應(yīng)用Illumina Miseq測序技術(shù)分析傳統(tǒng)酸馬奶細(xì)菌多樣性

宋凱

（徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥品食品學(xué)院，江蘇 徐州 221006）

乳制品是全世界共認(rèn)的高營養(yǎng)食品，千百年來成為人民喜愛的食品，同時也為不同的外源微生物提供了理想的繁殖生境，形成了復(fù)雜多樣的微生物群落，促進(jìn)了發(fā)酵乳制品的形成[1-2]。酸馬奶是其中一種非常著名的發(fā)酵乳制品，其以馬奶為原材料與發(fā)酵劑混合，在開放的環(huán)境中自然發(fā)酵2 d～3 d即可，且具有略帶酸味、沁人心脾、清爽適口等特性[3]。此外，由于酸馬奶含有豐富的微生物資源及營養(yǎng)，使其對結(jié)核病為主的傳染性疾病、消化系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病等均有明顯的輔助治療作用[4-5]。但是，酸馬奶的這些治療作用與其化學(xué)成分和菌群結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。酸馬奶的品質(zhì)不僅取決于原料的差異，也與其微生物組成有密切關(guān)系。菌群結(jié)構(gòu)容易受到地理和氣候條件變化的影響，同時也受溫度和發(fā)酵時間變化的影響。這些因素的差異導(dǎo)致了不同地區(qū)酸馬奶的化學(xué)成分、菌群結(jié)構(gòu)和風(fēng)味的差異[6]。因此，了解傳統(tǒng)酸馬奶的微生物多樣性至關(guān)重要。

以往對酸馬奶微生物多樣性的研究多采用傳統(tǒng)分離鑒定方法，發(fā)現(xiàn)酸馬奶中的主要微生物是乳酸菌和酵母菌，其對風(fēng)味、酸度和口感特別重要[5，7]。鑒于一些微生物具有不可培養(yǎng)的特性，傳統(tǒng)分離鑒定方法會嚴(yán)重低估微生物多樣性。近年來，16S rRNA高通量測序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)釀造食品中復(fù)雜微生物群落的研究，高通量測序不僅具有高通量、高覆蓋、高準(zhǔn)確率等特點(diǎn)，還可以全面地揭示樣本微生物群落的組成及多樣性等信息[8-9]。為了解傳統(tǒng)酸馬奶中細(xì)菌群落多樣性，本研究利用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)解析傳統(tǒng)酸馬奶的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及組成，為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)及篩選潛在價值的益生菌提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸馬奶：取自新疆塔城和豐縣5個不同農(nóng)場生產(chǎn)的樣品（命名為 C1、C2、C3、C4、C5）和周邊 5 戶牧民手工釀造的樣品（命名為 M1、M2、M3、M4、M5），取樣后立即裝入采樣管中封口，用液氮冷凍后帶回實(shí)驗(yàn)室置于-80℃儲存，以備后續(xù)試驗(yàn)。

FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒：美國 MP Biomedicals公司；Truseq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit試劑盒、Illumina Miseq PE250型測序儀：美國Illumina公司；Agencourt AMPure XP核酸純化磁珠：美國Beckman Coulter公司；細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū) PCR 擴(kuò)增引物（338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和 806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）：北京諾禾致源公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Illumina Miseq PE250型測序儀：美國Illumina公司；S1000型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR） 儀、CFX96 型熒光定量 PCR 儀、Gel DocTMXR+型凝膠成像系統(tǒng)、低溫冷凍離心機(jī)：美國Bio Rad公司；DYY-8C型水平電泳槽：北京六一儀器廠；VORTEX-3型旋渦混勻器：德國IKA公司；NaneDrop 2000型超微量分光光度計(jì)：美國Thermo公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酸馬奶DNA提取及PCR建庫

