一條標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行測(cè)定，配制了加入相同溴化劑用量的有機(jī)汞標(biāo)液、無(wú)機(jī)汞標(biāo)液、有機(jī)汞與無(wú)機(jī)汞混標(biāo)溶液等3個(gè)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 3種系列溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard working curves of three series of solutions

由圖3可知，3種標(biāo)液的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率很接近，線性關(guān)系良好，表明總汞和無(wú)機(jī)汞可以用同一條曲線進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)也可以進(jìn)一步證明，溴化劑可以將有機(jī)汞完全氧化成無(wú)機(jī)汞。

2.5 參數(shù)優(yōu)化

2.5.1 還原劑溶液濃度的優(yōu)化

硼氫化鈉的濃度會(huì)影響到Hg的熒光強(qiáng)度，濃度太低會(huì)導(dǎo)致汞的熒光信號(hào)變?nèi)?，濃度太高時(shí)反應(yīng)產(chǎn)生的氫氣過(guò)多會(huì)稀釋汞蒸氣，使得靈敏度下降，精度變差。因此探究了不同NaBH4濃度下Hg的熒光強(qiáng)度，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同NaBH4濃度下Hg的熒光強(qiáng)度Fig.4 Fluorescence intensity of Hg under different NaBH4 concentrations

通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果綜合判斷，NaBH4溶液的濃度在0.2%時(shí)作為還原劑的效果最好。

2.5.2 鹽酸溶液濃度的優(yōu)化

鹽酸的濃度會(huì)影響氫氣的生成，進(jìn)而會(huì)使熒光強(qiáng)度受到影響。在優(yōu)選鹽酸溶液濃度的過(guò)程中，不同鹽酸濃度對(duì)Hg熒光強(qiáng)度的影響見(jiàn)圖5。

圖5 不同鹽酸濃度下Hg的熒光強(qiáng)度Fig.5 Fluorescence intensity of Hg under different HCl concentration

通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果綜合判斷，鹽酸溶液的濃度在10%時(shí)的效果最好。

2.5.3 燈電流的優(yōu)化

增加燈電流，會(huì)使汞的熒光強(qiáng)度增加，并且可以改善低濃度處的線性。但是燈電流過(guò)大會(huì)產(chǎn)生自吸現(xiàn)象，縮短高強(qiáng)度汞空心陰極燈的壽命。在優(yōu)選燈電流的過(guò)程中，不同燈電流對(duì)Hg熒光強(qiáng)度的影響見(jiàn)圖6。

圖6 燈電流對(duì)汞熒光強(qiáng)度的影響Fig.6 Effect of lamp current on mercury fluorescence intensity

由圖6可以發(fā)現(xiàn)，汞的熒光強(qiáng)度隨著燈電流的增大而不斷增大，但是較大的燈電流會(huì)減少高強(qiáng)度空心陰極燈的壽命，因此，通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果綜合判斷，燈電流在15 mA時(shí)已經(jīng)可以滿足正常測(cè)定需求。

2.5.4 負(fù)高壓的優(yōu)化

負(fù)高壓增加，會(huì)使噪聲加大，同時(shí)信號(hào)也會(huì)增加。在優(yōu)選負(fù)高壓的過(guò)程中，不同負(fù)高壓對(duì)Hg熒光強(qiáng)度的影響見(jiàn)圖7。

圖7 負(fù)高壓對(duì)汞熒光強(qiáng)度的影響Fig.7 Influence of negative high pressure on mercury fluorescence intensity

通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果綜合判斷，負(fù)高壓在220 V時(shí)已經(jīng)可以滿足正常測(cè)定需求。

2.6 精密度與檢出限

配制質(zhì)量濃度為 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ng/mL 的無(wú)機(jī)汞標(biāo)液，按照試驗(yàn)方法在儀器最佳條件下考察其線性范圍，在0～1 ng/mL范圍內(nèi)，無(wú)機(jī)汞標(biāo)液回歸方程為y=2416.9x+5.3，相關(guān)系數(shù)r=0.999 7。按照試驗(yàn)方法測(cè)得本法的檢出限為（n=11）0.014 0 ng/mL，對(duì)螃蟹組織樣品連續(xù)測(cè)定7次，求得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.2%。

2.7 回收率

加標(biāo)回收測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加標(biāo)回收測(cè)定結(jié)果（n=6）Table 2 Test results of spiked recovery（n=6）

在螃蟹體肉組織和花甲體肉組織的提取液中加入不同量的有機(jī)汞標(biāo)準(zhǔn)溶液，放置大約30 min，隨后按照樣品分析步驟進(jìn)行分析測(cè)定。得到了各樣品的加標(biāo)回收率在86%～101%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.5%～6.2%之間。

2.8 樣品分析

采用建立的方法隨機(jī)對(duì)市售不同水產(chǎn)品的各個(gè)部位的無(wú)機(jī)汞和總汞進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 螃蟹中有機(jī)汞和無(wú)機(jī)汞的含量結(jié)果（n=3）Table 3 Results of the content of organic and inorganic mercury in crabs（n=3）

通過(guò)對(duì)實(shí)際樣品的分析，發(fā)現(xiàn)在螃蟹樣品中汞主要以有機(jī)汞形式存在，其中蟹足肉、螃蟹體肉、花甲肉、蝦肉的有機(jī)汞含量相對(duì)較高，所有水產(chǎn)品中各個(gè)部位的含量均未超過(guò)GB 2762—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》中水產(chǎn)生物及其制品中甲基汞的限量（0.5 mg/kg）。

3 結(jié)論

本文對(duì)微型氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法檢測(cè)水產(chǎn)品中汞形態(tài)的幾個(gè)影響因素進(jìn)行了優(yōu)化和討論，并在最優(yōu)的條件下對(duì)蝦、蟹、花甲等各個(gè)部位進(jìn)行了測(cè)定，驗(yàn)證了該方法的有效性。試驗(yàn)結(jié)果表明，以溴化劑作為氧化劑，建立的微型氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法測(cè)定水產(chǎn)品中有機(jī)汞的方法是準(zhǔn)確可行的。它具有簡(jiǎn)單、無(wú)色譜、低成本和高靈敏度的特點(diǎn)。基于不同汞形態(tài)不同化學(xué)的非色譜方法為汞形態(tài)分析開(kāi)辟了另一條途徑。適用于水產(chǎn)品中有機(jī)汞的準(zhǔn)確測(cè)定。