利用FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒提取酸馬奶樣本中微生物的基因組DNA。使用NaneDrop 2000型超微量分光光度計(jì)測定其溶度和純度。將合格的DNA用引物338F和806R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系（20 μL）：模板 DNA 10 ng，正向及反向引物各10 pmol，2×高保真 DNA聚合酶混合物10 μL。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性2 min；94℃變性20 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共進(jìn)行25個循環(huán)；最后72℃延伸10 min[10]。擴(kuò)增產(chǎn)物使用2%的瓊脂凝膠進(jìn)行電泳檢測。加入等體積的Agencourt AMpure XP核酸純化磁珠對產(chǎn)物進(jìn)行純化。利用Truseq?DNA PCR-Free建庫試劑盒制備測序文庫并添加接頭序列，經(jīng)Nane－Drop 2000確定文庫質(zhì)量，使用Illumina Miseq PE250測序平臺進(jìn)行高通量測序。

1.3.2 生物信息學(xué)分析

采用FLASH軟件[11]對測序的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，利用QIIME軟件[12]對低質(zhì)量的拼接序列進(jìn)行過濾，使用UCHIME軟件[13]去除嵌合體，得到優(yōu)質(zhì)序列。根據(jù)UCLUST軟件[14]在相似性97%的水平上對優(yōu)質(zhì)序列進(jìn)行聚類，得到各可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），以各OTU中豐度最高的序列作為代表序列。在80%置信水平下，通過Silva 132數(shù)據(jù)庫[15]對OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋，將藍(lán)藻門和不能注釋到門水平的OTU刪除?；贠TU得到分析結(jié)果，采用隨機(jī)抽平的方法，利用QIIME軟件[12]對樣品進(jìn)行多樣性分析?；贠TU的主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）、樣本聚類分析、箱線圖繪制、熱圖繪制、火山圖繪制均通過R軟件實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本測序數(shù)據(jù)處理結(jié)果

傳統(tǒng)酸馬奶樣本測序數(shù)據(jù)處理結(jié)果統(tǒng)計(jì)見表1。

表1 傳統(tǒng)酸馬奶樣本測序數(shù)據(jù)處理結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of sequencing data processing results in traditional koumiss

續(xù)表1 傳統(tǒng)酸馬奶樣本測序數(shù)據(jù)處理結(jié)果統(tǒng)計(jì)Continue table 1 Statistics of sequencing data processing results in traditional koumiss

根據(jù)表1可知，10份酸馬奶樣品共檢出429 155條原始序列，通過相關(guān)軟件過濾后最終得到331 327條有效序列。去除條形碼（barcode）和引物后，10份酸馬奶樣品的平均堿基長度均在450 bp以上，且GC含量為54.49%。此外，酸馬奶樣品的Q30值均高于90%，說明測序數(shù)據(jù)可靠且質(zhì)量較好。

稀疏性曲線是判定樣本的取樣大小是否合理及確定測序深度是否可以覆蓋整個微生物體系。酸馬奶樣品細(xì)菌群落的稀疏性曲線見圖1。

圖1 酸馬奶樣品細(xì)菌群落的稀疏性曲線Fig.1 Rarefaction curves of bacterial communities in traditional koumiss

由圖1可知，隨著測序深度的增加，被檢測發(fā)現(xiàn)的OTU呈先迅速增加，隨后平穩(wěn)增加。當(dāng)測序深度＞25000時，酸馬奶樣品中能檢測到新OTU數(shù)量越來越少。這些結(jié)果表明雖然通過增加測序深度可以識別一些新的微生物，但在分析中已捕獲了樣品的大多數(shù)微生物，進(jìn)一步說明Illumina Miseq高通量測序技術(shù)可有助于全面了解酸馬奶的細(xì)菌多樣性。

2.2 細(xì)菌群落的多樣性分析

在97%的相似度閾值下，對331 327條有效序列進(jìn)行聚類分析，根據(jù)QIIME軟件進(jìn)行OTU劃分，并根據(jù)得到OTU進(jìn)行α-多樣性分析。酸馬奶樣品細(xì)菌Alpha多樣性結(jié)果統(tǒng)計(jì)見表2。

表2 酸馬奶樣品細(xì)菌Alpha多樣性結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of α-diversity results of bacteria in traditional koumiss

由表2可知，通過OTU聚類后可得到1 083個OTU，OTU平均為 175個/樣本～265個/樣本，其中農(nóng)場生產(chǎn)樣品的平均OTU數(shù)量為217個/樣本，而牧民手工釀造樣品的平均OTU數(shù)量為225個/樣本，兩者之間沒有顯著差異。Chao1指數(shù)是反映物種豐富度的指標(biāo)，它通過觀測到的結(jié)果推算出一個理論的豐富度，而這個豐富度更接近真實(shí)的豐富度，通常能觀測到的物種豐富度肯定會比實(shí)際少。根據(jù)表2可知，10份酸馬奶樣品所檢測到OTU數(shù)與Chao1指數(shù)的差異均不超過20，從而進(jìn)一步說明當(dāng)前測序深度是可以基本覆蓋整個酸馬奶樣品的微生物體系。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)是評價群落多樣性和均勻度的常用指數(shù)。農(nóng)場生產(chǎn)的5份酸馬奶樣品的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分別在1.4～1.89和0.49～0.55之間，其平均值分別為1.57和0.51；而牧民手工釀造的5份酸馬奶樣品的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分別在1.34～1.99和0.5～0.6之間，其平均值分別為1.78和0.57。牧民手工釀造的樣品中Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)要顯著高于農(nóng)場生產(chǎn)的樣品（P＜0.05），表明酸馬奶的細(xì)菌多樣性會受到地理和發(fā)酵器具的影響[16]。

為了更好地了解不同地域生產(chǎn)酸馬奶的微生物結(jié)構(gòu)的變化，采用主坐標(biāo)分析法和非加權(quán)配對算術(shù)平均（unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA）聚類法進(jìn)行微生物群落多樣性研究。酸馬奶樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主坐標(biāo)分析和非加權(quán)配對算術(shù)平均聚類分析見圖2。

圖2 酸馬奶樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主坐標(biāo)分析和非加權(quán)配對算術(shù)平均聚類分析Fig.2 PCoA and UPGMA clustering analysis of bacterial communities in traditional koumiss

如圖2A所示，PCoA的第一主坐標(biāo)和第二主坐標(biāo)分別占總變異的93.01%和4.39%。農(nóng)場生產(chǎn)的樣品可明顯聚集在一起，位于PCoA圖的左上方，而牧民手工釀造的樣品也可聚集在一起，位于PCoA圖的右側(cè)，表明兩者的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異。此結(jié)果與UPGMA聚類分析結(jié)果（圖2B）相一致，表明不同來源的酸馬奶的微生物組成易受到當(dāng)?shù)丨h(huán)境因素的影響。

2.3 細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)分析

在劃分OTU后，挑選不同OTU中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列，隨后與微生物參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行97%相似性比對分析，從而對酸馬奶樣品測序得到的每個OTU進(jìn)行分類學(xué)鑒定。在分類學(xué)門水平揭示酸馬奶樣品細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)差異。酸馬奶樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在門水平的分布見圖3。

圖3 酸馬奶樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在門水平的分布Fig.3 Distribution of bacterial communities at phylum level in traditional koumiss

如圖3所示，酸馬奶樣品的細(xì)菌群落分別來自厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、異常球菌—棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）和擬桿菌門（Bacteroidetes）。其中厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）占整個測序序列的99%左右。這與BAO等[17]的研究結(jié)構(gòu)相一致，說明這些門水平的微生物決定酸馬奶的成熟。此外，厚壁菌門在酸馬奶中相對豐度可達(dá)80.19%～97.65%，說明這些來自厚壁菌門的微生物具有厭氧、耐酸和分解蛋白等特性。

為了進(jìn)一步準(zhǔn)確揭示酸馬奶細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)，故從分類學(xué)的屬水平探究其組成，并揭曉不同來源樣品的差異。酸馬奶樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在屬水平的分布見圖4。

圖4 酸馬奶樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在屬水平的組成和主要乳酸菌及醋酸菌的差異Fig.4 Composition of bacterial communities at genus level in traditional koumiss and the difference of main lactic acid bacteria and acetic acid bacteria

如圖4A所示，共鑒定出78個屬，其中所有樣品中平均相對豐度＞1%的屬有6個，分別為乳桿菌屬（Lactobacillus）（47.87%）、鏈球菌屬（Streptococcus）（26.88%）、乳球菌屬（Lactococcus）（4.16%）、醋桿菌屬（Acetobacter）（3.7%）、明串珠菌屬（Leuconostoc）（1.56%）和腸桿菌屬（Enterobacter）（1.09%）。這些乳酸菌的豐富度促使厚壁菌門在酸馬奶中具有顯著優(yōu)勢。乳酸菌可能來源于發(fā)酵原料和自然環(huán)境，其可將原料中的小分子糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為酸類化合物，從而賦予酸馬奶柔和的酸感；部分糖類物質(zhì)被轉(zhuǎn)化為醇類化合物，這些醇類物質(zhì)和酸類代謝物反應(yīng)形成酯類物質(zhì)，進(jìn)而賦予產(chǎn)品具有酯香和醇香等特征[18]。此外，乳酸菌可通過蛋白水解系統(tǒng)分解發(fā)酵基質(zhì)中的可溶性蛋白形成短肽和氨基酸等小分子代謝產(chǎn)物，賦予酸馬奶獨(dú)特的鮮味特征[18]。眾所周知，乳桿菌屬在發(fā)酵乳制品中起著重要作用[19]。根據(jù)圖4A可知，乳桿菌屬是絕對優(yōu)勢屬，所有酸馬奶樣品均以乳桿菌屬為主，其中占每個樣品細(xì)菌總數(shù)的41.20%～55.82%。不同來源的酸馬奶樣品中乳桿菌屬的相對豐度存在明顯差異，其中農(nóng)場生產(chǎn)酸馬奶樣品中乳桿菌屬的平均相對豐度為42.2%，顯著低于（P＜0.01）牧民手工釀造酸馬奶樣品中乳桿菌屬的平均相對豐度（53.55%）（圖4B）。上述結(jié)果與TANG等[20]的研究結(jié)果相一致，證實(shí)了乳桿菌屬廣泛存在酸馬奶中，且在不同地域來源酸馬奶樣品之間存在差異。此外，鏈球菌屬在酸馬奶樣品中相對豐度僅次于乳桿菌屬，其占每個樣品細(xì)菌總數(shù)的16.49%～39.76%，不同樣品之間差異明顯。農(nóng)場生產(chǎn)酸馬奶樣品中鏈球菌屬的平均相對豐度為36.07%，顯著高于（P＜0.01）牧民手工釀造酸馬奶樣品中乳桿菌屬的平均相對豐度（17.69%）（圖4B），表明鏈球菌屬和乳桿菌屬在酸馬奶發(fā)酵體系中可能存在互利共生的關(guān)系。這個與丁秀云[21]的研究結(jié)果相一致，此研究還發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌組合發(fā)酵可增加胞外多糖的含量。如圖4B所示，醋桿菌屬和乳球菌屬的相對豐度在不同地域來源酸馬奶樣品中差異較大，其在農(nóng)場生產(chǎn)酸馬奶樣品的平均相對豐度分別為6.42%和0.42%，而在牧民手工釀造酸馬奶樣品的平均相對豐度分別0.98%和7.9%。相比牧民手工釀造酸馬奶樣品，農(nóng)場生產(chǎn)酸馬奶樣品中醋桿菌屬的平均相對豐度提高了5.5倍（P＜0.001），但乳球菌屬的平均相對豐度卻降低了95%（P＜0.01）。醋桿菌屬是食醋和果醋中的一種重要微生物，由于其可產(chǎn)生乙醇脫氫酶，能夠?qū)⒔湍府a(chǎn)生的酒精轉(zhuǎn)化為乙酸[22]，也能在酸馬奶中被檢測到[17]。YIN等[23]發(fā)現(xiàn)添加谷氨酸可以增加醋桿菌屬細(xì)胞生長及可培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)。正是由于乳酸菌將原料中蛋白分解為短肽和氨基酸，從而促進(jìn)醋桿菌的生長繁殖。乳球菌也被認(rèn)為是一種重要的乳制品微生物，其可將多余的糖轉(zhuǎn)化為甘露醇和葡聚糖，而這兩種物質(zhì)非常適合乳酸菌的發(fā)酵。上述結(jié)果表明不同地域采集的不同樣品中細(xì)菌屬及相對豐度含量存在顯著差異，與GESUDU等[24]的研究結(jié)果相一致。根據(jù)傳統(tǒng)酸馬奶發(fā)酵工藝的總體情況，分析得出：（1）自制發(fā)酵劑、馬奶原料、發(fā)酵環(huán)境和器具中的微生物是酸馬奶微生物體系的來源；（2）酸馬奶的品質(zhì)和生產(chǎn)的工藝參數(shù)（如溫度、發(fā)酵時間、攪拌強(qiáng)度等）可能會影響不同地區(qū)的酸馬奶中細(xì)菌群落的變化。

2.4 差異微生物的分析

差異表達(dá)分析是比較兩組不同樣品基于表達(dá)異同的基本方法，可獲得一組樣品相對于另一組樣品表達(dá)顯著上調(diào)和下調(diào)，從而進(jìn)一步研究這些差異表達(dá)基因的功能，多用芯片和轉(zhuǎn)錄組測序，但也可用于16S rRNA高通量測序技術(shù)探究不同類型樣品之間微生物的差異，從而揭示其差異的原因。兩組不同樣品的差異微生物結(jié)果見圖5。

圖5 火山圖顯示了兩個不同環(huán)境來源酸馬奶樣品出現(xiàn)不同程度的OTU富集Fig.5 Volcano plot showing differentially abundant OTUs enriched in traditional koumiss from two different places

由圖5可知，共發(fā)現(xiàn)16個差異顯著的OTU，其中6個OTU可顯著在農(nóng)場生產(chǎn)酸馬奶樣品中富集 [2個來自鏈球菌屬、2個來自醋桿菌屬、1個來自乳桿菌屬、1個來自羅斯氏菌屬（Rothia）]，而剩下10個差異顯著的OTU則顯著在牧民手工釀造酸馬奶樣品中富集[1個來自腸桿菌屬、1個來自腸球菌屬（Enterococcus）、1個來自微小桿菌屬（Exiguobacterium）、2個來自乳桿菌屬、2個來自乳球菌屬、1個來自明串珠菌屬（Leuconostoc）、1個來自假單胞菌屬、1個來自棲熱菌屬（Thermus）]。上述結(jié)果說明牧民手工釀造的酸馬奶具有較高的細(xì)菌多樣性，這也與表2的結(jié)果相一致。

3 結(jié)論

本研究利用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)探究了兩個不同來源酸馬奶樣品細(xì)菌群落的多樣性及其組成。研究發(fā)現(xiàn)牧民手工釀造的樣品中Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)要顯著高于農(nóng)場生產(chǎn)的樣品（P＜0.05），且兩者的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異。厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）是主要優(yōu)勢菌門，兩者相對豐度之和可達(dá)98%。在屬水平上，乳桿菌屬、乳球菌屬、醋桿菌屬、明串珠菌屬和腸桿菌屬是酸馬奶樣品的優(yōu)勢菌屬，尤其是乳桿菌屬的相對豐度可達(dá)41.20%～55.82%。農(nóng)場生產(chǎn)酸馬奶樣品中鏈球菌屬和醋桿菌屬的相對豐度含量要顯著高于（P＜0.01）牧民手工釀造酸馬奶樣品。此外，通過差異分析發(fā)現(xiàn)兩個不同來源酸馬奶樣品中有16個OTU存在顯著差異，這些OTU中絕大部分都來自乳酸菌。這些結(jié)果有助于了解環(huán)境異質(zhì)性對傳統(tǒng)酸馬奶細(xì)菌群落的影響，但本研究是在同一個城市采集的樣品，未來可進(jìn)一步探究酸馬奶微生物多樣性的生物地理分布模式。綜上所述，本研究全面了解傳統(tǒng)酸馬奶的細(xì)菌種群分布，為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)及篩選潛在價值的益生菌提供數(shù)據(jù)參考。